重瓣大岩桐组织的培养方法

摘要

本发明公开了一种重瓣大岩桐组织的培养方法，先将培养大岩桐愈伤组织诱导；然后培养大岩桐的壮苗，得到健壮植株；接着大岩桐再生幼芽的生根培养，得到带根苗；最后进行炼苗、移栽，得到再生植株。本发明可以实现其快速繁殖，成活率高，品种优良适合工业化生产。

说明书

技术领域

本发明属于植物栽培技术领域，特别是涉及一种重瓣大岩桐组织的培养方法。

背景技术

大岩桐，又名落雪泥，原产于巴西热带草原，长在温润的条件下，忌光线直照，有相应的抗炎热水平，最初是1930年前后由金陵大学与中山的植物园一同由美国引入，1949年后有关植物园陆续予以试种，1990年前后投入小规模生产。大岩桐属苦苣苔科，株高20～30cm，是多年生常绿球根花卉，其块茎扁球形，叶长椭圆形，对生，肥厚而大，全株密生白色茸毛，花大色艳，花期长，是花坛造型、室内盆栽的理想花卉。

现有的培养方法具有以下缺点：

1.由于大岩桐雌蕊粗壮健大，雄蕊细小，导致其制种难度大，并且成熟的种子极其细小，约2.8万粒/g，难以收集，播种对土壤要求高，播种产生的后代易发生性状分离；

2.扦插繁殖系数低，很难迅速繁育，不能满足大批量生产的要求；

3.分球繁殖有株形不整齐的缺点；

4.由于它是异花授粉植物，种子后代会发生变异，即用种子繁殖的后代难以保持原有性状成活率不高。我们发现，利用组织培养手段对重瓣大岩桐进行了离体快繁技术，可以解决重瓣大岩桐繁殖难的问题，还能保持优良品种的形状。

发明内容

本发明的目的在于提供一种重瓣大岩桐组织的培养方法，以实现其快速繁殖，成活率高，品种优良适合工业化生产。

本发明所采用的技术方案是，一种重瓣大岩桐组织的培养方法，按照以下步骤进行：

步骤1.培养大岩桐愈伤组织诱导；

步骤2.培养大岩桐的壮苗，得到健壮植株；

步骤3.大岩桐再生幼芽的生根培养，得到带根苗；

步骤4.进行炼苗、移栽，得到再生植株。

进一步的，所述步骤1-3均在固体培养基中进行。

进一步的，所述步骤1具体方法是：先获得愈伤组织，将打孔器剪下的小圆形大岩桐叶片外植体平躺放入愈伤组织诱导培养基中，每瓶接种3-6个无菌外植体；大岩桐愈伤组织诱导培养基为MS+2.0g/L 6-BA+0.3mg/L NAA，之后将接种好的大岩桐外植体放置于培养箱中，光照2000Lux，白天16h，夜晚8h，温度为25℃，3-6周后，得到的愈伤组织，培养两个月后得到的愈伤组织团最大并且开始分化出幼芽，三个月后愈伤组织团上的芽已经有了4片小叶片，整个愈伤组织球上都长满了芽。

进一步的，所述无菌外植体的获得，按照以下步骤进行：

步骤a、取盆栽大岩桐叶片作为外植体，先用水冲洗30分钟，然后移至无菌工作台；

步骤b、将步骤a中处理后的外植体在体积分数为75％的酒精中浸泡8s，用蒸馏水冲洗4次；

步骤c、将步骤b中处理后的叶片外植体在体积分数为0.1％的升汞溶液中浸泡7min，浸泡过程中振荡使外植体灭菌充分，再使用无菌水冲洗4次，最后将灭菌后的叶片材料铺于灭菌后的滤纸上，吸干其表面残留水分后再用打孔器对叶片打孔取材作为无菌外植体。

