雨生红球藻藻渣在经济蟹类育肥饲料中的高值化利用方法

摘要

本发明公开了一种雨生红球藻藻渣在经济蟹类育肥饲料中的高值化利用方法，包括步骤：(1)测定所述雨生红球藻藻渣中的虾青素的含量；(2)确定不同经济蟹类育肥饲料配方中所述雨生红球藻藻渣的添加量；(3)使用合适的饲料加工工艺加工所述经济蟹类育肥饲料；和(4)使用育肥饲料科学投喂所述经济蟹类进行育肥。该方法根据蟹类育肥期间的虾青素需求和雨生红球藻藻渣中的虾青素含量计算出饲料配方中的雨生红球藻藻渣添加量；采用油脂真空喷涂工艺防止饲料中的虾青素氧化损失；根据蟹类的卵巢发育情况进行科学育肥。使用该方法配制和使用育肥饲料不仅可以降低饲料配方成本1500元/吨以上，且可以提高蟹类育肥效果，育肥后的红膏率可达85％以上。

说明书

技术领域

本发明涉及雨生红球藻藻渣在蟹类育肥饲料中的高值化应用方法，属于水产饲料和养殖技术领域。

背景技术

雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)，是一种重要的淡水经济绿藻，其干粉通常含量1.5-6％的天然虾青素，是天然虾青素的主要来源，具有较高的经济价值(Sandeshet al,2008；Orosa et al,2005)。雨生红球藻粉中的天然虾青素为全反式左旋虾青素，且以酯化形式存在，性质稳定，具有较高的生物利用率(Holtin et al,2009)；此外，天然虾青素具有抑制肿瘤细胞增殖(Cenariu et al.,2015)、提高抗氧化和免疫力(Fiedor andBurda,2014；Hughes,2001)、抗衰老(Kidd,2011)、降低癌症和心血管疾病风险(Shareck etal.,2017；Riccioni,2009)等重要功能。因此，雨生红球藻来源的天然虾青素主要用于保健品、食品、化妆品和天然药物中(Tominaga et al,2012；Palozza et al,2009)。雨生红球藻提取虾青素后通常会生成大量雨生红球藻藻渣，提取过程通常是采用食品级乙醇或二氧化碳溶剂超临界提取，因此提取虾青素后的藻渣只需将乙醇或二氧化碳挥发除去，藻渣便是无毒无害的，可能在动物饲料上大量利用；有研究表明，提取虾青素后的雨生红球藻藻渣不仅含有蛋白质、脂肪和碳水化合物等常规营养成分，且仍然含有一定量的虾青素和免疫多糖等活性物质，可以改善动物色泽、提高免疫抗病力和营养品质，故可以作为高档饲料原料在水产饲料上进行高值化利用(Ju et al,2012；石焜等，2017)。目前雨生红球藻藻渣主要作为饲料原料在畜禽养殖上应用，价格仅为60-100元/公斤，在水产饲料上应用较少尚未见在蟹类育肥饲料中的利用途径和方法。

中华绒螯蟹、三疣梭子蟹和拟穴青蟹是全球最主要的养殖蟹类，主要在中国、日本和韩国等地进行人工养殖。性腺、肝胰腺和肌肉是蟹类的主要可食部位，因此性腺发育状况直接影响着蟹类的经济价值(Wu et al,2017)。蟹类在性腺发育阶段通常需要投喂优质饲料(饵料)才能保证其正常发育，如：要求饲料高含量的蛋白质、脂肪、维生素和虾青素等，这个促进性腺发育的过程称之为育肥，性腺发育阶段投喂的饵料称为育肥饵料。由于蟹类育肥饲料中虾青素含量对其色泽、抗氧化、免疫抗病和营养组成非常重要，因此蟹类育肥饲料中通常需要添加一定含量的虾青素(Long et al,2017；赵磊，2017)。池塘养殖蟹类在育肥期间(性腺发育阶段)饵料中需要含有一定量的虾青素才能保证性腺正常发育、色泽红润、免疫抗病力、抗氧化抗应激能力、肝胰腺和卵巢中足够的虾青素等，通常需要在蟹类育肥饲料中添加雨生红球藻粉(天然虾青素)或者养殖中后期大量投喂富含虾青素的贝类等天然饵料调控色泽。但是雨生红球藻粉来源的天然虾青素价格昂贵，通常折算成纯虾青素每克高达50元左右，目前雨生红球藻粉提取的天然虾青素主要应用于食品、保健品、医药和化妆品领域，无法给水产饲料工业提供足够数量的雨生红球藻中提取的天然虾青素；人工合成虾青素由于存在多种同分异构体，全反式左旋虾青素仅占人工合成虾青素中含量的25％左右，其生物学效率仅为雨生红球藻来源天然虾青素的三分之一左右，且其对人体的安全性一直受到质疑(麻楠等，2017；Capelli et al,2013)；螺蛳和兰蛤等贝类虽然含有一定量天然虾青素，但是来源和质量均不稳定，无法满足蟹类养殖业的需求。

