一种低硫酸化岩藻半乳聚糖在制备免疫增强剂中的应用

摘要

本发明涉及一种来源于海洋褐藻的低硫酸化岩藻半乳聚糖的制备方法和应用。该低硫酸化岩藻半乳聚糖主要组成单糖包括半乳糖、岩藻糖和葡萄糖等，重均分子量为5‑30KD，其水解硫酸基含量为15‑20％，半乳糖含量为40‑45％，岩藻糖含量为20‑25％，半乳糖含量与岩藻糖含量之比约为2:1。该低硫酸化岩藻半乳聚糖来源于褐藻中的海带，具有激活小鼠腹腔巨噬细胞释放一氧化氮的作用。

说明书

技术领域

本发明涉及生物分子的制备及一种低硫酸化岩藻半乳聚糖的制备方法与应用。

背景技术

免疫是人体的一种生理功能，机体依靠这种功能识别“自己”和“非己”成分，从而破坏和排斥进入人体的病原菌、微生物等抗原物质，或机体自身产生的损伤细胞和肿瘤细胞等，在人类健康中发挥至关重要的作用。调查显示，心血管疾病、癌症和神经退行性疾病成为威胁人类健康的三大疾病。现已有研究表明，免疫反应很有可能应用于肿瘤、神经系统疾病、心血管疾病、糖尿病等重大疾病的治疗。

一氧化氮(NO)在免疫反应中扮演者重要的角色，它属于细胞间的通讯物质，是细胞间遗传物质进行信息传递的重要信号分子；体内释放的一氧化氮具有扩张血管的作用，可以改善心脑血管，对于机体对抗病菌侵入、清除肿瘤细胞以及炎症损伤方面至关重要。Tzianabos AO对今年来多糖在免疫调节活性领域的应用做了综述，认为多糖能够有效激活免疫反应，促进NO的释放，进一步开发成为免疫增强剂。

海洋被认为是一个巨大的潜在的药库，从海洋中开发利用活性物质是当前认识海洋、利用海洋的一个重要内容。其中，海洋褐藻生物量丰富，含有多糖种类繁多，以褐藻中海带为研究对象所提取制备的水溶性多糖同样复杂多样。已有研究报道海带中的不同硫酸多糖具有免疫调节作用。例如，Fang等报道了经柱层析从海带中分离制备的水溶性均聚多糖(LJP-31)具有免疫调节作用，经结构解析证实其主要为甘露葡萄糖；萨仁娜等报道了一种海带岩藻聚糖及其分级组分具有调节肉鸡免疫功能的作用。

本实验室长期致力于海带中活性物质的开发，通过离子交换层析的方法制备了具有不同单糖组成的多糖，一类是硫酸化杂聚糖，一类是岩藻聚糖硫酸酯，另一类硫酸化半乳岩藻聚糖。在大量活性研究，我们发现，硫酸基在其中扮演重要角色但并不是含量越高越好，介于10～30％之间往往具有很好的活性其次，不同组分的单糖组成影响活性的表达，发现随着半乳糖含量的升高，多糖的活性也显著升高。例如，从岩藻聚糖硫酸酯中降解得到的低分子量组分DF经柱色谱分级得到的组分中，DF1的半乳糖含量明显提升，且在神经元保护中活性最佳；海带硫酸化多糖经离子柱层析分级得到的组分中，单糖组成中半乳糖占总体含量78.54％的F3组分较其他组分表现出优异的自由基清除能力。因此我们迫切希望能够得到一种单糖组成以半乳糖为主并且含有一定量岩藻糖的低硫酸化岩藻半乳聚糖，且制备方法应简单可行，易于大量制备。

而目前制备的以岩藻糖为主的硫酸化多糖，采用的方法主要是离子色谱分级，不仅操作复杂，得率低，无法进行工业化生产，而且由于洗脱盐浓度的升高所得到的多糖硫酸基含量很高。因此本发明提供了一种制备方法，用于得到低硫酸化的岩藻半乳聚糖，且单糖组成中半乳糖：岩藻糖＝2:1，并且表现出良好的免疫增强作用；该制备方法操作简单，产率可观，可以进行大量制备。

发明内容

为了进一步发掘海带中的活性成分，本发明提供了一种低硫酸化岩藻半乳聚糖的制备方法，其特征在于单糖组成以半乳糖为主，半乳糖含量与岩藻糖含量之比约为2:1，所得低硫酸化岩藻半乳聚糖能够显著激活巨噬细胞，促进一氧化氮的生成。

