一种植物组织中马铃薯腐烂茎线虫的分离方法

摘要

本发明公开一种植物组织中马铃薯腐烂茎线虫的分离方法，将5ml 25％(W/V)Pluronic F‑127水溶液加到细胞培养板中，室温静置30min形成半固态凝胶；将发病薯块切成2‑4mm薄片，于培养板孔边缘浸入Pluronic凝胶中，静置2h，使茎线虫从植物组织中游出；用移液器沿培养板孔另一侧缓慢吸取含有茎线虫的Pluronic凝胶，装入2ml离心管，在4℃放置20min使凝胶溶解，后离心使线虫沉淀，弃上清，加入1ml灭菌水清洗茎线虫，离心、回收茎线虫，经3‑5次重复清洗、离心回收后即获得纯净的茎线虫悬浮液。该方法可显著提高茎线虫的分离效率及分离产物的纯净度，有效满足茎线虫病的研究工作需求。

说明书

技术领域

本发明涉及一种植物组织中寄生线虫的分离方法，具体涉及一种植物组织中马铃薯腐烂茎线虫的分离方法，属农业植物保护领域。

背景技术

马铃薯腐烂茎线虫(Ditylenchus destructorThorne)是世界范围内重要的农业害虫，其寄主范围包括100多种重要经济作物及杂草。在中国腐烂茎线虫主要为害甘薯，通常可造成甘薯减产20-50％，甚至绝收。此外，该线虫还可为害马铃薯、花生、大蒜、胡萝卜、人参等重要经济作物，现已成为众多研究项目的焦点。

获取充足、纯净的实验材料是开展相关研究的基础。目前通用的腐烂茎线虫分离方法主要为漏斗法和浅盘法，操作方法可简单表述为将一个筛盘和一个盛水盘套放在一起，在筛盘上放一层滤纸或面巾纸，用水淋湿。将发病的植物组织切碎后放在滤纸上，向底部盛水盘中加水，淹没植物组织即可，室温下放置24h。由于腐烂茎线虫具有亲水性，浸泡分离期间线虫会从植物组织中游出，再由于自身的重力作用，游出的线虫会逐渐沉降到容器底部，此时收集容器底部的浸泡液即得到线虫悬浮液。

上述方法的不足之处在于，首先游出的线虫需主动穿过滤纸或面巾纸才能到达容器底部，大大降低了茎线虫回收效率。其次，长时间浸泡会导致滤纸或面巾纸破损，纸的残渣和植物组织都会混入线虫悬浮液，很难获得洁净的线虫。第三，为提高茎线虫对滤纸的通过率，就只能延长浸泡提取时间。然而长时间的浸水会导致发病植物组织内杂菌的快速繁殖，增加茎线虫的死亡率。此外，为得到较为干净的茎线虫，许多实验室利用镰刀菌培养茎线虫，然而该方法从开始培养到收集需要40-50d的时间，周期很长，且每个培养皿仅能收集到10000-40000头茎线虫，成本高，效率低。因此开发一种成本低、效率高、分离产物干净的马铃薯腐烂茎线虫分离方法，将对促进相关研究的开展具有十分重要意义。

发明内容

针对上述现有技术存在的问题，本发明提供一种植物组织中马铃薯腐烂茎线虫的分离方法，能提供大量、干净的马铃薯腐烂茎线虫，满足茎线虫病的研究工作需求。

为了实现上述目的，本发明采用的一种植物组织中马铃薯腐烂茎线虫的分离方法，具体包括以下步骤：

1)称取一定量的Pluronic F-127放入烧杯中，按照Pluronic F-127浓度为25％的比例向烧杯中加入灭菌水，然后将烧杯在冰浴条件下搅拌过夜，待Pluronic F-127完全溶解，溶液澄清透明后放入4℃冰箱保存备用；

2)取灭菌的细胞培养板，向培养板的每个板孔中加入5ml Pluronic F-127溶液，室温静置30min使Pluronic F-127溶液形成半固态凝胶，得Pluronic胶；

3)将发病薯块切成2-4mm的薄片，用镊子夹取病薯片沿板孔一侧贴壁轻轻放入Pluronic胶中，室温下静置2h，使茎线虫从植物组织中游出；

4)用移液器沿板孔另一侧吸取含有茎线虫的Pluronic胶；

5)将吸取的含有茎线虫的Pluronic胶装入2ml离心管，在4℃冰箱中放置20min使Pluronic胶溶解，离心使茎线虫沉淀，弃去上层Pluronic胶溶液；