发明人长期从事蟹类营养饲料和育肥技术研发的基础上，发现雨生红球藻藻渣可以在蟹类育肥饲料上应用，可以替代价格昂贵的雨生红球藻粉或人工合成虾青素，这不仅可以大幅度降低蟹类育肥饲料的成本，且可以提高蟹类的免疫力和营养品质，具有重要的应用价值。因此，本发明专利以雨生红球藻藻渣在中华绒螯蟹雌体育肥饲料中的应用为例，说明本发明的可行性。

发明内容

本发明在大量研究的基础上，根据雨生红球藻粉提取虾青素后的藻渣中仍然含有一定量的虾青素和免疫多糖等活性物质的原理，根据经济蟹类在性腺发育期间的虾青素和其他营养素需求，在育肥饲料中添加一定量的雨生红球藻藻渣，不仅可以改善河蟹色泽、增加抗氧化和免疫性能、提高可食组织中的虾青素含量等，且可以实现雨生红球藻藻渣的高值化利用、大幅度降低蟹类育肥饲料配方成本。本发明目的在于提供雨生红球藻藻渣在蟹类育肥饲料中的高值化利用方法。为实现本发明的目的，本发明的技术方案是：

一种雨生红球藻藻渣在经济蟹类育肥饲料中的高值化利用方法，该方法包括步骤：

(1)测定所述雨生红球藻藻渣中的虾青素的含量；

(2)确定不同经济蟹类育肥饲料配方中所述雨生红球藻藻渣的添加量；

(3)使用合适的饲料加工工艺加工所述经济蟹类育肥饲料；和

(4)使用育肥饲料科学投喂所述经济蟹类进行育肥。

本发明中所经济述蟹类包括中华绒螯蟹、三疣梭子蟹、拟穴青蟹和美国兰蟹。、

在本发明的一个优选实施方案中，所述雨生红球藻藻渣是雨生红球藻采用乙醇或二氧化碳溶剂超临界提取虾青素后生成的雨生红球藻藻渣。

在本发明的一个优选实施方案中，步骤(1)中测定雨生红球藻藻渣中的虾青素含量包括步骤：用丙酮作为溶剂提取所述雨生红球藻藻渣，和采用液相色谱法测定其中的虾青素含量。

在本发明的一个更优选实施方案中，所述液相色谱法所用的色谱柱为Luna 3uSilica，流动相为体积比为83:17的正己烷和丙酮。

在本发明的一个优选实施方案中，步骤(2)中步骤(2)中确定不同经济蟹类育肥饲料配方中的所述雨生红球藻藻渣添加量是根据雌雄经济蟹类性腺发育期间(育肥期)对虾青素的需求量和所述雨生红球藻藻渣中的虾青素含量，计算出相应的经济蟹类育肥饲料配方中所述雨生红球藻藻渣的添加量和其他原料配方。

在本发明的一个优选实施方案中，步骤(3)中所述合适的饲料加工工艺包括沉性膨化饲料加工工艺和油脂真空喷涂到所述经济蟹类育肥饲料表面，以确保所述经济蟹类育肥饲料的水中稳定性和防止其中的虾青素氧化损失。