一种低硫酸化岩藻半乳聚糖的制备方法，包括以下步骤：

步骤1，采用水提或酸提的方法从海带中提取水溶性多糖，制成多糖溶液；

步骤2，在步骤1制得的多糖溶液中加入0.3-0.8mol/L稀硫酸，至终浓度为0.1-0.5mol/L，在搅拌的情况下于60-100℃水解3-9h；

步骤3，在步骤2水解后的多糖溶液中加入氢氧化钡中和至中性，离心除盐，将得到的降解液用有机试剂沉降，过夜放置后，离心得到沉淀物；

步骤4，将步骤3中所得的沉淀物用水复溶，使质量百分浓度为2-5％，制成沉淀物的水溶液；

步骤5，将步骤4所得沉淀物的水溶液用透析袋透析后，得到的透析袋中的透析液经浓缩干燥即得低硫酸化岩藻半乳聚糖；

其中所述有机试剂为乙腈及丙酮中的一种或两种；

所述的有机试剂沉降体积浓度>90％；

所述的透析袋的截留分子量为1KD。

所述的低硫酸化岩藻半乳聚糖具有如下特征：

其主要组成单糖包括半乳糖、岩藻糖，此外还包括少量的葡萄糖、甘露糖、鼠李糖、木糖、葡萄糖醛酸，其水解硫酸基含量在15-20％之间，半乳糖含量在40-45％之间，岩藻糖含量在20-25％之间。

所述的低硫酸化岩藻半乳聚糖的单糖组成存在半乳糖含量与岩藻糖含量之比约为2:1的特性。

所述的低硫酸化岩藻半乳聚糖的分子量在5-30KD之间。

本发明上述制备方法，具有以下有益效果：

1本发明的制备方法能够得到一种低硫酸化岩藻半乳聚糖，该所述低硫酸化岩藻半乳聚糖具有特殊的单糖组成，其中以半乳糖为主，岩藻糖次之而半乳糖含量与岩藻糖含量之比约为2:1，此外还含有少量的硫酸基。

2本发明的制备方法得到的低硫酸化岩藻半乳聚糖，能够显著激活巨噬细胞，释放一氧化氮。

附图说明

图1为本发明的低硫酸化岩藻半乳聚糖的制备方法示意图；

图2海带中的组分HDF(a)和HDFA(b)的HPGFC分子量谱图；

图3海带中的组分HDF和HDFA的IR谱图；

图4低硫酸化岩藻半乳聚糖促进RAW 264.7细胞生成NO；

图5低硫酸化岩藻半乳聚糖HDFA促进RAW 264.7细胞生成NO的浓度依赖。

具体实施方式

目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1一种低硫酸化岩藻半乳聚糖的制备方法

具体步骤如下：

(1)称取100g剪碎的干海带，加水3L，100-120℃提取4小时，筛绢和硅藻土过滤得到浸提液，浓缩至350mL，加入终浓度0.05mol/L氯化镁除去褐藻胶，离心取上清液，透析除盐，浓缩后用体积浓度85％酒精沉淀，所得沉淀离心冻干，得水溶性多糖；

(2)称取多糖10g溶解于200mL水中，充分搅拌，制成质量浓度为5％多糖溶液；向其中加入0.6mol/L稀硫酸溶液100mL，至终浓度为0.2mol/L，在搅拌的情况下于80℃水解7h；

(3)降解结束后，加入一定量氢氧化钡中和至pH＝7，4000r/min离心15min，弃去沉淀得到降解液，向降解液中加入一定量的乙腈，使乙腈终体积浓度为90％，搅拌后过夜，4000r/min离心15min后得到沉淀物HDF；

(4)所得的沉淀物，经冷冻干燥后，用水复溶，使质量百分浓度为2％，将溶液装入截留分子量为1KD的透析袋中，流水透析12h后，静水透析4h，将得到的透析袋中透析液浓缩，冷冻干燥即得低硫酸化岩藻半乳聚糖HDFA。

(5)对所得的海带中的组分HDF和HDFA进行化学成分分析，包括单糖组成分析、岩藻糖含量、总糖含量、硫酸基含量，以及分子量分析、红外分析，结果如下表1、2和图2、3。

表1低硫酸化岩藻半乳聚糖的化学组成分析

表2低硫酸化岩藻半乳聚糖的单糖组成(摩尔比)

图2海带中的组分HDF和HDFA(从上到下)的HPGFC分子量谱图；

图3海带中的组分HDF和HDFA的IR谱图；

从以上结果可以看出，海带中的组分HDF是一类复杂的低硫酸化杂聚糖，其单糖组成十分复杂，包括半乳糖、岩藻糖、葡萄糖、鼠李糖和甘露糖等，各种单糖含量丰富且没有一种单糖具有支配地位；经过透析后得到的HDFA，其杂多糖的含量明显减少，单糖组成中以半乳糖为主，其次是岩藻糖和葡萄糖，且半乳糖含量与岩藻糖含量之比为2:1，因此，HDFA可以看做是一种低硫酸化岩藻半乳聚糖。

实施例2一种低硫酸化岩藻半乳聚糖的制备方法，

(1)称取100g剪碎的干海带，加水3L，100-120℃提取4小时，筛绢和硅藻土过滤得到浸提液，浓缩至350mL，加入终浓度0.05mol/L氯化镁除去褐藻胶，离心取上清液，透析除盐，浓缩后用体积浓度85％酒精沉淀，所得沉淀离心冻干，得水溶性多糖；