进一步的，所述固体培养基为MS培养基，培养基的pH值为5.8-7.0，MS培养组分如下：

20倍浓缩大量元素母液：NH₄NO₃>3>4·7H₂O>2PO₄1.7g；

200倍浓缩微量元素母液：KI 0.083g，H₃BO₃>4·4H₂O>4·7H₂O>2MoO₄·2H₂O>4·5H₂O>2·6H₂O>

200倍浓缩铁盐母液：FeSO₄·7H₂O>2-EDTA·2H₂O>

100倍浓缩有机母液：肌醇5g，烟酸0.025g，盐酸吡哆醇(维生素B6)0.025g，盐酸硫胺素(维生素B1)0.005g；

20倍浓缩钙盐母液：CaCl₂·2H₂O>

进一步的，所述固体培养基的制备方法是：

组分称量后，用蒸馏水溶解并定容到500ml备用；

MS基础培养基的配置：20倍浓缩大量元素母液15ml，200倍浓缩微量元素母液1.5ml，20倍浓缩钙盐母液15ml，200倍浓缩铁盐母液1.5ml，100倍浓缩有机母液1.5ml，9g蔗糖，3g琼脂；

1/2MS培养基的配置：20倍浓缩大量元素母液7.5ml，200倍浓缩微量元素母液1.5ml，20倍浓缩钙盐母液15ml，200倍浓缩铁盐母液1.5ml，100倍浓缩有机母液1.5ml，9g蔗糖，3g琼脂；

使用蒸馏水定容到300ml，再用1M NaOH调节pH至5.8-7.0之间，最后，将其置于121℃高压灭菌锅中灭菌30min。

进一步的，所述步骤2具体方法是：将诱导出的大岩桐幼芽从基部切下，将其垂直插入到具有壮苗培养基的培养瓶中，每瓶接种3-6株，瓶中壮苗培养基的配置为MS+1.0mg/LGA₃+0.2mg/L>

进一步的，所述步骤3具体方法是：将培养出的大岩桐的壮苗从培养瓶中取出，将其垂直插入到生根培养基的组培瓶中，每瓶接种3-6株，瓶中生根培养基的配置为1/2MS+0.1mg/L NAA或1/2MS+0.2mg/L NAA；随后将组培瓶放置于人工光照培养箱中进行生根培养，光照培养箱中光照强度为2000Lux，光照时间为白天16h、夜间8h，温度为25℃，一周时间有根长出。

进一步的，所述步骤4具体方法是：选择生根培养组培瓶中生长健壮的大岩桐再生苗，打开瓶盖，洗去再生苗上的培养基，注意不要伤及根部，将其移栽到装有蛭石的花盆中，用自来水从盆边缘浇下使蛭石湿润不要让水沾到叶片，用透明的盖子盖上保湿放入到光照培养箱中，光照时间为每天12h；在培养箱中炼苗2个月后，再将花盆中的再生大岩桐幼苗取出，最后移栽至松软的土壤中生长，得到再生植株。

本发明的有益效果：本发明利用组织培养快速繁殖技术，保留了原有品种的优良性状，并且能有效快速地增加大岩桐的繁殖系数，不仅能满足市场对大岩桐的需求，又有利于大岩桐资源的保护。对大岩桐外植体消毒，直接用升汞浸泡，操作简单且效果好，提高了工作效率。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是愈伤组织诱导培养过程图；

