采用HPLC-UV-ELSD法检测复方丹参片的方法

摘要

本发明公开了一种采用HPLC‑UV‑ELSD法检测复方丹参片的方法，采用液相色谱梯度洗脱、切换检测波长和紫外检测器串联蒸发光散射检测器的检测方法，对复方丹参片中丹参与三七的特征图谱进行研究。本发明能够对复方丹参片进行全信息的控制，简化了检验过程，节约了分析时间，可用于复方丹参片质量控制及综合评价。

说明书

技术领域

本发明涉及中医药检测技术领域，具体是采用HPLC-UV-ELSD法检测复方丹参片的方法。

背景技术

复方丹参片由丹参、三七和冰片组成，具有活血化瘀、理气止痛之功效，是临床治疗冠心病、胸闷和心绞痛的常用中药处方。研究表明，丹参的活性成分主要为二萜醌类脂溶性及丹参酚酸类水溶性成分，具有抗氧化、抗动脉粥样硬化、降低心肌耗氧量等心血管作用及抗肿瘤作用；三七皂苷具有扩张血管、降低心肌耗氧量、抑制血小板凝集、延长凝血时间、降血脂、清除自由基、抗炎、抗氧化等药理作用。其现行标准为《中国药典》2015年版一部，收载了三七的显微鉴别；薄层鉴别项分别为以丹参酮Ⅱ_A、三七皂苷R₁、人参皂苷Rb₁、人参皂苷Rg₁和人参皂苷Re为对照品，并以冰片和三七为对照药材，鉴别处方中丹参、三七和冰片三味药材；含量测定部分则对丹参的脂溶性成分丹参酮Ⅱ、水溶性成分丹酚酸B以及三七皂苷类成分进行测定。该质量标准不仅检验过程重复繁琐，而且不能全面反映本品在制备过程中成分的变化。研究报道已知的丹参二萜醌类脂溶性成分如二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮和丹参酮Ⅰ，酚酸类水溶性成分如丹参素、原儿茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B等，三七皂苷类成分如人参皂苷Rd，均未能进行评价。

发明内容

基于此，本发明提供了一种采用HPLC-UV-ELSD法测定复方丹参片的方法，采用液相色谱梯度洗脱、切换检测波长和紫外检测器串联蒸发光散射检测器的检测方法，同时对复方丹参片中丹参与三七的特征图谱进行研究。本发明能够对复方丹参片进行全信息的控制，简化了检验过程，节约了分析时间。

为实现上述技术目的，具体内容如下：

1 、仪器、试剂与样品

（1）仪器：Waters 2695高效液相色谱仪，2487紫外检测器—ALLtech 2000ES蒸发光散射检测器检测；MILLI-PROA纯水处理器；

（2）试剂：丹参素钠对照品（中国食品药品检定研究院提供，批号110855-200508，供含量测定用)、原儿茶醛对照品（中国食品药品检定研究院提供，批号110810-200506，供含量测定用)、迷迭香酸对照品（中国食品药品检定研究院提供，批号111871-201203，供含量测定用，含量以98.8%计)、丹酚酸B对照品（中国食品药品检定研究院提供，批号111562-201212，供含量测定用，含量以95.4%计)、二氢丹参酮Ⅰ对照品（中国食品药品检定研究院提供，批号0868-200103，鉴别用)、隐丹参酮对照品（中国食品药品检定研究院提供，批号110852-200808，供含量测定用，含量以98.7%计)、丹参酮Ⅰ对照品（中国食品药品检定研究院提供，批号110867-200406，鉴别用)、丹参酮Ⅱ_A对照品（中国食品药品检定研究院提供，批号110766-200315，供含量测定用)、三七皂苷R₁对照品（中国食品药品检定研究院提供，批号110745-200617，供含量测定用)、人参皂苷Rg₁对照品（中国食品药品检定研究院提供，批号110703-201128，供含量测定用，含量以93.4%计)、人参皂苷Re对照品（中国食品药品检定研究院提供，批号110754-200822，供含量测定用，含量以88.8%计)、人参皂苷Rb₁对照品（中国食品药品检定研究院提供，批号110704-201122，供含量测定用，含量以92.9%计)、人参皂苷Rd（中国食品药品检定研究院提供，批号110704-201122，供含量测定用，含量以92.9%计)。乙腈为色谱纯，水为高纯水，其它试剂均为分析纯；

