法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2020-08-07
授权
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2020-07-14
著录事项变更 IPC(主分类):G01N21/78 变更前: 变更后: 申请日:20171120
著录事项变更
2018-04-24
实质审查的生效 IPC(主分类):C01G51/04 申请日:20171120
实质审查的生效
2018-03-30
公开
公开
技术领域
本发明涉及纳米材料、催化及分析化学领域,具体包括一种实现一锅法葡萄萄显色检测的新策略。
背景技术
近年来,四氧化三钴作为一种具有重要工业用途的金属氧化物,已经引起了各领域的广泛关注。科研人员利用多种方法合成了纳米级四氧化三钴,凭借其独特的结构和性能,将其广泛应用在了电池、电容器、免疫分析、催化等领域。Wei等人在《Microwave-Assisted Synthesis of Mesoporous Co3O4>3O4纳米片,并将其用于电池(ACS>2015, 7,3306-3313)。Rao等人在《Ultralayered Co3O4>3O4纳米片,并将其用于电容器(The>Physical> 2011, 115, 15646-15654)。Zhang等人在《Co3O4>3O4纳米粒子,并将其用于免疫分析(ACS>Materials>2014, 6, 1959-1970)。Yuichi等人在《Morphology Effects ofCo3O4>3O4纳米晶体,并将其用于催化(Catalysis>2011, 1, 920-922)。He等人在《Peroxidase-Like Activity of Co3O4>3O4纳米粒子,并将其用催化(Nanoscale>3O4>3O4纳米棒,并将其用于催化(ACS>3O4>
葡萄糖是一种重要的生命物质,是生物的主要供能物质和新陈代谢的关键中间产物。人体血液中的葡糖糖(血糖)含量的相对恒定对维持人体的正常生理机能有着重要意义。糖尿病是一种高血糖症,严重威胁着人类健康。另外,血糖值低于2.8 mmol/L时可诊断为低血糖,多见于甲状腺功能低下、肾上腺皮质功能低下、肝功能低下、慢性腹泻等患者。因此,血糖的测定及早期诊断对相关疾病的防治有着深远的意义。常见的葡萄糖显色检测是利用葡萄糖氧化酶先氧化葡萄糖生产H2O2,然后加入具有仿过氧化物酶活性的纳米材料,催化H2O2间接实现对葡萄糖的检测。Liu等人在《A>2O3-Ordered>2O3复合材料实现两步法检测葡萄糖。Shen等人在《Ultrasmall>
综上所述,现有的报道在检测葡萄糖时需加入葡萄糖氧化酶,通过两步法实现对葡萄糖的检测,过程繁琐,并且酶对pH的范围要求高,反应条件比较苛刻,在反应完成后不能对酶和材料进行回收。为实现一锅法检测,人们通常采用改变具有仿过氧化物酶活性的纳米材料的活性pH范围来实现一锅法(Han, L. et>, Au@Ag Heterogeneous Nanorodsas Nanozyme Interfaces with Peroxidase-Like Activity and Their Applicationfor One-Pot Analysis of Glucose at Nearly Neutral pH. ACS>Interfaces>2015, 7>
发明内容
本发明的目的是提供一种实现一锅法葡萄萄显色检测的新策略。
为实现上述目的,本发明采用的技术方案为:
一种以牛血清蛋白模板合成四氧化三钴纳米球的方法,其特征在于,该方法包括如下步骤:
(1) 将牛血清蛋白与含有二价钴离子的水溶液混合均匀,孵育1小时;
(2) 向上述混合溶液中加入一定量的硼氢化钠并混匀,振荡反应一段时间;
(3) 将上述反应液离心,去除含有未反应成分的上清液,收集沉淀,4 °C保存以备用;也可通过透析或过滤的方法收集纯化四氧化三钴纳米球。
优选是,所述含有二价钴离子的水溶液可由醋酸钴、氯化钴等配制而成。
上述的四氧化三钴纳米球的应用,其特征在于:所述四氧化三钴纳米球具有仿过氧化物酶的催化活性,可作为分析检测的催化剂;所述的四氧化三钴纳米球具有磁性,可回收利用;所述的四氧化三钴纳米球具有官能团可修饰生物酶,并改变其活性pH范围。
优选是,所述四氧化三钴纳米球修饰葡萄糖氧化酶后可作为催化剂通过一步法实现葡萄糖检测。
所述检测葡萄糖时加入有机显色剂;所述有机显色剂为2,2’-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺盐(ABTS)或3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)。
本发明的效果是:
1. 本发明利用生物模板法及一步法合成了四氧化三钴纳米球,合成方法简单、温和、环保,解决了传统方法合成四氧化三钴纳米球的过程复杂、能耗大、形貌难以控制等缺点。
2. 本发明中基于牛血清蛋白模板的四氧化三钴纳米球具有磁性,可回收利用。
3.本发明中基于牛血清蛋白模板的四氧化三钴纳米球其表面具有可修饰葡萄糖氧化酶的官能团,并能改变葡萄糖氧化酶活性pH范围,从而实现新颖的检测策略。