在本发明的一个更优选实施方案中，步骤(3)中所述合适的加工工艺包括以下步骤：

(1)将各种经济蟹类育肥饲料原料超微粉碎、混合和调质后，制成沉性膨化饲料，并制成颗粒；

(2)将油脂喷涂到经济蟹类育肥饲料颗粒上；

(3)双层包装，内层可抽真空的塑料袋，外层为深色塑料编织袋；

(4)饲料避光保存，储存于阴凉干燥处或冷库中。

在本发明的一个更进一步优选实施方案中，所述油脂是鱼油和植物的混合，其用量为饲料总重量的4-8％。

在本发明的一个优选实施方案中，步骤(4)中科学投喂所述经济蟹类进行育肥，80％以上的个体应该已经完成生殖蜕壳，方可开始投喂所述经济蟹类育肥饲料。

在本发明的一个更优选实施方案中，步骤(4)中所述科学投喂育肥饲料对所述经济蟹类进行育肥，建议雌雄经济蟹类分养进行育肥，育肥前雌蟹的卵巢指数为0.5-3％，育肥后卵巢指数大于7％，停止育肥；雄蟹育肥前性腺指数为大约0.5％左右。

在本发明的一个更优选实施方案中，雌雄经济蟹类混合养殖时，投喂雌体育肥饲料对雌雄混合养殖的经济蟹类进行育肥。

本发明一方面在测定雨生红球藻藻渣中虾青素和其它营养成分基础上，结合不同蟹类育肥期间的营养需求，配制了营养平衡、成本较低的蟹类育肥饲料，比采用天然虾青素或人工合成虾青素的饲料配方成本下降1500元/吨以上；本发明的第二方面提供了蟹类育肥饲料(含有雨生红球藻藻渣)的使用方法，不仅可以改善色泽和提高组织中的虾青素含量，且可以增强免疫抗病力和提高营养品质，从而提高育肥后蟹类的经济价值，实现雨生红球藻藻渣的高值化利用。

本发明的技术方案适合雨生红球藻养殖加工企业、饲料加工企业和蟹类养殖企业或农户使用，有利于改善养殖河蟹的色泽，提高免疫抗病、抗应激能力，同时降低饵料成本和养殖风险。

雨生红球藻藻渣的虾青素和其他主要营养成分测定。

采用丙酮作为溶剂提取藻渣中的总类胡萝卜素，采用液相色谱法测定虾青素含量，色谱柱为Luna 3u Silica(150mm×4.60mm,phenomenex,USA)，流动相为正己烷和丙酮(83:17，V/V)(Tume et al,2009),按照AOAC的标准方法测定饲料水分(105℃烘干法)、粗蛋白(凯氏定氮法)和粗灰分(550℃灼烧法)；采用氯仿：甲醇(V/V＝2:1)提取总脂并测定其含量(Folch等,1957)。采用14％的三氟化硼-甲醇溶液对总脂进行甲酯化，脂肪酸组成采用安捷伦7890B-5977A气相色谱-质谱联用仪进行分析，色谱柱为安捷伦SP-2560毛细管柱(100m×0.25mm；0.2μm)，具体方法参考吴旭干等(2007)。首先采用盐酸水解法测定除色氨酸、蛋氨酸和半胱氨酸之外的常见水解氨基酸；采用氢氧化钠水解法测定色氨酸含量(Chen etal.,2007)；甲硫氨酸和半胱氨酸的含量采用过甲酸氧化水解法测定(Spindler et al.,1984)。

蟹类育肥阶段(性腺发育阶段)饲料的营养参数确定

根据发明人的研究经验和查阅资料，确定蟹类雌雄个体在育肥阶段(性腺发育阶段)饲料的营养参数。以河蟹为例，雌体卵巢发育期间的主要营养需求参数为：粗蛋白34-38％，粗脂肪10-14％，磷脂含量为3-4％,总高度不饱和脂肪酸含量为0.5-0.8％,反式左旋虾青素含量约为60mg/kg饲料；雄体性腺发育期间的主要营养需求参数为：粗蛋白37-40％，粗脂肪6-8％，磷脂含量为2-3％,总高度不饱和脂肪酸含量为0.3-0.5％,反式左旋虾青素含量为30mg/kg饲料。

育肥饲料配方和雨生红球藻藻渣添加量的确定

根据蟹类育肥阶段的营养需求、原料特性和配方经验，确定饲料配方中的主要原料组成和雨生红球藻藻渣添加量。如河蟹雌体对反式虾青素的需求量为60mg/kg饲料，如基础饲料中反式虾青素含量约为10mg/kg饲料，雨生红球藻藻渣中的反式虾青素含量为0.6％，因此据此可以计算出，河蟹雌体育肥饲料中需要添加0.83％的雨生红球藻藻渣。雌体育肥饲料中的其它主要成分为：进口蒸汽鱼粉10-15％，肉粉5-8％，发酵豆粕18-24％，花生粕10％，菜粕10-12％，玉米8-12％，次粉14％，南极磷虾粉4％，大豆磷脂油3％，精制鱼油2.0％，猪油2％，豆油1％，菜籽油1％，磷酸二氢钙1％，氯化胆碱0.5％，复合维生素0.2％，胆固醇0.3％，复合矿物质0.5％，甜菜碱0.2％，维生素E 50mg/kg饲料。

