还原性糖链和糖蛋白O‑糖链的氨基吡唑啉酮类异二官能团试剂衍生化及分离分析方法

摘要

本发明具体涉及还原性糖链的氨基吡唑啉酮类异二官能团试剂衍生化方法，具体为还原性糖链与氨基吡唑啉酮类异二官能团试剂，通过两种反应模式衍生化，一是在酸性条件下还原胺化生成具有活性亚甲基的糖链衍生物；二是在碱性条件下发生迈克尔加成反应，生成具有伯氨基的糖链衍生物。本发明的衍生化方法产生的两种衍生物均携带不同活性基团，可进行糖链的进一步分析及研究，衍生化效率高，通用性强。本发明同时还提供了在碱性条件下，氨基吡唑啉酮类异二官能团试剂对糖蛋白O‑糖链的释放及同时标记的方法，得到具有伯氨基的O‑糖链衍生物，大大简化了样品制备过程。

说明书

技术领域

本发明属于糖生物学技术领域，具体涉及还原性糖链和糖蛋白O-糖链的氨基吡唑啉酮类异二官能团试剂衍生化及分离分析方法。

背景技术

糖类物质作为构建生命体的第三类生物大分子，具有十分重要生物学功能，如为生物体提供能量物质，是构成植物细胞壁的主要组成部分，在细胞的分化、发育、肿瘤的发生与细胞间的信号转导、识别、免疫应答等发挥着重要的作用。糖基化是蛋白质翻译后修饰中最主要的修饰之一，在蛋白质翻译调控、蛋白质降解等过程中起着非常重要的作用。50％以上的蛋白质以糖蛋白的形式存在，并且越来越多的研究表明，糖基化异常可导致人类疾病。在临床治疗过程中，使用的抗体药物均带有糖基化。

目前，大量的研究表明，糖蛋白上的糖链的异常变化和许多疾病有关，因此以研究糖链的结构和功能为主要内容的功能糖组学吸引了生命科学领域广泛的关注，尤其是以糖链作为研究对象来筛选癌症血清标志物的研究，为人类癌症的早期诊断、预后、治疗、反应预测和群体筛查开辟了新的途径，例如，糖蛋白的糖链末端常常会发生唾液酸化修饰，它不仅可稳定糖链结构，而且与许多恶性疾病的发生发展密切相关；因此对糖链结构进行分离和结构解析显得十分的重要。

但由于天然存在的糖类物质本身不含有发色基团，用高效液相色谱仪对其进行分离检测遇到困难，而衍生化不仅可以使糖链带上紫外或荧光基团，提高检测灵敏度，又可以降低糖链极性，使糖链在色谱柱上保留，便于糖链分离。衍生化技术通过给糖链C-1端半缩醛结构带上疏水性化学基团，改善糖链结构的疏水性，提高糖类物质的离子化效率，进而可提高糖类物质在MS检测分析中的灵敏度。

目前针对还原性糖链C-1末端醛基的柱前衍生化技术主要有：(1)还原胺化法，例如3-氨基-9-乙基咔唑(简称AEC)衍生化；(2)与吡唑啉酮的碱性缩合反应，如，1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(简称PMP)；(3)肼类试剂成腙反应，常用苯肼、吉拉德T试剂等。但是，上述衍生化试剂都只带有一个官能团，在对糖链衍生化之后，衍生产物缺乏游离的活性官能团，无法用于糖链的进一步分析，如糖芯片构建、磁球固定化及荧光标记等。

随着糖组学的发展，为了便于糖链的进一步分析，用于糖链衍生化的双官能团衍生化试剂开发非常重要，这类试剂具有两个活性官能团，其中一个官能团可以用于标记糖链的还原端，另一个官能团可为后续糖芯片构建、磁球固定化及荧光标记等提供反应位点，用于功能性分析。这类试剂报道较少，主要有2，6-二氨基吡啶(简称DAP)和N-氨基乙基-2-氨基苯甲酰胺(简称AEAB)这两种，但是它们均携带两个氨基，易产生竞争作用，与糖链反应时选择性不强，且只能应用于还原性糖链的衍生化，对于糖蛋白上的O-糖链并不适用。

鉴于以上问题，开发新的、衍生化效率更高的利用具有两个不同活性官能团的异二官能团试剂对还原性糖链进行衍生化的方法对于糖组学的研究具有重要意义。

发明内容

为了解决现有技术中对还原性糖链进行衍生化的方法反应条件苛刻，衍生化效率不高，且衍生化试剂仅含一个活性官能团，不能实现糖链的进一步分析等缺陷，本发明一方面提供还原性糖链的氨基吡唑啉酮类异二官能团试剂衍生化方法，通过以下技术方案实现：

还原性糖链的氨基吡唑啉酮类异二官能团试剂衍生化方法，具体为还原性糖链与氨基吡唑啉酮类异二官能团试剂3-氨基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮，在酸性条件下发生还原胺化反应，生成具有活性亚甲基的糖链衍生物；或在碱性条件下发生迈克尔加成反应，生成具有伯氨基的糖链衍生物；

所述还原性糖链为游离还原性糖链或糖蛋白上释放的糖链，其中，所述游离还原性糖链为从植物、动物中提取的还原性糖链或合成得到的还原性糖链。

进一步地，本发明所述的还原性糖链的氨基吡唑啉酮类异二官能团试剂衍生化方法，包括以下步骤：

步骤(1A)：将还原性糖链加入3-氨基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮与质子型溶剂配制得到的溶液中，所述3-氨基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮在溶液中的浓度小于1mol/L,所述反应体系中3-氨基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮与还原性糖链的摩尔浓度之比大于或等于10:1；

步骤(2A)：向反应体系中加入有机弱酸，所述有机弱酸在反应体系中的体积百分比为7％～25％，反应体系的pH大于3且小于6，加热至65℃～75℃，反应1小时～2小时；

步骤(3A)：反应结束后，向步骤(2A)的反应体系中加入氰基硼氢化钠，所述氰基硼氢化钠与还原性糖链的物质的量之比大于或等于20:1；

步骤(4A)：维持65℃～75℃，反应0.5小时～1小时，后处理得到带有活性亚甲基的糖链衍生物。

进一步地，本发明所述的还原性糖链的氨基吡唑啉酮类异二官能团试剂衍生化方法，包括以下步骤：

步骤(1A)：将还原性糖链加入3-氨基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮与DMF或DMSO配制得到的溶液中，所述3-氨基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮在溶液中的浓度为0.625mol/L,所述反应体系中3-氨基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮与还原性糖链的摩尔浓度之比为25:1；

