Implementación de método para detección de microorganismos en vino blanco

摘要

Las técnicas moleculares proporcionan una herramienta excepcional para la detección, identificación y caracterización de microorganismos que están implicados en ecosistemas ambientales y de alimentos. Sin embargo, el estudio de la biodiversidad microbiana todavía está obstaculizado por la dificultad de identificar y de caracterizar los microorganismos sin aislamiento previo en medios de cultivo ya que durante el cultivo o el uso de medios de enriquecimiento, se puede alterar la estructura de la comunidad imponiendo nuevas condiciones selectivas. Es por ello que no se puede tener un conocimiento completo de la diversidad microbiana de un ecosistema dado, ya que sólo se puede caracterizar una parte, las cepas cultivables. Entre los diferentes organismos que se pueden identificar por estas técnicas moleculares se encuentran las levaduras. udLas levaduras cumplen un papel fundamental en la elaboración del vino ya que son responsables de la conversión de azúcares fermentables en etanol y anhídrido carbónico. A partir de este proceso se producen una serie de metabolitos en menor cantidad que aportan características sensoriales fundamentales al vino. Tradicionalmente la fermentación alcohólica del mosto se producía de forma espontánea, a partir de levaduras “salvajes”, o autóctonas, presentes en las uvas. De este proceso fermentativo espontáneo se obtienen vinos poco reproducibles, con elevados riesgos de alteraciones microbiológicas y químicas (ej. picados acéticos, defectos aromáticos, ralentizaciones o paralizaciones en el proceso de fermentación, etc.), y, en general, con tiempos de fermentación más largos. En su mayoría, las levaduras seleccionadas actuales corresponden a aislados del género Saccharomyces, habitualmente de la especie Saccharomyces cerevisiae ya que se considera un microorganismo domesticado por encontrarse de forma abundante en los ambientes industriales en los que se realizan fermentaciones alcohólicas, mientras que es relativamente escasa en ambientes naturales o no alterados por actividades humanas. Sin embargo, durante el proceso de vinificación en sus múltiples etapas puede producirse un crecimiento microbiano no deseado que altere la calidad organoléptica del vino. Dentro de estos microorganismos se encuentran levaduras no-Saccharomyces que pertenecen a diferentes géneros (Cocolin et al., 2003 y Carrascosa et al., 2005). udEn los últimos años, se han realizado muchos estudios describiendo la aplicación de herramientas de biología molecular para diferenciar y caracterizar levaduras utilizadas en la fermentación industrial (Esteve-Zarzoso et al., 1999), siendo una de las técnicas más utilizadas para ello la reacción en cadena de la polimerasa (Polymerase Chain Reaction, PCR). Este método es capaz de amplificar un segmento de ADN en un billón de copias idénticas y de conseguir la detección específica de secuencias de ADN posibilitando la identificación de microorganismos contaminantes (Ibeas et al., 1996 y Suarez et al., 2007). Esta técnica consta de tres pasos básicos: Desnaturalización, apareamiento, y extensión que constituyen un ciclo, y son repetidos de 30 a 40 veces dando como resultado la copia de una porción de la molécula de ADN de doble cadena para producir dos cadenas ADN hijas, después de dos ciclos habrá 4 copias, etc., siendo este un aumento exponencial en el número de copias. Una vez obtenido el amplificado de dicho ADN se puede analizar mediante electroforesis en gel de poliacrilamida o agarosa. udAdemás de esta técnica se utiliza otro método molecular para la identificación de microorganismos basado en la determinación del polimorfismo de longitud de los fragmentos de restricción (restriction fragment length polymorphism, RFLP), mediante su empleo se pueden diferenciar los organismos por el análisis de los patrones de ruptura que se generan en un sitio específico del genoma del microorganismo, cuando es cortado por enzimas de restricción o endonucleasas y luego son comparados en gel por medio de electroforesis. La aparición de estos fragmentos polimórficos es debido a que los organismos de diferentes especies, e incluso cepas, difieren en la distancia de los sitios de clivaje para cada enzima de restricción. (Ratón, 2004) udLa extracción de ADN de cualquier organismo, a un bajo coste y sin un gran esfuerzo de trabajo en el laboratorio obteniendo una concentración y pureza suficiente en poco