育肥饲料的加工

将各种饲料原料通过超微粉碎(所有原料过100目筛网)、混合和调质后制成沉性膨化饲料，为了防止添加在饲料中的虾青素氧化损失，膨化饲料制粒后采用真空喷涂工艺喷涂4-8％的油脂到饲料表面，这样可以形成隔氧层，防止虾青素氧化。育肥饲料的粒径和长度根据养殖对象确定；膨化饲料在水中具有较好的稳定性，水中浸泡4小时(20度条件下)的溶失率小于10％。

育肥饲料的包装和保存

蟹类育肥饲料由于含有较高的虾青素和高度不饱和脂肪酸，通常需要抽真空包装，外层用深色塑编织袋，防止饲料见光后引起的脂肪酸和虾青素氧化分解，饲料包装袋通常为两层，内层为可以抽真空的塑料袋，外层为深色的编织袋；饲料储存于阴凉干燥处或-10度以下的冷库中。

育肥饲料的使用方法

当80％以上的个体完成生殖蜕壳后，即开始投喂育肥饲料，雌雄分养进行育肥，育肥前雌蟹的卵巢指数为0.5-3％(卵巢指数过大育肥效果不好)，育肥后卵巢指数大于7％，才能停止育肥；如果育肥蟹为雄蟹，育肥前性腺指数为0.5％左右。雌雄混合养殖时，由于雌体对虾青素的营养需求高于雄体，雌体育肥饲料可以满足雄体的营养需求，故混合养殖时通常投喂雌体育肥饲料。育肥阶段的专用饲料，每日饲料投喂量通常为河蟹总重量的2-3％(池塘水温为20-30度)，每日投喂两次，上午投喂量占全天的30-40％，投喂时间为上午7:00左右，以深水区投喂为主；下午投喂量占全天的60-70％，投喂时间为下午18:00左右，以浅水区投喂为主。池塘日平均水温低于20度，每日投喂量通常为河蟹总重量的0.5-2％左右，每日投喂0.5-1次，投喂时间为下午17:00左右。

本发明的原理：

雨生红球藻藻渣是天然虾青素提取后的副产物，目前主要用于畜牧饲料或作为肥料。发明人的研究结果表明，雨生红球藻藻渣通常含有粗蛋白25-30％、粗脂肪5-12％、碳水化合物25-30％和虾青素0.2-1％；由于蟹类在性腺发育期间需要较高的虾青素需求量，但采用雨生红球藻粉或人工合成虾青素作为饲料中虾青素来源，成本十分昂贵。发明人的研究表明，采用雨生红球藻藻渣作为蟹类育肥饲料中的虾青素主要来源，不仅可以显著降低饲料成本和实现雨生红球藻藻渣的高值化利用，且可以提高蟹类的免疫抗病力和营养品质。经过近年来的反复实践表明，应用本发明的方法配制蟹类育肥饲料，可以比采用雨生红球藻粉或人工合成虾青素作为虾青素来源配制的蟹类育肥饲料成本下降1500元/吨左右，蟹类经过40-60天的育肥后，成活率达80％以上，红膏率达85％以上。本发明应用方便、实际使用效果好，具有较强的实用价值。由于采用了上述技术方案，本发明的有如下的益效果：

1、根据雨生红球藻藻渣的营养组成和蟹类育肥期间的营养需求，将雨生红球藻藻渣在蟹类育肥饲料中进行应用，实现雨生红球藻藻渣的高值化的利用；

2、使用雨生红球藻藻渣替代目前蟹类育肥饲料中普遍使用的雨生红球藻粉或人工合成虾青素，在确保育肥效果的情况下，不仅可以大幅度降低饲料成本，且可以防止人工合成虾青素存在的正式虾青素对动物体或人体可能造成的负面影响。