步骤(2A)：向反应体系中加入冰醋酸，所述冰醋酸在反应体系中的体积百分比为15％，反应体系的pH大于3且小于6，加热至70℃，反应2小时；

步骤(3A)：反应结束后，向步骤(2A)的反应体系中加入氰基硼氢化钠，其中所述氰基硼氢化钠与还原性糖链的物质的量之比为30:1；

步骤(4A)：维持70℃，反应1小时，后处理得到具有活性亚甲基的糖链衍生物。

进一步地，本发明所述的还原性糖链的氨基吡唑啉酮类异二官能团试剂衍生化方法，包括以下步骤：

步骤(1B)：将还原性糖链加入3-氨基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮与质子型溶剂配制得到的溶液中，所述3-氨基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮在溶液中的浓度小于1mol/L,所述反应体系中3-氨基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮与还原性糖链的摩尔浓度之比大于或等于5:2；

步骤(2B)：向反应体系中加入氢氧化钠或氨水，直至反应体系pH大于9.5，加热至40℃～70℃，反应1小时～1.5小时；

步骤(3B)：反应结束后，调节反应混合物pH至中性，后处理得到具有伯氨基的糖链衍生物。

进一步地，本发明所述的还原性糖链的氨基吡唑啉酮类异二官能团试剂衍生化方法，包括以下步骤：

步骤(1B)：将还原性糖链加入3-氨基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮与DMF或DMSO配制得到的溶液中，所述3-氨基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮在溶液中的浓度为0.25mol/L～0.75mol/L，所述反应体系中3-氨基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮与还原性糖链的摩尔浓度之比为3:1；

步骤(2B)：向反应体系中加入氢氧化钠或氨水，直至反应体系pH＝10，加热至50℃，反应1.5小时；

步骤(3B)：反应结束后，调节反应混合物pH至中性，后处理得到具有伯氨基的糖链衍生物。

进一步地，本发明所述的还原性糖链的氨基吡唑啉酮类异二官能团试剂衍生化方法中，还原性糖链与氨基吡唑啉酮类异二官能团试剂3-氨基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮在酸性条件下衍生化得到的具有活性亚甲基的糖链衍生物用石墨碳固相萃取柱进行初步纯化；

所述石墨碳固相萃取柱纯化过程为：石墨碳固相萃取柱先用乙腈活化，再用双蒸水平衡，然后将样品上样，上样后先用双蒸水洗脱除盐，然后，用合适浓度的乙腈水溶液进行洗脱，收集洗脱液，减压浓缩得纯化后的、具有活性亚甲基的糖链衍生物；

还原性糖链与氨基吡唑啉酮类异二官能团试剂3-氨基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮在碱性条件下衍生化得到的具有伯氨基的糖链衍生物用C18固相萃取柱初步纯化；

所述C18固相萃取柱纯化过程为：C18固相萃取柱先用乙腈活化，再双蒸水平衡，然后将待纯化样品上样，上样后先用双蒸水洗脱除盐，然后，用合适浓度的乙腈水溶液进行洗脱，收集洗脱液，减压浓缩得纯化后的、具有伯氨基的糖链衍生物。

另一方面，本发明还提供所述的还原性糖链的氨基吡唑啉酮类异二官能团试剂衍生化方法制备得到的糖链衍生物的分离方法，所述分离方法采用一维正相柱HPLC进行分离，具体色谱条件如下：

色谱柱：TSK-GEL Amide-80柱；

柱温20℃，检测波长为254nm，流速为1.0mL/min；

流动相A为乙腈，B为pH＝6的100mM的乙酸铵水溶液，C为双蒸水，

样品分离条件：t＝0min，75％A，25％B；t＝120min，55％A，45％B；

分别收集每一组分的洗脱液，并减压浓缩；

经以上分离过程得到糖链衍生化样品中所含的多种糖链的衍生化产物。

还在另一方面，本发明还提供了糖蛋白O-糖链的氨基吡唑啉酮类异二官能团试剂衍生化方法，包括以下步骤：

步骤(1C)：将糖蛋白样品加入3-氨基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮与质子型溶剂配制得到的溶液中，所述3-氨基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮在溶液中的浓度为0.75mol/L～1.2mol/L,每5mg蛋白样品，加入0.5mL所述3-氨基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮的溶液；

步骤(2C)：向反应体系中加入氢氧化钠或氨水，直至反应体系pH＝9～11，加热至50℃～75℃，反应8小时～24小时；

步骤(3C)：反应结束后，调节反应混合物pH至中性，后处理得到具有伯氨基的O-糖链衍生物。

进一步地，本发明所述的糖蛋白O-糖链的氨基吡唑啉酮类异二官能团试剂衍生化方法，包括以下步骤：

步骤(1C)：将糖蛋白样品加入3-氨基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮与DMF配制得到的溶液中，所述3-氨基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮在溶液中的浓度为1mol/L，每5mg蛋白样品，加入0.5mL所述3-氨基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮的溶液；

步骤(2C)：向反应体系中加入氢氧化钠或氨水，直至反应体系pH＝10，加热至65℃，反应12小时；

步骤(3C)：反应结束后，调节反应混合物pH至中性，有机溶剂洗去杂质，浓缩后经C18固相萃取柱纯化得到具有伯氨基的O-糖链衍生物。

进一步地，本发明所述的糖蛋白O-糖链的氨基吡唑啉酮类异二官能团试剂衍生化方法中，所述步骤(3C)中的C18固相萃取柱纯化具体过程为：

C18固相萃取柱先用乙腈活化，再双蒸水平衡，然后将待纯化样品上样，上样后先用双蒸水洗脱除盐，然后，用合适浓度的乙腈水溶液进行洗脱，收集洗脱液，减压浓缩得具有伯氨基的O-糖链衍生物。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

1、本发明首次使用了氨基吡唑啉酮类异二官能团试剂对还原性糖链进行衍生化的方法，以3-氨基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮为例，具有如下所示的结构，简称PAP，

这类衍生试剂具有两个活性不同的官能团，分别是活性氨基和活性亚甲基。对于还原性糖链，在酸性条件下，活性氨基与糖链还原端发生还原胺化反应，而活性亚甲基在此条件下不发生反应；在碱性条件下，活性亚甲基与糖链还原端发生迈克尔加成反应，而活性氨基在此条件下不发生反应；因此，被这类氨基吡唑啉酮类异二官能团试剂衍生化后的糖链都携带一份子活性氨基或活性亚甲基，可用于糖链的进一步分析。并且这种衍生化方法衍生化效率高，反应时间短，适合各种还原性糖链，通用性强，更加简捷、高效。