6)向离心管中加入1ml预冷的灭菌水，清洗茎线虫，离心回收茎线虫，经3-5次重复清洗、离心回收后即获得纯净的茎线虫悬浮液。

作为改进，所述的步骤5)中的离心为4℃下12000rpm离心5min。

作为改进，所述的步骤6)中的离心为4℃下8000rpm离心5min。

作为改进，所述步骤6)中的灭菌水于4℃下预冷。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1)本发明选用浓度为25％(W/V)的Pluronic F-127水溶液，其在室温时是半固态，以其为介质对线虫进行分离，可使茎线虫从植物组织中自由游出，通过效率远远高于滤纸，大大提高茎线虫的回收率。

2)半固态的Pluronic胶不会像水一样随意流动，所以放入的植物组织残渣不会四处扩散，在线虫回收时，只要稍加注意就可避免植物组织的污染，获得干净的茎线虫，操作过程简单方便，回收效率高。

3)本发明选用的25％(W/V)的Pluronic F-127水溶液在15℃以下时是液态，方便线虫的离心回收。

4)本发明的分离方法中线虫回收时采用的温度为4℃，为各实验室普遍采用的温度条件，适用广泛，且不会对线虫产生任何影响。

附图说明

图1为本发明的分离方法用于发病甘薯块根中马铃薯腐烂茎线虫的实施例及与现有分离技术的效果比较：

其中，(A)为采用本发明方法的马铃薯腐烂茎线虫分离过程；(B)采用本发明方法获得的马铃薯腐烂茎线虫在40倍显微镜下观察结果，可见线虫数量较多且无杂质；

(C)为采用浅盘法分离马铃薯腐烂茎线虫；(D)为采用浅盘法分离获得的茎线虫悬浮液，其中含有杂菌且线虫量较少；

(E)为采用漏斗法分离马铃薯腐烂茎线虫；(F)为采用漏斗法分离获得的茎线虫悬浮液，其中含有较多植物组织残渣且线虫量极少。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面通过附图中及实施例，对本发明进行进一步详细说明。但是应该理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限制本发明的范围。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术术语和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同，本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。

一种植物组织中马铃薯腐烂茎线虫的分离方法，具体包括以下步骤：

1)称取25g的Pluronic F-127放入烧杯中，再向烧杯内加入100ml灭菌水(使Pluronic F-127浓度为25％)，然后将烧杯在冰浴条件下搅拌过夜，待Pluronic F-127完全溶解，溶液澄清透明后放入4℃冰箱保存备用；

2)取灭菌的6孔细胞培养板(可根据线虫需求量替换成更大容器)，向培养板的每个板孔中加入5ml Pluronic F-127溶液，室温静置30min使Pluronic F-127溶液形成半固态凝胶，得Pluronic胶；

3)将发病薯块切成2-4mm的薄片，用镊子夹取病薯片沿板孔一侧贴壁轻轻放入Pluronic胶中，室温下静置2h，使茎线虫从植物组织中游出；

4)用移液器沿板孔另一侧吸取含有茎线虫的Pluronic胶，该操作应缓慢小心，避免吸入植物组织残渣；

5)将吸取的含有茎线虫的Pluronic胶装入2ml离心管，在4℃冰箱中放置20min使Pluronic胶溶解，4℃下12000rpm离心5min使茎线虫沉淀，弃去上层Pluronic胶溶液；

6)向离心管中加入1ml预冷(4℃)的灭菌水，清洗茎线虫，在4℃条件下8000rpm离心5min，回收茎线虫，经3-5次重复清洗、离心回收后即获得纯净的茎线虫悬浮液。

采用本发明方法对发病薯块中马铃薯腐烂茎线虫进行分离纯化，获得结果如图1所示，从分离结果中可以看出：

①选用25％(W/V)的Pluronic F-127半固态凝胶作为植物组织中马铃薯腐烂茎线虫的分离介质，能够有效阻止植物组织残渣的扩散，整个分离体系中Pluronic凝胶都干净透明。

②采用本发明方法获得的马铃薯腐烂茎线虫十分干净，不含任何植物组织残渣。

③采用本发明方法能够大大提高马铃薯腐烂茎线虫的回收效率，与目前通用的浅盘法(图1中C所示)和漏斗法(图1中E所示)相比，本方法获得的茎线虫数量分别提高了2.3倍和15.7倍。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。