（3）样品：复方丹参片由广州白云山和记黄埔中药有限公司生产，批号：E3A030。

2、检测方法如下：

（1）色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.1%三氟乙酸溶液为流动相B，按表1的规定进行梯度洗脱；检测波长按表1的规定设定，皂苷用蒸发光散射检测器检测。理论板数按丹酚酸B峰计算应不低于30000，按丹参酮ⅡA峰计算应不低于1000000，按人参皂苷Rg1峰计算应不低于50000；

表1 梯度洗脱表

（2）对照品溶液的制备：取丹参素钠对照品适量，精密称定，加水制成每1mL含100μg的溶液，另取原儿茶醛对照品、迷迭香酸对照品、丹酚酸B对照品、二氢丹参酮Ⅰ对照品、隐丹参酮对照品、丹参酮Ⅰ对照品、丹参酮ⅡA对照品、三七皂苷R1对照品、人参皂苷Rg1对照品、人参皂苷Re对照品、人参皂苷Rb1对照品、人参皂苷Rd对照品适量，加甲醇制成每1mL含原儿茶醛、迷迭香酸、二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA各20μg，丹酚酸B、三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd 各50μg的混合溶液；

（3）供试品溶液的制备：取样品10片，除去包衣，精密称定，研细，取约0.9g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇25mL，密塞，称定重量，超声处理（功率400W，频率40KHz）30分钟，放冷，再称定重量，用70%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；

（4）耐用性考察：

1）不同色谱柱的考察：在同一台Waters高效液相色谱仪，分别使用不同的色谱柱进行检测；

2）不同仪器的考察：用同一柱子分别在不同品牌仪器上进行检测；

（5）测定：分别精密吸取上述对照品溶液和供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定；

（6）进行方法学验证：分别进行稳定性、精密度、重复性和专属性试验。

本发明的有益效果是：

本发明将现行标准中的薄层鉴别与含量测定相结合，采用液相色谱梯度洗脱、切换检测波长和紫外检测器串联蒸发光散射检测器的检测方法，对复方丹参片中丹参与三七的特征图谱进行研究。本发明能够对复方丹参片进行全信息的控制，简化检验过程，节约分析时间，可用于复方丹参片质量控制及综合评价。

采取二极管阵列检测器检测对丹参各成分进行测定，结果表明：水溶性成分丹参素钠、原儿茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B在280 nm波长附近均有最大吸收，在50min之前均洗脱出来；脂溶性成分二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA在270 nm波长附近均有最大吸收，而在70min之后才洗脱出来。本发明采取紫外波长切换法测定丹参水溶性和脂溶性成分，可以同时测定多种成分且可保证各成分有最大的响应值。而三七中皂苷类成分在紫外区仅有末端吸收，本发明采用蒸发光散射检测器测定复方丹参片中三七的成分，蒸发光散射检测器基线噪音小，不受梯度影响，对三七中的皂苷类成分有较好的响应。本发明以乙腈-0.1%三氟乙酸溶液系统作为流动相，检测时能获得较好的色谱效果。本发明采用超声提取方法提取复方丹参片中有效成分，可克服丹酚酸B受热易分解的性质造成的不利影响。

附图说明

图1为使用柱Ⅰ：TechMate C18-ST (5μm，4.6×250mm)，仪器：Waters 2695高效液相色谱仪，2487紫外检测器—ALLtech 2000ES蒸发光散射检测器检测复方丹参片（广州白云山和记黄埔中药有限公司，批号：E3A030）的UV特征图谱；