2、本发明的还原性糖链的氨基吡唑啉酮类异二官能团试剂衍生化方法，在酸性条件下，经PAP试剂衍生化之后的还原性糖链衍生化产物，溶液的质量浓度范围在0.006mg/L～2.5mg/L范围内，都具有较好的线性；在碱性条件下经PAP试剂衍生化之后的糖链衍生化产物，溶液的质量浓度范围在0.002mg/L～2.5mg/L范围内，都具有较好的线性，可进行定量分析；两种条件下定量试验的重复试验RSD均低于5％，反应了本方法具有很好的重复性、可靠性。

3、本发明还首次提供了糖蛋白O-糖链的氨基吡唑啉酮类异二官能团试剂衍生化方法，在碱性条件下，糖蛋白释放出的O-糖链还原端与氨基吡唑啉酮类异二官能团试剂中的活性亚甲基发生迈克尔加成反应，生成带有伯氨基的O-糖链衍生物，而活性氨基在此条件下不反应。

本发明所述的“质量浓度”是指单位体积混合物中某组分的质量称为该组分的质量浓度。

本发明所述的“物质的量浓度”又称“摩尔浓度”是指单位体积溶液中所含溶质的物质的量。

附图说明

图1为异二官能团试剂PAP对还原性糖链进行衍生化的两种试验反应过程图。

图2为实施例1麦芽糊精PAP衍生物的ESI-MS图谱(A)及实施例2麦芽糊精PAP衍生物的ESI-MS图谱(B)。

图3为实施例3酸性条件下PAP衍生化反应条件的筛选结果。

图4是实施例4碱性条件下PAP衍生化反应条件的筛选结果。

图5为实施例5酸性条件下麦芽糊精PAP衍生物的HILIC-HPLC图谱(A)和碱性条件下麦芽糊精PAP衍生物的HILIC-HPLC图谱(B)。

图6为碱性条件下实施例6鸡蛋白蛋白N-糖链的PAP衍生物的ESI-MS图谱(A)及实施例7人乳蛋白N-糖链碱性条件下的PAP衍生物的ESI-MS图谱(B)。

图7为酸性条件下实施例6鸡蛋白蛋白N-糖链的PAP衍生物的ESI-MS图谱(A)及实施例7人乳蛋白N-糖链酸性条件下的PAP衍生物的ESI-MS图谱(B)。

图8为实施例6鸡蛋白蛋白N-糖链碱性条件下的PAP衍生物的在线HILIC-MS紫外图谱(A)、EIC图谱(C)和实施例7人乳蛋白N-糖链碱性条件下的PAP衍生物的在线HILIC-MS紫外图谱(B)、EIC图谱(D)。

图9为实施例6鸡蛋白蛋白N-糖链酸性条件下的PAP衍生物的在线HILIC-MS紫外图谱(A)、EIC图谱(C)和实施例7的人乳蛋白N-糖链酸性条件下的PAP衍生物的在线HILIC-MS紫外图谱(B)、EIC图谱(D)。

图10为实施例9猪胃粘蛋白O-糖链的PAP衍生物的ESI-MS图谱。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

下面所描述的实施例，除非其他方面表明所有的温度定为摄氏度，如无特殊说明温度的误差范围为实施例中无特殊说明，反应温度为室温，室温指25℃±5℃，所有的温度误差为±5℃。

3-氨基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮(PAP)购买于阿尔法埃莎公司；麦芽糊精、鸡蛋白蛋白、猪胃粘蛋白、氰基硼氢化钠(NaBH₃CN)、氢氧化钠、N-N二甲基甲酰胺(DMF)均购买于Sigma-Aldrich公司；PNGase>

双蒸水是试验室用自动双重纯水蒸馏器进行制备得到。

本发明中质谱鉴定(ESI-MS)使用电喷雾电离线性离子阱质谱(LTQ XL，ThermoScientific，USA)进行检测，如无特别说明，检测条件如下：

一级ESI-MS参数设置如下：进样量，2μL进样环控制；载样流动相为甲醇/水(50％/50％，v/v)；流速为50μL/min；工作电压为4kV；鞘气流速为20arb；辅助气体流速为10arb；毛细管电压为37V；毛细管透镜电压是250V；毛细管温度是300℃；扫描类型为一级全扫描；最大注入时间是1000ms；微扫描是3次；数据采集使用LTQ Tune软件，糖链结构的分析软件是Glycoworkbench。

下面简写词或外文术语的使用贯穿本发明：

ACN乙腈

DMSO 二甲基亚砜

FBS胎牛血清

Lac，Lactose乳糖

Int％相对丰度

MeOH 甲醇

mL 毫升

min分钟

ms 毫秒

Mmol/L

h小时

Retention time 保留时间

Reducing sugar 还原性糖

Ovalbmin 鸡蛋白蛋白

peak area峰面积

Relative Abundance 相对丰度

SDS十二烷基硫酸钠

Samples样品

V伏

具体实施例：

本发明中的实施例是关于还原性糖链的氨基吡唑啉酮类异二官能团试剂衍生化方法，以及衍生化产物的初步纯化、分离和鉴定方法。本发明中的实施例还记载了糖蛋白O-糖链的氨基吡唑啉酮类异二官能团试剂衍生化方法。

以PAP为例，氨基吡唑啉酮类异二官能团试剂对还原性糖链进行衍生化的两种试验反应的过程如图1所示。首先，对于游离还原性糖链，以麦芽糊精寡糖混合物为例，通过两种不同反应模式衍生化。其一，在酸性条件下，先将糖链溶于PAP/DMF和弱酸体系中反应，再往上述体系中加入NaBH₃CN反应完成后，经过纯化，得到带有活性亚甲基(—CH₂—CO—)的衍生物；其二，在碱性条件下，将糖链溶于PAP/DMF体系中，调节体系pH为碱性，反应完成后，经过纯化，得到带有活性氨基(—NH₂)的衍生物；再通过HPLC分别对两种衍生物分离分析。对糖蛋白上糖链的衍生，首先将糖链释放并纯化，其次将释放的糖链通过上述两种不同反应模式进行衍生，再通过HPLC分别对衍生物分离分析。上述糖链衍生物后续可应用于糖芯片构建及功能分析。

还原性糖链包括游离还原性糖链或糖蛋白上释放的还原性糖链，其中，游离还原性糖链为从植物、动物中提取的还原性糖链或合成得到的还原性糖链。

具体试验过程以下详述。

实施例1：麦芽糊精(Maltodextrin)在酸性条件下的衍生化及衍生物的初步纯化和检测

(1)衍生化

将PAP溶于DMF中配制成浓度为0.625mol/L的溶液，称取麦芽糊精5mg(麦芽糊精(Maltodextrin)是一种大分子还原性寡糖)加入500μL的PAP溶液中，再向反应体系中加入150μL冰乙酸，反应混合物在70℃下反应2小时。反应结束后，向混合物中加入浓度为0.75mol/L的NaBH₃CN的水溶液500μL，所得反应体系在70℃下继续反应1小时。反应结束后冷却至室温，用二氯甲烷洗涤3次，每次1.5mL～2mL，收集水相浓缩后的到粗产物。