3、根据蟹类雌雄个体在性腺发育期间(育肥期间)不同的营养需求、生殖蜕壳时间和育肥周期等，分别配制雌雄专用的育肥饲料，可以提高育肥效果，实现精准育肥。

4、在蟹类性腺发育阶段，投喂富含反式虾青素的育肥饲料40-60天，提高虾青素等在蟹壳、卵巢和肝胰腺中的含量，从而改善蟹壳、卵巢和肝胰腺的色泽，提高蟹类的商品价值和食用价值；

5、通过在饲料中的添加足够量的反式虾青素，不仅可以调控色泽和提高营养价值，且可以提高河蟹的免疫抗病力和抗应激能力，从而提高了育肥期间的成活率。

附图说明

图1是三种饲料对河蟹卵巢指数的影响。

图2是三种饲料对河蟹烘干卵巢的色泽影响。饲料1#组是用添加雨生红球藻藻渣的饲料饲养的河蟹，饲料1#组雌体河蟹的烘干后的卵巢颜色红润，和饲料2#组(用添加雨生红球藻粉的饲料饲养的河蟹)接近；饲料2#是用添加破壁雨生红球藻粉的饲料饲养的河蟹，该组雌体河蟹的烘干后的卵巢的色泽较好；饲料3#组是用没有添加雨生红球藻藻渣或藻粉饲料饲养的河蟹(作为对照组)，该组雌体河蟹烘干后的卵巢颜色淡黄，明显和饲料1#和饲料2#组差别较大。

图3是三种饲料对河蟹烘干蟹壳的色泽影响。饲料1#组和饲料2#组的烘干蟹壳的颜色均为深桔红色，饲料3#组(没有添加雨生红球藻藻渣或藻粉育肥饲料)的烘干蟹壳的颜色为淡桔红色，明显和饲料1#和饲料2#组差别较大。

具体实施实例

为了使本发明的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面通过“雨生红球藻藻渣在河蟹雌体育肥饲料上的应用实例”来进一步阐述本发明。

1.1雨生红球藻藻渣的虾青素和其他主要营养成分测定

采用丙酮作为溶剂提取藻渣中的总类胡萝卜素，采用液相色谱法测定虾青素含量，色谱柱为Luna 3u Silica(150mm×4.60mm,phenomenex,USA)，流动相为正己烷和丙酮(83:17，V/V)(Tume et al,2009)，按照AOAC的标准方法测定饲料水分(105℃烘干法)、粗蛋白(凯氏定氮法)和粗灰分(550℃灼烧法)；采用氯仿：甲醇(V/V＝2:1)提取总脂并测定其含量(Folch等，1957)。采用14％的三氟化硼-甲醇溶液对总脂进行甲酯化，脂肪酸组成采用安捷伦7890B-5977A气相色谱-质谱联用仪进行分析，色谱柱为安捷伦SP-2560毛细管柱(100m×0.25mm；0.2μm)，具体方法参考吴旭干等(2007)。首先采用盐酸水解法测定除色氨酸、蛋氨酸和半胱氨酸之外的常见水解氨基酸；采用氢氧化钠水解法测定色氨酸含量(Chen etal.,2007)；甲硫氨酸和半胱氨酸的含量采用过甲酸氧化水解法测定(Spindler et al.,1984)。

表1雨生红球藻藻渣的虾青素和其他主营养成分

∑EAA:总必需氨基酸含量；∑NEAA:总非必需氨基酸含量；∑TAA:总氨基酸含量；∑SFA:总饱和脂肪酸含量；∑MUFA:总单不饱和脂肪酸含量；∑PUFA:总多不饱和脂肪酸含量；∑HUFA:总高度不饱和脂肪酸含量.

1.2河蟹雌体育肥阶段(性腺发育阶段)饲料的营养参数确定

发明人研究经验和查阅资料，确定河蟹雌体在育肥阶段(性腺发育阶段)对饲料中的主要营养参数为：粗蛋白34-38％，粗脂肪10-14％，磷脂含量为3-4％,总高度不饱和脂肪酸含量为0.5-0.8％,反式左旋虾青素含量约为60mg/kg饲料。

1.3育肥饲料配方和雨生红球藻藻渣添加量的确定

根据河蟹雌体育肥阶段的营养需求、原料特性和配方经验，确定饲料配方中的主要原料组成和雨生红球藻藻渣添加量。河蟹育肥饲料以豆粕、菜籽粕和鱼粉作为主要蛋白源，以鱼油、猪油、大豆油和菜籽油作为脂肪源配制实验饲料，为了科学评估雨生红球藻藻渣对河蟹雌体育肥和营养品质的影响，本实验中设置两个对照组(添加雨生红球藻粉组和未添加雨生红球藻粉或藻渣的对照组)，因此共三组饲料：饲料1#(添加1％的雨生红球藻藻渣，藻渣中实测虾青素含量约为0.66％)；饲料2#(添加0.2％的破壁雨生红球藻粉，藻粉中实测虾青素含量约为3.01％)；饲料3#(未添加雨生红球藻藻粉或雨生红球藻藻渣的对照组)。具体饲料配方和测定营养成分见表2.