图2为使用柱Ⅰ：TechMate C18-ST (5μm，4.6×250mm)，仪器：Waters 2695高效液相色谱仪，2487紫外检测器—ALLtech 2000ES蒸发光散射检测器检测复方丹参片（广州白云山和记黄埔中药有限公司，批号：E3A030）的ELSD特征图谱；

图3为使用柱Ⅱ：CAPCELLPAK C18( 5μm，4.6×250mm)，仪器：Waters 2695高效液相色谱仪，2487紫外检测器—ALLtech 2000ES蒸发光散射检测器检测复方丹参片（广州白云山和记黄埔中药有限公司，批号：E3A030）的UV特征图谱；

图4为使用柱Ⅱ：CAPCELLPAK C18( 5μm，4.6×250mm)，仪器：Waters 2695高效液相色谱仪，2487紫外检测器—ALLtech 2000ES蒸发光散射检测器检测复方丹参片（广州白云山和记黄埔中药有限公司，批号：E3A030）的ELSD特征图谱；

图5为使用柱Ⅲ：Kromasil C18( 5μm，4.6×250mm)，仪器：Waters 2695高效液相色谱仪，2487紫外检测器—ALLtech 2000ES蒸发光散射检测器检测复方丹参片（广州白云山和记黄埔中药有限公司，批号：E3A030）的UV特征图谱；

图6为使用柱Ⅲ：Kromasil C18( 5μm，4.6×250mm)，仪器：Waters 2695高效液相色谱仪，2487紫外检测器—ALLtech 2000ES蒸发光散射检测器检测复方丹参片（广州白云山和记黄埔中药有限公司，批号：E3A030）的ELSD特征图谱；

图7为使用柱Ⅳ：Inertsil ODS-3( 5μm，4.6×250mm)，仪器：Waters 2695高效液相色谱仪，2487紫外检测器—ALLtech 2000ES蒸发光散射检测器检测复方丹参片（广州白云山和记黄埔中药有限公司，批号：E3A030）的UV特征图谱；

图8为使用柱Ⅳ：Inertsil ODS-3( 5μm，4.6×250mm)，仪器：Waters 2695高效液相色谱仪，2487紫外检测器—ALLtech 2000ES蒸发光散射检测器检测复方丹参片（广州白云山和记黄埔中药有限公司，批号：E3A030）的ELSD特征图谱；

图9为使用色谱柱Ⅱ：CAPCELLPAK C18( 5μm，4.6×250mm)，仪器Ⅱ：高效液相色谱仪Agilent 1260，蒸发光散色仪Agilent 380-ELSD蒸发光散射检测器检测复方丹参片（广州白云山和记黄埔中药有限公司，批号：E3A030）的UV特征图谱；

图10为使用色谱柱Ⅱ：CAPCELLPAK C18( 5μm，4.6×250mm)，仪器Ⅱ：高效液相色谱仪Agilent 1260，蒸发光散色仪Agilent 380-ELSD蒸发光散射检测器检测复方丹参片（广州白云山和记黄埔中药有限公司，批号：E3A030）的ELSD特征图谱；

图11为复方丹参片（杭州胡庆余堂药业有限公司，批号：100928）的UV特征图谱；图中峰1：丹参素钠，峰2：原儿茶醛，峰3：迷迭香酸，峰4：丹酚酸B，峰5：二氢丹参酮Ⅰ 峰6：隐丹参酮，峰7：丹参酮Ⅰ，峰8：丹参酮ⅡA；

图12为复方丹参片（杭州胡庆余堂药业有限公司，批号：100928）的ELSD特征图谱；图中峰9：三七皂苷R1，峰10：人参皂苷Rg1，峰11：人参皂苷Re，峰12：人参皂苷Rb1，峰13：人参皂苷Rd；