(2)衍生物的粗产物用石墨碳柱初步纯化除盐

固相萃取小柱多孔石墨碳柱首先用3mL乙腈活化，然后用12mL双蒸水平衡，将粗产物上样，然后用15mL双蒸水洗脱除盐，之后用35％ACN溶液洗脱目标糖链衍生物，收集洗脱液，浓缩干燥后得到衍生物。

(3)衍生化产物的检测分析

衍生物采用ESI-MS进行检测分析；正离子模式检测，扫描类型为一级全扫描，数据采集使用LTQ Tune软件。

具体质谱设定参数为：

进样量：2μL进样环控制；

载样流动相：体积比50％的甲醇水溶液，流速为50μL/min；

工作电压：4kV；

鞘气流速：20arb，辅助气体流速：10arb；

毛细管电压：37V，毛细管透镜电压：250V，毛细管温度：300℃；

最大注入时间：1000ms，微扫描：3次；

碰撞气体：氦气；

同位素宽度m/z 3.00；

离子碰撞能量是35％～45％；

激活电荷是0.25；

激活时间是30ms。

按照上述检测条件得到在酸性条件下经还原胺化之后的麦芽糊精PAP衍生物的质谱图，如图2A所示。图2A的ESI-MS谱图中可以看出，麦芽糊精与PAP衍生化后的的每个质谱峰的分子量均增加159，即连接一个PAP片段，证明麦芽糊精已经完全衍生化。

实施例2：麦芽糊精(Maltodextrin)在碱性条件下的衍生化及衍生物的初步纯化和检测

(1)衍生化

将PAP溶于DMF中配制成浓度为0.625mol/L的溶液，称取麦芽糊精5mg(麦芽糊精是一种大分子还原性寡糖)加入500μL的PAP溶液中，再向反应体系中加入0.4mol/L的氢氧化钠的水溶液500μL，所得反应体系在50℃下反应1.5h。反应结束后冷却至室温，用1M的盐酸水溶液调至pH＝7，然后用二氯甲烷洗涤1次，收集水相加3～5滴冰乙酸，然后再用1.5mL～2mL二氯甲烷洗涤，收集水相，减压浓缩，干燥后水溶，再用二氯甲烷洗涤1次，得衍生物的粗产物。

(2)衍生物的粗产物用C18固相萃取小柱初步除盐纯化

C18固相萃取小柱首先用3mL乙腈活化，然后用12mL双蒸水平衡，将粗产物上样，然后用12mL双蒸水洗脱除盐，之后用15％ACN溶液洗脱目标糖链衍生物，收集洗脱液，浓缩干燥后得到糖链衍生物。

(3)衍生化产物的检测分析

衍生物采用ESI-MS进行检测分析；正离子模式检测，扫描类型为一级全扫描，数据采集使用LTQ Tune软件。

具体质谱设定参数为：

进样量：2μL进样环控制；

载样流动相：体积比50％的甲醇水溶液，流速为50μL/min；

工作电压：4kV；

鞘气流速：20arb，辅助气体流速：10arb；

毛细管电压：37V，毛细管透镜电压：250V，毛细管温度：300℃；

最大注入时间：1000ms，微扫描：3次；

碰撞气体：氦气；

同位素宽度m/z 3.00；

离子碰撞能量是35％～45％；

激活电荷是0.25；

激活时间是30ms。

按照上述检测条件得到在碱性条件下经迈克尔加成反应之后的麦芽糊精PAP衍生物的质谱图，如图2B所示。图2B的ESI-MS谱图中可以看出，麦芽糊精与PAP衍生化后的的每个质谱峰的分子量均增加332，即连接两个PAP片段，证明麦芽糊精已经完全衍生化。

根据实施例1～2可知，氨基吡唑啉酮类异二官能团试剂PAP对游离还原性糖链的衍生化方法，不仅可在在酸性条件下完成糖链的衍生化，还可以在碱性条件下实现糖链的衍生化，并且衍生化效率高，反应时间短，相比于现有的衍生化方法适用反应条件更广泛、更加简捷、高效。

氨基吡唑啉酮类异二官能团试剂具有两个活性不同的官能团，分别是活性氨基和活性亚甲基。对于还原性糖链，在酸性条件下，活性氨基与糖链还原端发生还原胺化反应，而活性亚甲基在此条件下不发生反应；在碱性条件下，活性亚甲基与糖链还原端发生迈克尔加成反应，而活性氨基在此条件下不发生反应；因此，被这类氨基吡唑啉酮类异二官能团试剂衍生化后的糖链都携带一份子活性氨基或活性亚甲基，可用于糖链的进一步分析。

实施例3：酸性条件下异二官能团试剂PAP衍生化方法的条件筛选

以还原性二糖乳糖为底物，对酸性条件下PAP与糖链的衍生化反应条件进行筛选，酸性环境是通过向反应体系中添加有机弱酸获得的，可以使用冰醋酸、苯甲酸或甲酸实现本反应，重要的是控制反应体系的pH值不要低于3，防止酸性过强造成糖链发生降解，其中冰醋酸反应效果较好，因此在以下条件筛选时，选择冰醋酸。

对酸性环境中的衍生化条件进行单因素筛选试验，分别考察PAP与糖链的摩尔比，也就是在相同溶剂中的物质的量浓度之比、缩合过程中冰醋酸的加入量和还原胺化中氰基硼氢化钠的用量对衍生化效率的影响。

固定冰醋酸用量、缩合反应的温度、反应时间以及还原胺化中氰基硼氢化钠的用量、还原胺化的温度和反应时间，考察PAP/Lac的摩尔浓度比从1倍(1:1)上升至25倍(25:1)时，衍生物产量，试验结果如图3a所示。

试验结果显示：PAP/Lac的摩尔浓度比从1倍(1:1)上升至40倍(40:1)时，乳糖衍生物产量呈上升趋势，表明衍生物会随着PAP浓度增加而增多，当摩尔浓度比大于10倍(10:1)时，衍生化产率大于60％，而当摩尔浓度比大于25倍(25:1)时，趋于稳定，衍生化产量最高。故PAP/Lac摩尔浓度比为25倍，且PAP浓度不超过0.625mol/L时反应效果较好。

固定PAP/Lac的摩尔浓度比、缩合反应的温度、反应时间以及还原胺化中氰基硼氢化钠的用量、还原胺化的温度和反应时间，考察冰醋酸的体积占缩合反应的反应液体积的百分比(百分体积含量)从0％上升至25％时，衍生化产量，试验结果如图3b所示。

