基于数字模型的椰子耐寒性鉴定方法

摘要

本发明属植物生理学领域，涉及一种基于数字模型的椰子耐寒性鉴定方法，是选取至少20种形态性状差异较大的椰子品系进行冷胁迫处理，获取5个形态指标和10个生理生化指标的变化，建立椰子幼苗耐寒性预测模型，根据耐冷性鉴定预测模型对待测椰子资源进行耐寒性鉴定。本发明通过采集椰子具有代表性的抗寒特征量化的指标，建立抗寒性数学模型，可以定量描述环境因子对抗寒锻炼或脱锻炼的作用，评价现有所有椰子资源的耐寒性，对于开展椰子资源评价和培育具有重要意义，为后续育种或生产应用奠定基础，对海南椰子种质资源研究及相关工作有重要的科研意义。

说明书

技术领域

本发明属作物学、植物生理学领域，涉及一种植物耐寒性鉴定方法，特别的涉及一种基于数字模型的椰子耐寒性鉴定方法。

背景技术

据研究，温度是影响植物生存和生长发育的重要生态因子之一，低温寒害是一种普遍存在的自然灾害，全球每年因低温寒害造成的仅农作物损失就高达千亿美元。植物在抗寒性的适应过程中，其外在形态结构和细胞结构会发生一系列的变化，如叶片萎焉卷曲、叶色变褐等现象。另一方面植物会发生一系列生理生化机制的适应性变化、如电导率会有不同程度的增大；同时，与抗寒性有关主要指标可溶性糖含量等都有明显的变化，这些指标的含量的变化与植物抗寒性有密切的关系；酶活性直接影响着植物体内各生理活动的调节和进行，植物遇低温时体内抗氧化物酶系统(APX、SOD、CAT等)加强、活性显著增强，从而提高植物对胁迫耐受力。从植物研究的手段及研究途径上而讲，建立有效的抗寒性数学模型或评价体系及标准对于开展资源或相关生物研究具有一定的意义。

椰子(Cocos nucifera L.)属棕榈科植物，是热带亚热带地区重要的热带木本油料作物，仅我国海南有超过50万人从事与椰子产业相关的椰子种植、产品加工及科研等工作，其相关产业年产值达70多亿元，是国民经济的重要组成部分之一。

椰子是一种典型的喜温作物，当气温低于13℃时，椰果就会受到寒害，持续的低温天气导致大量椰子树叶片变黄甚至枯死，并出现了严重的落裂果现象，致使产量降低，甚至导致椰树死亡。低温成为阻碍椰子产业快速发展的主要制约因素。自2008年以来，研究人员陆续的开展了椰子低温方面的调查和研究。根据调查结果并结合海南实际情况得出，海南的椰子容易受到寒害影响的结论。因此，开展低温下的椰子研究，对于开展椰子资源评价和培育具有重要意义，也对海南椰子种质资源研究及相关工作有重要的科研意义。

由于植物抗寒性具有复杂性，目前已经建立了不同树种和不同目的的数学模型，如比较不同树种抗寒性发育，预测因种源迁移或气候变化导致的冻害，果园冻害的保护等。然而，与木本植物生长发育的其他生态生理过程相比，有关抗寒性的数学模型的报道相对较少，还未引起模型研究人员足够的重视。椰子作为一种热带重要的木本油料作物，对其抗寒的机制知之甚少，其抗寒数学模型还未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于数字模型的椰子耐寒性鉴定方法，通过采集椰子具有代表性的抗寒性量化指标，建立抗寒性数学模型，可以定量描述环境因子对抗寒锻炼或脱锻炼的作用，评价现有所有椰子资源的耐寒性，为后续育种或生产应用奠定基础。

本发明所采用的技术方案：

一种基于数字模型的椰子耐寒性鉴定方法，其具体步骤如下：

1)、椰子冷胁迫处理时间确定

选择生产应用广泛的椰子品系为材料，选取生长健壮、均匀一致的幼苗分别移入两个不同温度的温室，分别进行对照和冷胁迫处理(对照为常温，温度为25～30℃；因13℃以下温度为椰子尤其是海南椰子受害的常见低温，冷胁迫温度一般取5～15℃)，处理以温度为单因素进行完全随机设计，控制相对湿度在75～85％、光照强度位1800～2500μmol·m^-2·s^-1。处理期间记录椰子幼苗的形态性状，包括植株高度、茎粗、叶片长度、叶色，直至处理与对照间出现明显形态差异为止。用平均数差异显著性测验检验相同处理天数时，处理与对照各指标的差异显著性，即α＝0.05，将有1个以上指标表现出明显差异的时间点确定为冷胁迫处理时间T。