图13为复方丹参片（北京同仁堂科技发展股份有限公司制药厂，批号：1125531）的UV特征图谱；图中峰1：丹参素钠，峰2：原儿茶醛，峰3：迷迭香酸，峰4：丹酚酸B，峰5：二氢丹参酮Ⅰ峰6：隐丹参酮，峰7：丹参酮Ⅰ，峰8：丹参酮ⅡA；

图14为复方丹参片（北京同仁堂科技发展股份有限公司制药厂，批号：1125531）的ELSD特征图谱；图中峰9：三七皂苷R1，峰10：人参皂苷Rg1，峰11：人参皂苷Re，峰12：人参皂苷Rb1，峰13：人参皂苷Rd；

图15为复方丹参片（上海雷允上药业有限公司，批号：100523）的UV特征图谱；图中峰1：丹参素钠，峰2：原儿茶醛，峰3：迷迭香酸，峰4：丹酚酸B，峰5：二氢丹参酮Ⅰ 峰6：隐丹参酮，峰7：丹参酮Ⅰ，峰8：丹参酮ⅡA；

图16为复方丹参片（上海雷允上药业有限公司，批号：100523）的ELSD特征图谱；图中峰9：三七皂苷R1，峰10：人参皂苷Rg1，峰11：人参皂苷Re，峰12：人参皂苷Rb1，峰13：人参皂苷Rd；

图17为缺丹参阴性对照UV色谱图；

图18为缺三七阴性对照ELSD色谱图。

具体实施方式

为了更加详细的介绍本发明，下面结合实施例，对本发明做进一步说明。

实施例，内容如下：

1 、仪器、试剂与样品：

（1）仪器：Waters 2695高效液相色谱仪，2487紫外检测器—ALLtech 2000ES蒸发光散射检测器检测；MILLI-PROA纯水处理器；

（2）试剂：丹参素钠对照品（中国食品药品检定研究院提供，批号110855-200508，供含量测定用)、原儿茶醛对照品（中国食品药品检定研究院提供，批号110810-200506，供含量测定用)、迷迭香酸对照品（中国食品药品检定研究院提供，批号111871-201203，供含量测定用，含量以98.8%计)、丹酚酸B对照品（中国食品药品检定研究院提供，批号111562-201212，供含量测定用，含量以95.4%计)、二氢丹参酮Ⅰ对照品（中国食品药品检定研究院提供，批号0868-200103，鉴别用)、隐丹参酮对照品（中国食品药品检定研究院提供，批号110852-200808，供含量测定用，含量以98.7%计)、丹参酮Ⅰ对照品（中国食品药品检定研究院提供，批号110867-200406，鉴别用)、丹参酮Ⅱ_A对照品（中国食品药品检定研究院提供，批号110766-200315，供含量测定用)、三七皂苷R₁对照品（中国食品药品检定研究院提供，批号110745-200617，供含量测定用)、人参皂苷Rg₁对照品（中国食品药品检定研究院提供，批号110703-201128，供含量测定用，含量以93.4%计)、人参皂苷Re对照品（中国食品药品检定研究院提供，批号110754-200822，供含量测定用，含量以88.8%计)、人参皂苷Rb₁对照品（中国食品药品检定研究院提供，批号110704-201122，供含量测定用，含量以92.9%计)、人参皂苷Rd（中国食品药品检定研究院提供，批号110704-201122，供含量测定用，含量以92.9%计)。乙腈为色谱纯，水为高纯水，其它试剂均为分析纯；

（3）样品：收集了10个企业生产的共18批复方丹参片。

2、检测方法如下：

（1）色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.1%三氟乙酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长按表1的规定设定，皂苷用蒸发光散射检测器检测。理论板数按丹酚酸B峰计算应不低于30000，按丹参酮ⅡA峰计算应不低于1000000，按人参皂苷Rg1峰计算应不低于50000。