试验结果显示：冰醋酸主要作用是调节反应体系的pH，冰乙酸的百分体积含量从占总体积0％上升至25％时，乳糖衍生物呈上升趋势，表明目标产物会随着冰乙酸量的增加而增加，当冰乙酸的百分体积含量(v/v)大于7％时，衍生化产率大于60％，而当冰乙酸的百分体积含量提高到15％后，趋于稳定，衍生化产量最高。考虑到冰乙酸量过大而易使反应体系的pH值过低，从而不利于第二步还原胺化反应，故选取加入冰乙酸的百分体积含量为15％时反应效果较好。

固定PAP/Lac的摩尔浓度比、冰醋酸用量、缩合反应的温度、反应时间以及还原胺化中还原胺化的温度和反应时间，考察氰基硼氢化钠与Lac的物质的量之比(也就是反应体系中的物质的量浓度之比)从1:1上升至60:1时，衍生化产量，试验结果如图3c所示。

试验结果显示：NaBH₃CN/Lac物质的量浓度比从1倍(1:1)上升到60倍(60:1)时，乳糖衍生物呈上升趋势，表明目标产物会随NaBH₃CN的用量增加而增加，当NaBH₃CN/Lac物质的量浓度比大于20倍(20:1)时，衍生化产率大于60％，而当NaBH₃CN/Lac物质的量浓度比提高到30倍后，趋于稳定，衍生化产量最高。NaBH₃CN/Lac物质的量浓度比为30倍(30:1)时反应效果较好。氰基硼氢化钠一般溶解在水或者醇中以溶液的形式加入，在试验中乳糖的浓度为0.025mol/L，NaBH₃CN浓度是糖链30倍时，也就是浓度为0.75mol/L。

在上述试验中，PAP与糖链进行反应的时候，反应溶剂可以选择合适的质子型溶剂，在本领域中最常用的是DMSO和DMF。

实施例4：碱性条件下异二官能团试剂PAP衍生化方法的条件筛选

以还原性二糖乳糖为底物，对碱性条件下PAP与糖链的衍生化反应条件进行筛选。对碱性环境中的衍生化条件进行单因素筛选试验，分别考察PAP与糖链的摩尔比，也就是在相同溶剂中的物质的量浓度之比、缩合过程中加氢氧化钠后体系的pH、加成反应的温度和反应时间对衍生化效率的影响。

固定反应体系的pH(pH＝10)、加成反应的温度和反应时间，考察PAP/Lac的摩尔浓度比从1倍(1:1)上升至4倍(4:1)时，衍生物产量，试验结果如图4a所示。

试验结果显示：PAP/Lac的摩尔浓度比从1倍(1:1)上升至4倍(4:1)时，乳糖衍生物产量呈上升趋势，表明衍生物会随着PAP浓度增加而增多，当摩尔浓度比大于2.5倍(5:2)时，衍生化产率大于60％，而当摩尔浓度比大于3倍(3:1)时，趋于稳定，衍生化产量最高。由于PAP试剂浓度过大易产生沉淀，不利于纯化，故PAP/Lac摩尔浓度比为3倍，且PAP浓度一般不超过0.75mol/L时反应效果较好。

固定PAP/Lac的摩尔浓度比、PAP的浓度为0.75mol/L、加成反应的温度和反应时间，考察反应体系的pH对衍生化的影响，氢氧化钠可以以固体形式或者溶解成溶液加入反应体系中，为了试验的简便，在本试验中氢氧化钠以水溶液形式添加，考察的是用氢氧化钠水溶液调节反应体系的pH从8.5上升至14时，衍生物产量，试验结果如图4b所示。试验验证用于调节体系pH的试剂也可以选用氨水。

试验结果显示：反应体系的pH从8.5上升至14时，乳糖衍生物产量呈上升趋势，表明衍生物会随着碱性的提高而增多，pH为9.5时，衍生化产率大于60％，而当pH增加至10时，衍生物产量达到最高，当pH继续增大至大于12时，反应体系中会出现沉淀，使产物纯化难度增加，推测是由于反应溶液碱性过强，糖链发生降解造成的，故选取反应体系pH为10。

固定PAP/Lac的摩尔浓度比、反应体系的pH(pH＝10)和加成反应时间，考察反应温度从30℃上升至70℃时，衍生物产量，试验结果如图4c所示。

试验结果显示：反应温度从30℃上升至70℃时，乳糖衍生物产量呈上升趋势，表明衍生物会随着反应温度升高而增多，当反应温度大于40℃时，衍生化产率大于60％，而当反应温度大于50℃时，趋于稳定，衍生化产量最高。由于反应温度大于70℃时，易脱去一个PAP，形成单PAP产物，故反应温度保持50℃时反应效果较好。

固定PAP/Lac的摩尔浓度比、反应体系的pH(pH＝10)和加成反应温度，考察反应时间从0.5小时延长至3小时时，衍生物产量，试验结果如图4d所示。

试验结果显示：反应时间从0.5小时延长至3小时时，乳糖衍生物产量呈上升趋势，表明衍生物会随着反应时间延长而增多，当反应时间大于1小时时，衍生化产率大于60％，而当反应时间大于1.5小时时，趋于稳定，衍生化产量最高。故选取反应时间为1.5小时时反应效果较好。

在上述试验中，PAP与糖链进行反应的时候，反应溶剂可以选择合适的质子型溶剂，在本领域中最常用的是DMSO和DMF。

实施例5：PAP衍生化产物的HPLC分离方法

对实施例1和实施例2制备得到的麦芽糊精PAP衍生化产物均可采用一维正相柱HPLC分离，HPLC仪器选用岛津LC-2010AHT色谱仪，色谱柱选用TSK-GEL Amide-80正相柱(HILIC，4.6mm×250mm)，具体色谱条件如下：

柱温20℃，检测波长为254nm，流速为1.0mL/min；

进样量为10μL；

流动相A为乙腈，B为的100mM的乙酸铵水溶液(pH＝6)，C为双蒸水，

样品分离条件：t＝0min，75％A，25％B；t＝120min，55％A，45％B；

分别收集每一组分的洗脱液，并减压浓缩；

经以上分离过程得到糖链衍生化样品中所含的多种糖链的衍生化产物。

按照上述分离条件得到酸性条件下经缩合、还原胺化之后的麦芽糊精PAP衍生物的HILIC-HPLC图谱，如图5A所示。经迈克尔加成反应之后的麦芽糊精PAP衍生物的HILIC-HPLC图谱，如图5B所示。