2)、冷胁迫处理

选取至少20种形态性状差异较大的椰子品系作为处理材料，冷胁迫处理温度选用5℃、10℃、15℃，处理时间为步骤1)所确定的冷胁迫处理时间T，其它条件与方法同步骤1)。以品系和处理温度为因素进行完全随机区组设计。

3)、冷害指数的测定

冷处理结束后，以单株为单位按照如下分级标准进行分级：

冷害分级标准:0级为无冷害症状；1级为轻度冷害；有少部分(约1/5)叶片的叶尖、叶缘变黄；2级为中度冷害，有约1/2叶片叶尖、叶缘变黄；3级为重度冷害，大部分叶尖、叶缘焦黄；4级为极重度冷害，叶落、茎枯，最终死亡。

计算冷害指数(SI)，计算公式如下：

SI＝∑(冷害级值×相应冷害级值株数)/(总株数×冷害最高级值)×100％

4)、生长形态指标测定

按常规方法测量单株的生长形态，包括鲜重、株高、茎粗、叶面积、叶片数。所述株高为生长点到根部的长度；所述茎粗指紧临最后一叶下面茎的粗度。

5)、理化性状指标测定

测定单株的理化指标，包括可溶性蛋白质含量、丙二醛(MDA)含量、细胞膜相对透性的变化、细胞保护酶活性中超氧化物歧化酶(SOD)活性、过氧化物酶(POD)活性、过氧化氢酶(CAT)活性和抗坏血酸还原酶(APX)活性。

可溶性蛋白质含量采用考马斯亮蓝G-250染色法(Bradford,M.M.A.1976.Biochem,72:248-254)测定；丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸比色法(Ohkawa,H.,Ohishi,N.andYagi,Y.1979.Anal Biochem,95:51–358.)测定；细胞膜相对透性的变化采用电导仪法，参照Dionisio-Sese等(Dionisio-Sese,M.L.and Tobita,S.1998.Plant Sci.,135:1-9)的方法测定；细胞保护酶活性中超氧化物歧化酶(SOD)活性参照Beauchamp等(Beauchamp,C.and Fridovich,I.1971.Anal Biochem.,44:151–155)方法测定；过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)活性的测定参照Chance等(Chance,B.andMaehly,A.C.1955.Methods Enzymol,2:764–817)的方法；抗坏血酸还原酶(APX)的测定参照Nakano等(Nakano,Y.and Asada,K.1987.Plant and Cell Physiol,28:131-140)的方法。

6)、耐冷系数CRI(Cold Response Index)值的计算

统计单一性状指标观察值，计算每一单项指标的耐冷系数CRI，计算公式如下：

CRI＝(冷胁迫处理下性状表型值/正常条件下性状表型值)×100％

7)、耐冷性鉴定预测模式的建立

利用DPS软件(唐启义和冯明光.2002.实用统计分析及其DPS数据处理系统,北京:科学出版社)对15个单项指标的耐冷系数CRI进行主成份分析。计算各综合指标的贡献率(根据各贡献率即可知道各综合指标的相对重要性)，取贡献率之和超过85％的前n项综合指标，利用权重与单项指标的耐冷系数，求出每一椰子品系各项综合指标值。利用下面公式求出每一品系各综合指标的隶属函数值：

u(x_j)＝(X_j-X_min)/(X_max-X_min)j＝1,2,…n

式中X_j表示第j个综合指标值；X_min表示第j个综合指标的最小值；X_max表示第j个综合指标的最大值。

根据各综合指标的贡献率的大小用下面公式算出各综合指标的权重：

式中W_j值表示第j个综合指标在所有综合指标中的重要程度(权重)；pj为各品系第j个综合指标的贡献率。

根据各综合指标的隶属函数和权重，计算各品系的耐冷性综合评价值D(评价综合耐冷能力的大小)：

以耐冷性综合评价值(D)作因变量、各单项指标的耐冷系数CRI作自变量，利用DPS软件按逐步回归的方式建立最优回归方程，调整方程Fx的临界值使相关系数R达到最大，控制方程的方差分析F值的显著水平≦0.05，建立椰子品系耐冷性鉴定预测模型，采用下式对椰子品系耐冷性进行判断：