tiempo son factores importantes. Esto se hace relevante para aquellos investigadores dedicados a la clasificación, identificación y filogenia de las levaduras, donde está demostrado que las técnicas que existen tanto bioquímicas, fisiológicas, metabólicas y genéticas no alcanzan a ser suficientes para identificar definitivamente el género o la especie (Esteve-Zarzoso et al., 1999). Se han descrito numeroso métodos de extracción de ADN de levaduras diferenciándose básicamente en el tipo de procedimiento utilizado para la lisis de la pared celular de la levadura, y el protocolo utilizado para la purificación del ADN. Casi todos los métodos que se emplean son variaciones tanto de procedimientos de agitación con perlas de vidrio (Hoffman y Winston, 1987; Ros-Chumillas et al.,2007) como de lisis de pared celular por tratamiento enzimático (Querol et al., 1992). La eficacia en estos métodos de extracción de ADN se ve afectada por diversos factores como son una lisis incompleta de la célula, la presencia de inhibidores enzimáticos, la posible degradación del ADN o la absorción del ADN a materiales externos. Es por ello, que el método de extracción de ADN que se utilice es de vital importancia para lograr los resultados con la mejor calidad en análisis posteriores. udEn el caso de la industria vinícola, ésta cada vez se hace más globalizada y competitiva y la extracción de levaduras juega un papel fundamental teniendo los productores de vino que afrontar el desafío de mejorar las características organolépticas de sus vinos y desarrollar la tipicidad para vinos aromáticos complejos. Actualmente, la elaboración de vinos es una actividad de gran interés económico en Chile abarcando principalmente la parte central del país. Generalmente, las vinificaciones se realizan mediante la inoculación de levaduras comerciales provenientes de diferentes orígenes, de esta forma se pretende asegurar la correcta realización de la fermentación así como la obtención de vinos de calidad más uniforme a lo largo de las diferentes campañas (Ribéreau-Gayon, 1985; Giudici y Zambonelli, 1992; Fleet y Heard, 1993) con el inconveniente de la pérdida de tipicidad y originalidad del producto. En el caso de Chile, su aislamiento y disposición geográfica hace posible que puedan existir cepas autóctonas chilenas con propiedades tecnológicas que pueden ser idóneas para su utilización como inóculos en futuros productos, agrupando así, las características beneficiosas de la inoculación pero manteniendo la tipicidad de la zona. Uno de los grandes desafíos para la industria vitivinícola chilena es el desarrollo de una metodología específica para sus vinos pues Implementación de método para detección de microorganismos en vino blanco que al tratarse de una matriz compleja los métodos de extracción deben de ser lo más seguros, fiables y eficientes para obtener muestras puras de ADN. udEl objetivo de este proyecto es implementar una nueva técnica en la extracción de ADN detectando la levadura Saccharomyces cerevisiae comercial EC1118 facilitando el procesamiento de la matriz, que en este caso es de vino blanco. Para ello en primer lugar se hará crecer la levadura EC1118 en medio de cultivo YEPD y se aplicará el método convencional de extracción mediante PowerSoil DNA isolation kit, se hará PCR y RFLP para verificar que se ha extraído ese ADN y se guardará como positivo para experiencias posteriores. En la segunda parte, se volverá a preparar esta levadura para ensayo y tras su recuento en cámara de Neubauer se escogerá un volumen que permita obtener esas levaduras en 200 mL de vino blanco para una serie de concentraciones dadas. Se procederá a extraer el ADN con el método tradicional y con el nuevo, PowerWater DNA isolation kit y se realizará la PCR para cada dilución con los dos métodos. udLos resultados de este proyecto muestran que al aplicar el PowerWater DNA isolation kit se obtienen amplificados para un número mayor de concentraciones y las bandas amplificadas son más nítidas, siendo por tanto más eficaz y presentando mayor calidad el ADN extraído. Sin embargo, el método de aplicación es más complicado y delicado necesitando más tiempo para llegar al resultado final siendo además su coste más elevado. Estos resultados abren las puertas a la instauración de este método de extracción de ADN y poder avanzar así en la diferenciación y caracterización de diferentes organismos, en este caso en particular las levaduras para su uso en la industria vitinícola.