实施例6：鸡蛋白蛋白N-糖链的PAP衍生化及衍生物的分离、检测

(1)鸡蛋白蛋白N-糖链的释放

本发明采用的是PNGase F酶法制备N-糖链，其标准步骤如下，以鸡蛋白蛋白为例：

酶解：5mg鸡蛋白蛋白溶于540μL的超纯水中，加50μL蛋白变性液(0.5g SDS和0.62g DTT溶于10mL蒸馏水中)，100℃下加热10min，冷却至室温，加50μL磷酸盐缓冲液(1.90g磷酸钠溶于10mL水中，用磷酸调至pH＝7.5)和60μL 10％NP-40(乙基苯基聚乙二醇用水稀释10倍后使用)，然后加入1.2μL PNGase F酶(500unit/μL)，37℃保温解离24小时后，冷冻保存，以待纯化。

纯化：将酶解得到的样品离心，依次用C18固相萃取小柱和石墨碳固相萃取小柱对解离的样品进行纯化。C18固相萃取小柱纯化，纯化过程如下：10mL乙腈(CH₃CN)活化柱子，10mL超纯水平衡柱子，吸取上清液滴加于柱子内，20mL超纯水洗样品；接水洗脱样。样品经C18纯化后，紧接着用石墨碳固相小柱纯化，其过程如下：10mL乙腈(CH₃CN)活化柱子，10mL超纯水平衡柱子，上样，用25mL双蒸水洗除杂，水洗液不收集，然后用25％的乙腈水溶液4mL洗脱，接样，将收集得到的纯化后的样品常温旋干，于–21℃冷冻保存，用于后续的衍生化、检测分析。

(2)酸性条件下鸡蛋白蛋白N-糖链的PAP衍生化及产物的分离、检测

按照实施例3所筛选得到的反应条件进行鸡蛋白蛋白N-糖链的PAP衍生化。PAP溶液浓度为0.625mol/L，(N-糖链的分子量均大于342，因此步骤(1)得到的鸡蛋白蛋白N-糖链其物质的量小于0.0146mmol)，所有反应试剂的添加量按照糖链为0.0146mmol计算，冰乙酸在反应体系中的体积百分数为15％，缩合反应的温度70℃，反应时间2小时，然后加入与PAP溶液等体积的浓度为0.75mol/L的NaBH₃CN的水溶液，在70℃下继续反应1小时。

然后按照实施例1中的后处理、纯化和检测方法进行ESI-MS检测，得到质谱图如图7A所示。由图7A中可知鸡蛋白蛋白N-糖链完全被PAP衍生化，每个质谱峰的分子量均增加159，即连接一个PAP片段。

酸性条件下的鸡蛋白蛋白N-糖链PAP衍生化产物按照实施例5的分离方法，采用一维正相柱HPLC分离，在线HILIC-MS的紫外谱图如图9A所示，如图9A，为PAP与鸡蛋白蛋白N-糖链发生还原胺化后的衍生化产物的在线HILIC-MS图谱，共分离得到18种糖链，然后多分离出的各洗脱峰，分别提取得到萃取离子流色谱(EIC)如图9C所示，基于MS分析，相同分子量的糖链同分异构体在液相分离时的出峰时间不一样，根据图9C发现，其中双电荷有6条，单电荷12条，有2条存在同分异构体，分别是H5N6和H6N6，H5N6和H6N6分别有两个同分异构体，以上结果与文献报道一致。

(3)碱性条件下鸡蛋白蛋白N-糖链的PAP衍生化及产物的分离、检测。

按照实施例4所筛选得到的反应条件进行鸡蛋白蛋白N-糖链的PAP衍生化。PAP溶液浓度为0.75mol/L，5mg鸡蛋白蛋白按照步骤(1)同样的方法释放得到N-糖链，所有反应试剂的添加量按照0.0146mmol计算(N-糖链的分子量均大于342，因此5mg鸡蛋白蛋白得到的N-糖链物质的量小于0.0146mmol)，氢氧化钠溶液的浓度为0.3mol/L，在50℃下继续反应1.5小时。

然后按照实施例2中的后处理、纯化和检测方法进行ESI-MS检测，得到质谱图如图6A所示。由图6A中可知，鸡蛋白蛋白N-糖链完全被PAP衍生化，每个质谱峰的分子量均增加332，即连接两个PAP片段。

碱性条件下的鸡蛋白蛋白N-糖链PAP衍生化产物按照实施例5的分离方法，采用一维正相柱HPLC分离，在线HILIC-MS的紫外谱图如图8A所示，如图8A，为PAP与鸡蛋白蛋白N-糖链发生迈克尔加成后的衍生化产物的在线HILIC-MS图谱，共分离得到22条糖链；然后多分离出的各洗脱峰，分别提取得到萃取离子流色谱(EIC)如图8C所示。基于MS分析，相同分子量的糖链同分异构体在液相分离时的出峰时间不一样，根据图8C发现，鸡蛋白蛋白N-糖链的22条糖链中，其中双电荷有13条,单电荷9条，有3条糖链存在同分异构体，分别是H3N6、H4N6和H6N6，其中，H3N6有3个同分异构体，H4N6有两个同分异构体，H6N6有两个同分异构体，以上结果与文献报道一致。

实施例7：人乳蛋白N-糖链的PAP衍生化及衍生物的分离、检测

(1)人乳蛋白N-糖链的释放

按照实施例6中的标准糖蛋白N-糖链制备方法，将鸡蛋白蛋白替换为人乳蛋白即可制备得到人乳N-糖链。

(2)酸性条件下人乳蛋白N-糖链的PAP衍生化及产物的分离、检测

按照实施例3所筛选得到的反应条件进行人乳蛋白N-糖链的PAP衍生化。PAP溶液浓度为0.625mol/L，5mg人乳蛋白酶解得到的人乳蛋白N-糖链作为反应底物，所有反应试剂的添加量按照0.0146mmol计算(N-糖链的分子量均大于342，因此5mg人乳蛋白得到的N-糖链物质的量小于0.0146mmol)，冰乙酸在反应体系中的体积百分数为15％，缩合反应的温度70℃，反应时间2小时，然后加入与PAP溶液等体积的浓度为0.75mol/L的NaBH₃CN的水溶液，在70℃下继续反应1小时。

然后按照实施例1中的后处理、纯化和检测方法进行ESI-MS检测，得到质谱图如图7B所示。由图7B中可知人乳蛋白N-糖链完全被PAP衍生化，每个质谱峰的分子量均增加159，即连接一个PAP片段。