4.本发明所采用的生物模板为牛血清蛋白,对人体无毒无害,是一种绿色环保的生物模板,并且通过生物模板法合成的四氧化三钴纳米球具有良好的生物相容性,在生物标记、免疫分析、生物传感等生化分析领域将具有良好的应用前景。
附图说明
图1为本发明实施例提供的四氧化三钴纳米球的合成过程及GOx固定化示意图。
图2为本发明实施例提供的四氧化三钴纳米球的透射电镜照片。
图3为本发明实施例提供的四氧化三钴纳米球的以ABTS为底物的仿酶活性效果图。
图4为本发明实施例提供的四氧化三钴纳米球的以OPD为底物的仿酶活性效果图。
图5为本发明实施例提供的四氧化三钴纳米球仿酶活性的pH优化效果图。
图6为本发明实施例提供的GOx修饰前后的pH优化效果图。
图7为本发明实施例提供的显色法定量检测葡萄糖的标准工作曲线。
具体实施方式
为了深入地说明本发明的内容,下面将进一步列举一些实施例,但本发明不局限于所列举的实施例。下列实施例中具体实验条件或方法如未注明,均按本领域的常规条件或方法进行。
实施例1
基于牛血清蛋白模板的四氧化三钴纳米球的制备:
(1) 将牛血清蛋白(终浓度0.2 mg/mL)与氯化钴的水溶液(终浓度5 mM)混合均匀,室温下孵育1 h;
(2) 向上述混合溶液中加入硼氢化钠的水溶液并混匀,振荡反应5 h;
(3) 将上述反应液离心,去除含有未反应成分的上清液,收集沉淀,4°C保存以备用;也可通过透析或过滤的方法收集纯化四氧化三钴纳米球。具体合成过程如图1 所示。
实施例2
四氧化三钴纳米球的形貌分析:
将四氧化三钴纳米球的悬浮液滴于铜网上,37℃干燥后利用透射电子显微镜分析其形貌。
如图2所示,得到的四氧化三钴纳米球形貌均一,平均尺寸大小约50 nm。
实施例3
四氧化三钴纳米球的仿酶活性:
实验体系a:催化反应体系包含H2O2(1>
另做照实验:对照实验b,以等量的牛血清蛋白代替四氧化三钴纳米球,在与上述实验体系同样条件下静置20分钟后记录光谱图。
如图3所示,实验体系a在416 nm附近显示出明显的峰,比实验体系b高出很多,说明牛血清蛋白本身没有催化活性。综上所述,表明本发明制备的四氧化三钴纳米球具有良好的催化活性。
为进一步证明四氧化三钴纳米球的仿酶活性,以另一种有机显色剂OPD做底物来代替ABTS,分别以四氧化三钴纳米球(实验体系a)、BSA(实验体系b)作催化剂,其他实验条件与上述实验一致,光谱扫描范围范围300−800 nm。
如图4所示,实验体系a在450 nm附近显示出明显的峰,而实验体系b在450 nm附近无明显的峰,说明四氧化三钴纳米球具有明显的仿过氧化物酶的活性而BSA本身对OPD无催化活性。
实施例4
四氧化三钴纳米球仿酶活性的pH优化:
催化反应体系为包含H2O2(1>
实施例5
修饰葡萄糖氧化酶的四氧化三钴纳米球的制备:
(1) 将四氧化三钴溶于1mM的氨基甲酸叔丁酯溶液中,放置2h,水洗,磁性分离;
(2) 将上述反应得到的四氧化三钴加入到1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二亚胺的 混合液中,避光反应5h,磁性分离,水洗,干燥;
(3) 将上述反应得到的四氧化三钴加入到葡萄糖氧化酶溶液中,4℃反应过夜,磁性分离,得到修饰葡萄糖氧化酶的四氧化三钴纳米球。具体合成过程如图1 所示。
实施例6
GOx修饰前后的pH活性优化:
催化反应体系为包含葡萄糖(1 mM)、葡萄糖氧化酶(20 µg/mL)、四氧化三钴纳米球(20µg/mL)和不同pH的缓冲液(1.0−11.0),反应20分钟后,离心,取出上清液,然后加入辣根过氧化物酶HRP(20 µg/mL)、有机显色剂OPD(0.5 mM)和醋酸-醋酸钠缓冲液(pH 4.0),在37 °C下反应20分钟后,利用酶标仪检测其450 nm处的吸光值。如图6所示,GOx在pH 7.5处表现出最佳的氧化物酶活性而在pH 4.0左右活性大幅降低。
催化反应体系为包含葡萄糖(1 mM)、葡萄糖氧化酶修饰的四氧化三钴纳米球(20µg/mL)和不同pH的醋酸-醋酸钠缓冲液(1.0−11.0),反应30分钟后,离心,取出上清液,然后加入HRP(20 µg/mL)、有机显色剂OPD(0.5 mM)和醋酸-醋酸钠缓冲液(pH 4.0),在37 °C下反应20分钟后,利用酶标仪检测其450 nm处的吸光值。如图6所示,葡萄糖氧化酶修饰四氧化三钴纳米球在pH3.0 −10.0的范围内表现出80%以上的氧化物酶活性。
实施例7
催化反应体系为包含不同浓度的葡萄糖(0−10 mM)、葡萄糖氧化酶的修饰四氧化三钴纳米球(20 µg/mL)、有机显色剂OPD(0.5 mM)和醋酸-醋酸钠缓冲液(pH 5.0)。在37 °C下反应20分钟后,利用酶标仪检测其450 nm处的吸光值,并由此绘制出葡萄糖标准工作曲线。如图7所示,直到9mM工作曲线呈现良好的线性关系。
机译: 包含多肽的免疫原性组合物;诱导针对表皮葡萄球菌的免疫应答的方法;诱导针对金黄色葡萄球菌的免疫应答的方法;一种检测和/或鉴定表皮葡萄球菌的方法;一种检测和/或鉴定表皮葡萄球菌抗体的方法
机译: 天然氘化分子的检测和区分定性和定量组成的新方法,一种用于实现此过程和应用的设备,尤其是对葡萄酒进行分装的检测
机译: 通过开发一种新的显色剂来实现彩色照片的方法以及该方法的实现