表1 梯度洗脱表

（2）对照品溶液的制备：取丹参素钠对照品适量，精密称定，加水制成每1mL含100μg的溶液，另取原儿茶醛对照品、迷迭香酸对照品、丹酚酸B对照品、二氢丹参酮Ⅰ对照品、隐丹参酮对照品、丹参酮Ⅰ对照品、丹参酮ⅡA对照品、三七皂苷R1对照品、人参皂苷Rg1对照品、人参皂苷Re对照品、人参皂苷Rb1对照品、人参皂苷Rd对照品适量，加甲醇制成每1mL含原儿茶醛、迷迭香酸、二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA各20μg，丹酚酸B、三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd 各50μg的混合溶液。

（3）供试品溶液的制备：取样品10片，除去包衣，精密称定，研细，取约0.9g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇25mL，密塞，称定重量，超声处理（功率400W，频率40KHz）30分钟，放冷，再称定重量，用70%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

（4）耐用性考察：

1）不同色谱柱的考察：在同一台Waters高效液相色谱仪，考察4种色谱柱：柱Ⅰ.TechMate C18-ST (5μm，4.6×250mm)；柱Ⅱ.CAPCELLPAK C18( 5μm，4.6×250mm)；柱Ⅲ.KromasiL C18( 5μm，4.6×250mm)；柱Ⅳ.InertsiL ODS-3( 5μm，4.6×250mm)，结果均能检出13个色谱峰，且各成分峰均能达到良好的分离效果。见表2、3，图11～18。

表2 不同色谱柱考察保留时间一览表（UV特征图谱）

表3 不同色谱柱考察保留时间一览表（ELSD特征图谱）

2）不同仪器的考察：用同一柱子[色谱柱Ⅱ：CAPCELLPAK C18( 5μm，4.6×250mm)]分别在2种不同品牌仪器上考察，Ⅰ.高效液相色谱仪Waters 2695，蒸发光散色仪.ALLtech ELSD2000ES，Ⅱ.高效液相色谱仪AgiLent 1260，蒸发光散色仪AgiLent 380-ELSD，结果均能检出13个色谱峰，见表4～5，图3、4、9、10。

表4 不同仪器考察保留时间一览表（UV特征图谱）

表5 不同仪器考察保留时间一览表（ELSD特征图谱）

（5）测定：分别精密吸取上述对照品溶液和供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定。供试品色谱中应呈现与对照品溶液色谱峰保留时间相同的十三个色谱峰。分别测定了10个企业生产的18批复方丹参片，结果均检出13个特征峰，符合标准要求，见表6、7。

表6 18批样品试验结果（UV特征图谱保留时间）

表7 18批样品试验结果（ELSD特征图谱保留时间）

（6）方法学验证及结果：

1）稳定性试验：取同一份供试品溶液，间隔一段时间进样一次，考察样品溶液的稳定性。结果表明，供试品溶液室温下放置，在24小时内稳定，见表8、9。

表8 稳定性考察试验结果（UV特征图谱保留时间）

表9 稳定性考察试验结果（ELSD特征图谱保留时间）

2）精密度试验：取同一份供试品溶液，连续进样6次，考察仪器的精密度。结果表明本法的仪器精密度良好，见表10、11。

表10 精密度试验结果（UV特征图谱保留时间）

表11 精密度试验结果（ELSD特征图谱保留时间）

3）重复性试验：对同一批样品，按上述检测的方法平行测定10份，结果表明，本方法重复性良好，10个样品13个特征峰分离良好，各峰相对保留时间小于1.0%。试验结果表明，本法的重复性较好，符合要求，见表12、13。

表12 重复性试验结果（UV特征图谱保留时间）

表13 重复性试验结果（ELSD特征图谱保留时间）

4）专属性试验：分别取缺丹参和三七的阴性样品各0.9g，按上述供试品溶液制备方法依法制成缺丹参和三七的阴性对照溶液，进样测定。结果紫外色谱图中在与丹参8个对照色谱峰相应位置无色谱峰出现，在蒸发光色谱中与三七5个对照色谱峰相应位置无色谱峰出现，见图17和图18，说明阴性对照无干扰。