图2是壮苗培养过程图；

图3是诱导生根培养过程图；

图4是移栽炼苗过程图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

一种重瓣大岩桐组织的培养方法，按照以下步骤进行：

步骤1.培养大岩桐愈伤组织诱导；如图1所示；

步骤2.培养大岩桐的壮苗，得到健壮植株；如图2所示；

步骤3.大岩桐再生幼芽的生根培养，得到带根苗；如图3所示；

步骤4.进行炼苗、移栽，得到再生植株。如图4所示。

其中，培养大岩桐愈伤组织诱导、培养大岩桐的壮苗、大岩桐再生幼芽的生根培养均在固体培养基中进行。

进一步说，步骤1具体为：先获得愈伤组织，将打孔器剪下的小圆形大岩桐叶片外植体平躺放入愈伤组织诱导培养基中，每瓶接种3-6个无菌外植体；大岩桐愈伤组织诱导培养基为MS+2.0g/L 6-BA+0.3mg/L NAA、MS+2.0g/L 6-BA+0.6mg/L NAA、MS+2.0g/L6-BA+0.3mg/L NAA+0.3mg/L2-4D、MS+2.0g/L 6-BA+0.3mg/L 2-4D、MS+2.0g/L6-BA+0.6mg/L 2-4D五种培养基，之后将接种好的大岩桐外植体放置于培养箱中，光照2000Lux，白天16h，夜晚8h，温度为25℃。3-6周后，五种诱导培养基都得到的愈伤组织，其中MS+2.0g/L 6-BA+0.3mg/L NAA诱导效果最好，培养两个月后得到的愈伤组织团最大并且开始分化出幼芽，其他组的愈伤组织团相对较小，而加了2-4D的幼芽分化效果比加了NAA的差，MS+2.0g/L 6-BA+0.6mg/L NAA诱导出的愈伤组织团更小愈伤组织诱导能力较差。三个月后MS+2.0g/L 6-BA+0.3mg/L NAA诱导出来的愈伤组织团上的芽已经有了4片小叶片，整个愈伤组织球上都长满了芽。

进一步说，无菌外植体的获得，按照以下步骤进行：

步骤a、取盆栽大岩桐叶片作为外植体，先用自来水冲洗30分钟，然后移至无菌工作台中；

步骤b、将所述步骤a中处理后的大岩桐叶片外植体在体积分数为75％的酒精中浸泡8s，用蒸馏水冲洗4次；

步骤c、将所述步骤b中处理后的大岩桐叶片外植体在体积分数为0.1％的升汞溶液中浸泡7min，浸泡过程中轻轻振荡使外植体灭菌充分，再使用无菌水冲洗4次，最后将灭菌后的叶片材料铺于灭菌后的滤纸上，吸干其表面残留水分后再用打孔器对叶片打孔取材(小圆形)作为外植体。

进一步说，固体培养基为MS培养基，MS培养组分如下：

20倍浓缩大量元素母液：NH₄NO₃>3>4·7H₂O>2PO₄1.7g；

200倍浓缩微量元素母液：KI 0.083g，H₃BO₃>4·4H₂O>4·7H₂O>2MoO₄·2H₂O>4·5H₂O>2·6H₂O>

200倍浓缩铁盐母液：FeSO₄·7H₂O>2-EDTA·2H₂O>

100倍浓缩有机母液：肌醇5g，烟酸0.025g，盐酸吡哆醇(维生素B6)0.025g，盐酸硫胺素(维生素B1)0.005g；

20倍浓缩钙盐母液：CaCl₂·2H₂O>

进一步说，固体培养基制备方法如下：

组分称量后，用蒸馏水溶解并定容到500ml备用；

MS基础培养基的配置：20倍浓缩大量元素母液15ml，200倍浓缩微量元素母液1.5ml，20倍浓缩钙盐母液15ml，200倍浓缩铁盐母液1.5ml，100倍浓缩有机母液1.5ml，9g蔗糖，3g琼脂；

1/2MS培养基的配置：20倍浓缩大量元素母液7.5ml，200倍浓缩微量元素母液1.5ml，20倍浓缩钙盐母液15ml，200倍浓缩铁盐母液1.5ml，100倍浓缩有机母液1.5ml，9g蔗糖，3g琼脂；