酸性条件下的人乳蛋白N-糖链PAP衍生化产物按照实施例5的分离方法，采用一维正相柱HPLC分离，在线HILIC-MS的紫外谱图如图9B所示，共分离得到14种糖链，如图9B,为PAP与人乳N-糖链发生还原胺化反应后的衍生化产物的HILIC-MS图谱，共得到14种糖链。然后多分离出的各洗脱峰，分别提取得到萃取离子流色谱(EIC)如图9D所示。基于MS分析，相同分子量的糖链同分异构体在液相分离时的出峰时间不一样，根据图9D发现，其中双电荷有2条，单电荷12条，有3条糖链存在同分异构体，分别是H3N4F1、H3N5F1和H4N5F1，其中，H3N4F1有两个同分异构体，H3N5F1有三个同分异构体，H4N5F1有两个同分异构体，以上结果与文献报道一致。

(3)碱性条件下人乳蛋白N-糖链的PAP衍生化及衍生物的分离、检测

按照实施例4所筛选得到的反应条件进行人乳蛋白N-糖链的PAP衍生化。PAP溶液浓度为0.75mol/L，5mg人乳蛋白酶解得到的人乳蛋白N-糖链作为反应底物(N-糖链的分子量均大于342，因此5mg人乳蛋白得到的N-糖链物质的量小于0.0146mmol)，所有反应试剂的添加量按照0.0146mmol计算，氢氧化钠溶液的浓度为0.3mol/L，在50℃下继续反应1.5小时。

然后按照实施例2中的后处理、纯化和检测方法进行ESI-MS检测，得到质谱图如图6B所示。由图6B中可知人乳蛋白N-糖链完全被PAP衍生化，每个质谱峰的分子量均增加332，即连接两个PAP片段。

碱性条件下的人乳蛋白N-糖链PAP衍生化产物按照实施例5的分离方法，采用一维正相柱HPLC分离，在线HILIC-MS的紫外谱图如图8B所示，图8B为PAP与人乳N-糖链发生迈克尔加成反应后的衍生化产物的在线HILIC-MS图谱，共分离出20条糖链；然后分离出的各洗脱峰，分别提取得到萃取离子流色谱(EIC)如图8D所示，基于MS分析，相同分子量的糖链同分异构体在液相分离时的出峰时间不一样，根据图8D发现，在得到的20种糖链中，其中双电荷有12条，单电荷8条，有两条糖链存在同分异构体，分别是H4N5F1和H4N5SA2，H4N5F1有2个同分异构体，H4N5SA2有2个同分异构体，以上结果与文献报道一致。

实施例6～7表明，本发明的氨基吡唑啉酮类异二官能团试剂PAP对还原性糖链的衍生化方法不仅适用于游离还原性糖链，同样适用于糖蛋白中释放出来的糖链，并且经衍生化后的得到的糖链衍生物可以经HPLC进行分离，进而可以进行糖链分析，试验结果证明了，糖链的PAP衍生物分析结果准确，与现有报道结果一致。

实施例8：糖链的PAP衍生化产物的定量分析方法及适用性评估

(1)酸性条件下的糖链的PAP衍生化产物的定量分析方法评估

按照实施例3中筛选得到的优化的衍生化反应条件：反应体系中PAP溶液浓度为0.625mol/L，乳糖0.025mol/L，加入体积百分数为15％的冰乙酸，缩合反应的温度70℃，反应时间2小时；然后加入与PAP溶液等体积的浓度为0.75mol/L的NaBH₃CN的水溶液，在70℃下继续反应1小时。然后按照实施例1中的后处理、纯化方法，得到具有活性亚甲基的乳糖PAP衍生物。

采用C18-HPLC方法对乳糖衍生物进行定量分析。以乳糖为标准品，将衍生化产物分别配制成浓度为0.006、0.008、0.02、0.06、0.07、0.08、0.1、0.25、0.35、0.5、1、2.5mg/L的13个浓度梯度的溶液，进行HPLC分析，从而得到一系列峰。然后以乳糖的浓度为横坐标，吸收峰面积为纵坐标，绘制定量标准曲线，每个浓度测定三次。

在绘制标准曲线时，为了减少定量时的误差，以0.006、0.008、0.02、0.06mg/L这四个浓度绘制第一条曲线；以0.07、0.08、0.1、0.25mg/L这四个浓度绘制第二条曲线；以0.35、0.5、1、2.5mg/L这四个浓度绘制第三条曲线。

当乳糖的浓度为0.006mg/L时，吸收峰平均面积是9534.4，当乳糖浓度为0.06mg/L时，吸收峰平均面积是101907.6，故当样品中糖链的吸收峰面积在9534.4～101907.6间时，适用曲线方程y＝0.18x；当乳糖浓度为0.07mg/L时，平均峰是317135.3，当乳糖浓度为0.25mg/L时，吸收峰平均面积是1258749，故当样品中糖链的吸收峰面积在317135.3～1259749间时，适用曲线方程y＝0.50x；当乳糖浓度为0.35mg/L时，吸收峰平均面积是1969859.7，当乳糖浓度为2.5mg/L时，吸收峰平均面积是13930597。故当样品糖链的吸收峰面积在1969859.7～13930597间时，适用曲线方程y＝0.55x。精确性通过测量方法的重复性和中间准确度进行精密分析，每分析点重复6次试验，计算RSD值，最低检测限为信噪比S/N为3时的检测限为0.006mg/L。具体试验结果见表1：

表1：乳糖酸性条件下PAP衍生化产物的定量分析方法

由表1可知，定量分析方法的标准曲线相关系数均高于0.99，具有较高的相关性，证明当衍生物浓度在0.006～2.5mg/L范围内时可以进行定量分析；重复试验的RSD低于5％，证明重复性较好；最低检测限低至0.006mg/L，具有较高的灵敏度，适于定量分析。

(2)碱性条件下的糖链的PAP衍生化产物的定量分析方法评估

按照实施例4所筛选得到的优化的衍生化反应条件进行乳糖的PAP衍生化：体系中PAP溶液浓度为0.75mol/L，乳糖0.3mol/L，加入等体积的0.3mol/L的氢氧化钠溶液，在50℃下继续反应1.5小时。然后按照实施例2中的后处理、纯化方法，得到具有伯氨基的乳糖PAP衍生物。

采用C18-HPLC方法对乳糖衍生物进行定量分析。以乳糖为标准品，将衍生化产物分别配制成浓度为0.002、0.003、0.0055、0.006、0.008、0.01、0.015、0.05、0.08、0.15、0.35、0.5、1、2.5mg/L的14个浓度梯度进行HPLC分析，从而得到一系列吸收峰。然后以乳糖的浓度为横坐标，吸收峰面积为纵坐标，绘制定量标准曲线。

为了证明曲线的可靠性，每个浓度梯度分别跑三次。为了减少定量时的误差，以浓度为0.002、0.003、0.0055、0.006、0.008mg/L这五个浓度绘制第一条曲线；以浓度为0.01、0.015、0.05、0.08mg/L这四个浓度绘制第二条曲线；以浓度0.15、0.35、0.5、1.0、2.5这五个浓度绘制第三条曲线。