表2饲料配方和测定营养成分

1.4河蟹育肥饲料的加工、包装和保存

将各种饲料原料通过超微粉碎(所有原料过100目筛网)、混合和调质后制成沉性膨化饲料，为了防止添加在饲料中的虾青素氧化损失，膨化饲料制粒后采用真空喷涂工艺后喷涂油脂到饲料上，这样可以防止形成隔氧层，防止虾青素氧化。雌体育肥饲料的粒径为5mm左右，长度8mm左右；膨化饲料在水中具有较好的稳定性，水中浸泡4小时(20度条件下)的溶失率小于10％。

由于蟹类育肥饲料由于含有较高的虾青素和高度不饱和脂肪酸，通常需要抽真空包装，外层用深色塑编织袋，防止饲料见光后引起的脂肪酸和虾青素氧化分解，饲料包装袋通常为两层，内层为可以抽真空的塑料袋，外层为深色的编织袋；饲料储存于阴凉干燥处或-10度以下的冷库中。

1.5河蟹雌体育肥养殖

养殖实验在上海海洋大学崇明河蟹研究基地的室内循环水系统中进行，养殖水槽为PE(polyethylene)圆桶(直径×高＝108×120cm)，实验期间水深保持在50cm左右，进行24小时连续充氧；以日光灯(40W)作为光源，光暗周期为12小时光照，12小时黑暗。水源为漂白粉消毒曝气后的淡水。本研究中共三个饲料组，分别投喂1#(藻渣)、2#(藻粉)和3#(未添加藻粉藻渣)饲料，每个水槽中随机放入一定数量的雌蟹，每个饲料组设4个重复水槽，共12只实验水槽。实验用蟹采自上海海洋大学崇明基地，选择生殖蜕壳后的雌蟹用于对比实验，体重为80g-90g，实验前雌体平均性腺指数(GSI)为0.72％。实验蟹在PE桶中暂养3～5天后开始正式实验。实验期间，每日18:00左右分别投喂三种实验饲料，当水温高于20℃时，投喂量为河蟹总体重的1.5-3％；当水温为15-20℃时，投喂量为体重的1-1.5％，具体根据水温和摄食等情况灵活调整投喂量。投喂后2-3h检查残饵情况，并于次日上午9:00左右检查残饵和死亡情况，做好相关记录。养殖过程中，每隔2天吸1次残饵和粪便，每隔3天测定1次水质指标，根据水质指标每2周左右适当换水或加水；养殖期间水质指标要求为：pH 7.0～9.0；平均溶氧>4mg/L；氨氮<0.5mg/L，亚硝酸盐<0.15mg/L，这些均在河蟹养殖的安全水质指标范围内，养殖实验共计60d。

1.6采样和样品分析。

实验60d后停食1d，从每个PE桶中随机采样2只雌蟹进行称重后，解剖取性腺和肝胰腺并计算GSI和HSI，样品于-40℃冰箱中保存用于后续分析。按照AOAC(1995)的标准方法测定饲料水分(105℃烘干法)、粗蛋白(凯氏定氮法)和粗灰分(550℃灼烧法)；按照Folchet al(1957)的方法，采用氯仿：甲醇(V/V＝2:1)提取总脂并测定其含量；采用3,5-二硝基水杨酸法测定碳水化合物含量(张惟杰，1987)。脂肪酸分析参考Wu et al(2007)的方法，采用14％的三氟化硼-甲醇溶液对总脂进行甲酯化。按照赵磊等(2016)的方法进行样品制备、抗氧化及免疫指标的测定。