使用蒸馏水定容到300ml，再用1M NaOH调节pH至5.8-7.0之间，最后，将其置于121℃高压灭菌锅中灭菌30min。

进一步说，步骤2具体为：将诱导出的大岩桐幼芽从基部切下，将其垂直插入到具有壮苗培养基的培养瓶中，每瓶接种3-6株，瓶中壮苗培养基的配置为MS+1.0mg/L>3、MS+1.0mg/L>3+0.2mg/L NAA、MS+1.0mg/L>3+0.2mg/L NAA+0.1mg/L 6-BA、MS+1.0mg/L>3+0.2mg/L NAA+0.2mg/L 6-BA、MS+1.0mg/L>3+2.0mg/L KT+0.2mg/L NAA、MS+1.0mg/L>3+0.2mg/L NAA+2.0mg/L 6-BA六种培养基；随后将培养瓶中放置于人工光照培养箱中进行壮苗培养，光照培养箱中光照强度为2000Lux，光照时间为白天16h、夜间8h，温度为25℃，3-5周后，MS+1.0mg/L>3+0.2mg/L NAA的壮苗效果最好，每瓶内有3-4个大苗，且茎杆较老颜色呈紫色有4个节，且每个节上都长出了腋芽；其次是MS+1.0mg/L>3、MS+1.0mg/L>3+0.2mg/L NAA+0.1mg/L 6-BA、MS+1.0mg/L>3+0.2mg/L>

进一步说，步骤3具体为：将培养出的大岩桐的壮苗从培养瓶中取出，将其垂直插入到生根培养基的组培瓶中，每瓶接种3-6株，瓶中生根培养基的配置为1/2MS、1/2MS+0.1mg/L NAA、1/2MS+0.2mg/L NAA、1/2MS+0.3mg/L NAA、1/2MS+0.2mg/L NAA+0.1mg/L 6-BA五种培养基；随后将组培瓶放置于人工光照培养箱中进行生根培养，光照培养箱中光照强度为2000Lux，光照时间为白天16h、夜间8h，温度为25℃，一周左右有根长出，最早生根的是1/2MS+0.1mg/L NAA和1/2MS+0.2mg/L NAA，不过根的分布较散乱，不仅下端切口处能长出根，靠近培养基的地方均有根生成，每个苗生根4-5根，根长2-3cm，不过根较为粗壮不是气生根；1/2MS+0.3mg/L NAA长根速度稍慢，1/2MS+0.2mg/L NAA+0.1mg/L 6-BA与培养基接触的下端无根生成，1个月后上面的节上才长出气生根，1/2MS实验组则是一周左右切口就开始长出细微的白色绒毛，然后伤口处萌发出气生根，根都集中在伤口处；效果最佳的是在培养基配置为1/2MS基础培养基中添加0.1mg/L或0.2mg/L NAA。

进一步说，步骤4具体为：选择生根培养组培瓶中生长健壮的大岩桐再生苗，打开瓶盖，轻轻洗去再生苗上的培养基，注意不要伤及根部，将其移栽到装有蛭石的花盆中，用自来水从盆边缘浇下使蛭石湿润不要让水沾到叶片，用透明的盖子盖上保湿放入到光照培养箱中，光照时间为每天12h；在培养箱中炼苗2个月后，再将花盆中的再生大岩桐幼苗取出，最后移栽至松软的土壤中生长，得到再生植株。最终，大岩桐的再生率可以达到63％。

进一步说，上述所有培养基的pH值为5.8-7.0。

采用本文的大岩桐外植体的消毒方法，其消毒效果好，且简单容易操作；经过多次实验选取了最佳愈伤组织诱导培养基，提高愈伤组织诱导率，并形成愈伤组织团大而芽点多；经过多次实验选取了最佳壮苗培养基，促使重瓣大岩桐幼苗茎秆粗大且每个节上都长出腋芽；经过多次实验选取了最佳生根培养基，促使重瓣大岩桐幼苗生根多而粗；最佳移栽炼苗方法，促使重瓣大岩桐在自然环境下各性状表现良好。

本说明书中的各个实施例均采用相关的方式描述，各个实施例之间相同相似的部分互相参见即可，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处。尤其，对于系统实施例而言，由于其基本相似于方法实施例，所以描述的比较简单，相关之处参见方法实施例的部分说明即可。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本发明的保护范围内。