8)、椰子资源的耐冷性鉴定

将待测椰子资源按建立耐冷性鉴定预测模型的条件与设计进行处理，分别测定耐冷性鉴定预测模型中所要求的自变量指标，计算待测椰子资源的耐冷性综合评价值D，根据D值的大小判定待测椰子资源的耐寒性。

本发明通过采集椰子具有代表性的抗寒性量化指标，建立抗寒性数学模型，可以定量描述环境因子对抗寒锻炼或脱锻炼的作用，评价现有所有椰子资源的耐寒性，对于开展椰子资源评价和培育具有重要意义，为后续育种或生产应用奠定基础，对海南椰子种质资源研究及相关工作有重要的科研意义。

附图说明

图1是不同温度下的丙二醛含量。

图2是不同温度下的可溶性蛋白含量。

图3是不同温度下的脯氨酸含量。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例一

选取云南高种椰子苗6株，标记为Y1、Y2、Y3、Y4、Y5、Y6，按建立耐冷性鉴定预测模型的条件与设计进行处理，分别测定耐冷性鉴定预测模型中所要求的自变量指标，计算Y1、Y2、Y3、Y4、Y5、Y6的耐冷性综合评价值D，分别为：Y1＝80.48、Y2＝70.48、Y3＝80.99、Y4＝78.95、Y5＝58.62、Y6＝96.61。根据耐冷性鉴定预测模型的判别，Y1、Y2、Y3、Y4和Y6属于耐寒性椰子类型(D≧68)，Y5属于较耐寒性椰子类型(52<D<68)。

在对6株云南高种椰子苗进行5℃、10℃、15℃冷胁迫的同时，检测其丙二醛、可溶性蛋白和脯氨酸的含量，结果如图1、图2、图3。分析表明，Y1、Y2、Y3、Y4和Y6属于耐寒性椰子类型，Y5属于较耐寒性椰子类型，与采用耐冷性鉴定预测模型的鉴定结果基本一致。

实施例二

在海南省文昌市椰子研究所的苗圃内选取20株不同来源地的椰子苗，按建立耐冷性鉴定预测模型的条件与设计进行处理，分别测定耐冷性鉴定预测模型中所要求的自变量指标，计算各株椰子苗的耐冷性综合评价值D，结果见表1。

通过拟合半致死低温，采用半致死低温测评的方式对20株椰子苗进行检测，结果见表1。

表1不同来源地椰子苗的耐寒性情况

项目来源类型R²LT50D值YZ1海南文昌、高种1.003.4554.44YZ2马来西亚、矮种0.995.2939.13YZ3马来西亚、矮种1.005.9741.66YZ4泰国、矮种1.006.8742.69YZ5泰国、甜椰1.007.9650.51YZ6云南西双版纳0.993.8780.48YZ7云南西双版纳0.993.8070.48YZ8云南西双版纳0.993.3980.99YZ9云南西双版纳1.003.3578.95YZ10云南西双版纳1.003.1458.62YZ11云南西双版纳1.003.5896.61YZ12越南、矮种1.006.8246.65YZ13越南、矮种1.006.7039.03YZ14越南、矮种1.0007.1646.96YZ15海南万宁、矮种0.995.3651.81YZ16海南万宁、高种0.993.3775.86YZ17海南三亚、高种1.003.2361.81YZ18海南三亚、矮种0.995.1046.84YZ19海南琼海、矮种1.005.0848.01YZ20海南琼海、高种0.993.0760.58

结果分析表明，不同来源区域的椰子苗的耐寒性差异明显，其中，YZ6、YZ7、YZ8、YZ9、YZ11、YZ16的D值大于68，属于耐寒性椰子类型；YZ1、YZ10、YZ17、YZ20的D值大于52，但小于68，属于较耐寒性椰子类型；YZ2、YZ3、YZ4、YZ5、YZ12、YZ13、YZ14、YZ15、YZ18、YZ19的D值小于52，属于不耐寒性椰子类型。通过对比发现，采用耐冷性鉴定预测模型的耐寒D值对椰子进行耐寒性鉴定，与半致死低温测评的结果基本一致。

以上所揭露的仅为本发明的较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属于本发明所涵盖的范围。