1.7.效果评价

(1)大幅度降低了育肥饲料成本

雨生红球藻粉来源的天然虾青素使用安全，无任何毒副作用，但价格较高，目前雨生红球藻干粉(含3％虾青素)售价为1400元左右/公斤，而雨生红球藻藻渣的价格约为80元/kg。在河蟹育肥饲料中添加1％雨生红球藻藻渣和0.2％的雨生红球藻粉都可以使饲料中含有约60mg/公斤的虾青素，这个含量可以满足成蟹河蟹着色和品质调控的要求，相比于对照组饲料，藻渣和藻粉使得饲料成本分别增加800元/吨和2800元/吨，但两者对河蟹育肥和着色的效果基本无差异。因此，采用雨生红球藻藻渣作为河蟹育肥饲料中的虾青素源，可以显著降低饲料成本，有利于雨生红球藻藻渣的合理利用。

表3三种饲料虾青素和总配方成本比较

(2)提高了成活率和保证了卵巢发育

饲料中添加雨生红球藻藻渣可以小幅度提高雌体育肥后的成活率，3#组成活率为87％，1#和2#饲料组分别为92.5％和90％。饲料中添加雨生红球藻藻渣对河蟹雌体的卵巢发育无显著影响，育肥60天，卵巢指数达到10％左右(图1)，达到了一级膏蟹的标准。

(3)提高了膏蟹色泽和类胡萝卜素含量

由图2所示，饲料1#(添加藻渣)组雌蟹卵巢干样色泽与饲料2#(添加藻粉)组并无显著差异，饲料1#组的颜色显著好于饲料3#组。各组成蟹颜色值见表4，饲料1#组和饲料2#组卵巢和头胸甲a值均显著高于饲料3#组(P<0.05)，而卵巢L值和b值则以饲料3#组最高(P<0.05)；各组肝胰腺b值、头胸甲L值均无显著差异(P>0.05)。如图3所示，饲料中添加藻渣和藻粉可明显提高雌体头胸甲的红度。

雌体三种组织中的类胡萝卜素组成见表4。饲料1#和2#组雌体卵巢中的总类胡萝卜素、虾青素、叶黄素和玉米黄素的含量均显著高于饲料3#组(P<0.05)，而β-胡萝卜素含量以饲料3#组最高(P<0.05)。饲料1#和2#组成蟹肝胰腺中总类胡萝卜素含量、头胸甲中总类胡萝卜素与虾青素含量显著高于饲料3#组(P<0.05)。

表4三种饲料对河蟹卵巢、肝胰腺和蟹壳中的主要类胡萝卜素含量影响(mg/kg干组织)

(4)提高了膏雌体的抗氧化和免疫性能

三组雌体血清和肝胰腺中的抗氧化指标如表5所示。饲料1#和2#组血清中的谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和过氧化氢酶(CAT)活性显著高于饲料3#组(P<0.05)，而MDA含量以饲料3#组最高(P<0.05)。饲料3#组肝胰腺中除GR活性和MDA含量显著高于饲料1#和2#组以外，其余抗氧化指标均无显著差异(P>0.05)。各组成蟹免疫性能指标如表6所示。饲料1#和2#组血清中ALP活性、血蓝蛋白(Hc)和一氧化氮(NO)含量均显著高于饲料3#组(P<0.05)，而肝胰腺中ACP、ALP、γ-GT活性和NO含量均以饲料3最高(P<0.05)。

表5三种饲料对河蟹雌体血清和肝胰腺中的抗氧化指标的影响

表6三种饲料对河蟹雌体血清和肝胰腺中的免疫指标的影响

从以上具体实施例可以看出本发明的创新点主要有：一、提取虾青素后的雨生红球藻藻渣不仅含有蛋白质、脂肪和碳水化合物等常规营养成分，且含有一定量的虾青素和免疫多糖等活性物质，可以改善蟹类色泽、提高免疫抗病力和营养品质，故可以作为高档饲料原料在蟹类饲料上进行高值化利用；二、由于蟹类雌雄个体性腺发育期间对虾青素的需求量不同，对同一物种而言，雄体对虾青素的需求远低于雌体，因此根据雌雄个体不同的虾青素需求，配制两种不同虾青素含量的育肥饲料，不仅可以节省养殖成本，且可以实现精准化养殖；三、蟹类育肥阶段通常时间只有40-60天，但对饵料要求较高，通过投喂优质饵料和科学管理，不仅可以促进性腺发育而提高可食率，且可以极大提高蟹类的营养品质，因此雨生红球藻藻渣在蟹类育肥阶段使用效果明显，具有更高的附加值。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。