马铃薯腐烂茎线虫两个热激蛋白新基因(Dd-hsp90-1和Dd-hsp70-1)的克隆与特性研究

摘要

马铃薯腐烂茎线虫是我国重要的植物检疫性有害生物，最初发现于北美，现分布于50多个国家和地区，在中国的东北、华北、华东地区均有分布。马铃薯腐烂茎线虫的广泛传播与分布表明其具有很强的环境适应能力，能够抵御多种生物与非生物胁迫。本研究从马铃薯腐烂茎线虫中分离出2个与生物抗逆境相关的热激蛋白Hsp90和Hsp70新基因，并对它们进行了生物信息学分析和Southern杂交分析。为研究马铃薯腐烂茎线虫的抗逆性及其生态适应性打下基础，对于今后开展该线虫的防治工作将有重要意义。
　　 用RT-PCR结合RACE的技术从马铃薯腐烂茎线虫中克隆得到一个热激蛋白90新基因，命名为Dd-hsp90-1，基因登录号为HQ901595。其cDNA全长为2347 bp，含有一个2160 bp的开放阅读框，其5′端起始密码子ATG前有一个70 bp的非编码区，3′端有一个117 bp的非编码区，且3′端有多聚腺苷酸尾及加尾信号(AATAAA)，含有9个内含子，且内含子两端拼接位点序列遵守GT/AG规则。推测其编码蛋白含有719个氨基酸残基，分子量为82.79 kDa。信号肽预测结果显示在其氨基端没有信号肽，说明其为胞质型Hsp90。以来自不同物种的7种Hsp90氨基酸序列进行序列比对分析，结果表明，马铃薯腐烂茎线虫Hsp90含有Hsp90蛋白家族保守的亮氨酸拉链、LXXLL序列和GXXGXG基系以及胞质型Hsp90蛋白家族的5个特征序列和MEEVD基系。系统进化分析表明，马铃薯腐烂茎线虫Hsp90基因与松材线虫Hsp90基因属于同一个进化支系，表明这两个物种的热激蛋白基因可能功能相似。Southern杂交结果表明，Dd-hsp90-1存在于Ditylenchus destructor中，且为单拷贝基因，该基因在植物寄生线虫分类与鉴定中具有潜在应用价值。
　　 用RT-PCR结合RACE的技术从马铃薯腐烂茎线虫中克隆得到一个热激蛋白70新基因，命名为Dd-hsp70-1，基因登录号为HQ386232。其cDNA全长为2087 bp，含有一个1938 bp的开放阅读框，其5′端起始密码子ATG前有一个48 bp的非编码区，3′端有一个101 bp的非编码区，且3′端有多聚腺苷酸尾及加尾信号(AATAAA)，含有11个内含子，且内含子两端拼接位点序列遵守GT/AG规则。推测其编码蛋白含有645个氨基酸残基，分子量为70.45 kDa。信号肽预测结果显示，该Hsp70没有信号肽，表明该蛋白不具有分泌功能。Hsp70氨基酸序列比对结果显示，马铃薯腐烂茎线虫Hsp70含有Hsp70蛋白家族的3个特征序列和EEVD基系。以该Hsp70与其他物种中的Hsp70进行系统进化分析，结果显示，Hsp70的系统发育树不能体现物种间的亲缘关系，推测其反映的是不同物种间Hsp70生物学功能的相似性程度。Southern杂交分析表明，马铃薯腐烂茎线虫hsp70为多拷贝基因，首次证明了在植物寄生线虫中，hsp70为多拷贝基因。