(2)称取多糖10g溶解于200mL水中，充分搅拌，制成质量浓度为5％多糖溶液；向其中加入0.6mol/L稀硫酸溶液100mL，至终浓度为0.5mol/L，在搅拌的情况下于100℃水解5h；

(3)降解结束后，加入一定量氢氧化钡中和至pH＝7，4000r/min离心15min，弃去沉淀得到降解液，向降解液中加入一定量的乙腈，使乙醇终体积浓度为90％，搅拌后过夜，4000r/min离心15min后得到沉淀物；

(4)所得的沉淀物，经冷冻干燥后，用水复溶，使质量百分浓度为2％，将溶液装入截留分子量为1KD的透析袋中，流水透析12h后，静水透析4h，将得到的透析袋中透析液浓缩，冷冻干燥即得低硫酸化岩藻半乳聚糖(记为HDFB)。

(5)HDFB的化学组成见表3、4。从表中可知，所得组分为低硫酸化岩藻半乳聚糖。

表3低硫酸化岩藻半乳聚糖的化学组成分析

实施例3

本实施例与实施例2的区别在于，水解时间延长至9小时，沉降试剂采用丙酮，具体步骤为：

(1)称取100g剪碎的干海带，加水3L，100-120℃提取4小时，筛绢和硅藻土过滤得到浸提液，浓缩至350mL，加入终浓度0.05mol/L氯化镁除去褐藻胶，离心取上清液，透析除盐，浓缩后用体积浓度85％酒精沉淀，所得沉淀离心冻干，得水溶性多糖；

(2)称取多糖10g溶解于200mL水中，充分搅拌，制成质量浓度为5％多糖溶液；向其中加入0.6mol/L稀硫酸溶液100mL，至终浓度为0.2mol/L，在搅拌的情况下于100℃水解9h；

(3)降解结束后，加入一定量氢氧化钡中和至pH＝7，4000r/min离心15min，弃去沉淀得到降解液，向降解液中加入一定量的丙酮，使丙酮终体积浓度为90％，搅拌后过夜，4000r/min离心15min后得到沉淀物；

(4)所得的沉淀物，经冷冻干燥后，用水复溶，使质量百分浓度为2％，将溶液装入截留分子量为1KD的透析袋中，流水透析12h后，静水透析4h，将得到的透析袋中透析液浓缩，冷冻干燥即得低硫酸化岩藻半乳聚糖(记为HDFC)。

(5)HDFC的化学组成见表5、6。从表中可知，所得组分为低硫酸化的岩藻半乳聚糖，半乳糖在单糖组成中占据支配地位。

表5低硫酸化岩藻半乳聚糖的化学组成分析

表6低硫酸化岩藻半乳聚糖的单糖组成(摩尔比)

实施例4：不同浓度的低硫酸化岩藻半乳聚糖促进RAW 264.7细胞生成NO

本试验通过Griess试剂法检测刺激后的RAW 264.7细胞的NO释放清况。

测试样品：实施例中所得低硫酸化岩藻半乳聚糖HDFA、HDFB、HDFC。

标准曲线的绘制：准确配制1mol/L的NaNO₂标准溶液，用双蒸水稀释至80μmol/L后，依照倍数将其分别稀释为浓度为80、40、20、10、5、2.5、0μmol/L的NaNO₂标准溶液。分别吸取100μL标准液至96孔板中，每个浓度设置三个复孔，每孔加入100μL的Griess试剂，室温避光孵育10分钟后，使用酶标仪在550nm下测定吸光度值，绘制标准曲线。

取对数生长期的RAW 264.7小鼠腹腔巨噬细胞，用RPMI1640完全培养基将其制成细胞悬液后稀释至浓度为1×105个细胞/mL，取100μL接种于96孔板，置于37℃、5％的二氧化碳培养箱中孵育24h。之后，弃去培养基，加入已配制好的HDFA溶液100μL，使其终浓度为100μg/mL，每个样品设置3个复孔。阳性对照组加入LPS(脂多糖)，终浓度1μg/mL。继续培养24h后，每孔取100μL加入等体积的Griess试剂混合均匀，室温避光孵育10分钟后，使用酶标仪在550nm下测定吸光度值，将结果代入标准曲线中计算NO的释放量,其结果如图4所示。在浓度梯度实验中，不同浓度的HDFA(0.01，0.1，1，10和100μg/mL)作用于RAW 264.7细胞24h后，Griess法检测NO的释放量，结果如图5所示。

Griess法测定结果显示，与Ctrl相比，LPS能有效激活巨噬细胞，使其释放大量的NO；HDFA与巨噬细胞共孵育后，也能有效激活巨噬细胞，使其释放出大量的NO(图4)，且呈浓度依赖性(图5)，说明HDFA可用于开发免疫增强剂。

图4低硫酸化岩藻半乳聚糖促进RAW 264.7细胞生成NO。

图5低硫酸化岩藻半乳聚糖HDFA促进RAW 264.7细胞生成NO的浓度依赖。