当乳糖浓度为0.002mg/L时，吸收峰平均面积是8875.33，当乳糖浓度为0.008mg/L时，平均峰面积是36476，故当样品中糖链的吸收峰面积在8875.33～36476间时，适用曲线方程y＝0.41x；当乳糖浓度为0.015mg/L时，吸收峰平均面积是89596.33，当乳糖浓度为0.15mg/L时，吸收峰平均面积是666222.3，故当样品中糖链的吸收峰面积在89596.33～666222.3间时，适用曲线方程y＝0.44x；当乳糖浓度为0.35mg/L时，平均峰面积是3009436，当乳糖浓度为2.5mg/L时，吸收峰平均面积是32361465，故当样品中糖链的吸收峰面积在3009436～32361465间时，适用曲线方程y＝1.29x。

精确性通过测量方法的重复性和中间准确度进行精密分析，每分析点重复6次试验，计算RSD值，最低检测限为信噪比S/N为3时的检测限0.002mg/L。具体试验结果见表2：

表2：乳糖碱性条件下PAP衍生化产物的定量分析方法

由表2可知，定量分析方法的标准曲线相关系数均高于0.99，具有较高的相关性，证明当衍生物浓度在0.002～2.5mg/L范围内时可以进行定量分析；重复试验的RSD低于5％，重复性较好，最低检测限低至0.002mg/L，具有较高的灵敏度，适于定量分析。

实施例8证明了，本发明提供的还原性糖链的氨基吡唑啉酮类异二官能团试剂衍生化方法，在酸性条件下还原性糖链的PAP衍生物，质量浓度范围在0.006mg/L～2.5mg/L范围内，都具有较好的线性；在碱性条件下还原性糖链的PAP衍生物，质量浓度范围在0.002mg/L～2.5mg/L范围内，都具有较好的线性，可进行定量分析；两种条件下定量试验的重复试验RSD均低于5％，反应了本方法具有很好的重复性、可靠性。

本发明还探索了糖蛋白中的O-糖链的氨基吡唑啉酮类异二官能团试剂衍生化方法。将糖蛋白溶于氨基吡唑啉酮类异二官能团试剂PAP的质子型溶剂配制成的溶液中，加入NaOH或氨水调节pH，在加热条件下，搅拌反应，得到带有活性伯氨基(—NH₂)的O-糖链衍生物。

具体实验过程如实施例8所示。

实施例9：猪胃粘蛋白O-糖链的氨基吡唑啉酮类异二官能团试剂释放及同时衍生化和衍生物的检测

(1)猪胃粘蛋白O-糖链的释放和衍生化

将PAP溶于DMF中配制成浓度为1mol/L的溶液，称取5mg猪胃粘蛋白，溶于500μL的PAP/DMF溶液中，再加500μL 0.7mol/L的NaOH水溶液，在65℃反应12小时，待反应结束后，加1mol/L的盐酸溶液调pH至中性，加1.5mL～2mL二氯甲烷，然后13000r/min离心3min，取上清，加冰乙酸3～5滴，调至pH＝4～5，再加1.5mL～2mL二氯甲烷，在13000r/min离心3min，取上清，悬干，再溶于500μL双蒸水，加1.5mL～2mL二氯甲烷，在13000r/min离心3min，取上清，悬干得衍生物的粗产物。

(2)O-糖链衍生物用C18固相萃取小柱初步纯化

C18固相萃取小柱首先用3mL乙腈活化，然后用12mL双蒸水平衡，将粗产物上样，然后用12mL双蒸水洗脱除盐，之后用25％ACN溶液洗脱目标糖链衍生物，收集洗脱液，浓缩干燥后得到O-糖链衍生物。

(3)O-糖链衍生物的检测分析

衍生物采用ESI-MS进行检测分析；正离子模式检测，扫描类型为一级全扫描，数据采集使用LTQ Tune软件。具体检测条件与实施例2一致。得到质谱图，如图10所示。

从图10中可以看出，共释放得到26条PAP衍生化后的O-糖链，每个O-糖链质谱峰的分子量均增加332，即连接两个PAP片段，未发现标记有一份子PAP产物，质谱峰大部分为[M+Na]⁺，少量为[M+H]⁺和[M+K]⁺离子形式，此结果与文献报道一致。

以上实施例9证明了氨基吡唑啉酮类异二官能团试剂PAP与糖蛋白在碱性条件下反应，糖蛋白释放出的O-糖链还原端与氨基吡唑啉酮类异二官能团试剂中的活性亚甲基发生迈克尔加成反应，生成带有伯氨基的O-糖链衍生物，而活性氨基在此条件下不反应，在一个反应过程中同时实现O-糖链的释放和标记，大大简化了试验过程，提高了实验效率，这对于糖组学研究具有重要应用价值。

实施例10：猪胃粘蛋白O-糖链的氨基吡唑啉酮类异二官能团试剂释放及同时衍生化反应条件筛选

本发明还对糖蛋白O-糖链的氨基吡唑啉酮类异二官能团试剂衍生化反应条件进行了筛选。具体而言是按照实施例4的反应条件筛选方法，对猪胃粘蛋白O-糖链的衍生化反应条件进行筛选。

以猪胃粘蛋白为底物，对碱性条件下PAP与猪胃粘蛋白的反应条件进行筛选。对碱性环境中的衍生化条件进行单因素筛选试验，分别考察PAP的用量，反应过程中加氢氧化钠后体系的pH、反应的温度和反应时间对衍生物产量的影响。

试验结果显示：保持其他反应条件不变的情况下，按照每5mg蛋白样品加入500μLPAP溶液计算，PAP溶液的浓度从0.5mol/L上升至1.2mol/L时，衍生物会随着PAP/DMF浓度增加而增多，PAP溶液浓度大于0.75mol/L时，衍生化产率大于60％，而当浓度大于1mol/L时，趋于稳定，衍生物产量最高。由于PAP溶液浓度过大易产生沉淀，不利于纯化，因此，按照每5mg蛋白样品加入500μL的PAP溶液计算，最佳PAP溶液浓度为1mol/L。

PAP溶液的溶剂除了DMF之外，还可以换用DMSO等合适溶剂。

保持其他反应条件不变的情况下，将氢氧化钠配制成不同浓度的水溶液，或者使用浓氨水，加入反应体系中，调节pH，当pH从9上升至14时，衍生物产量呈上升趋势，表明衍生物会随着碱性提高而增多，pH为9时，衍生化产率大于60％，而当pH增加至10时，衍生化产量达到最高，当pH继续增大至大于11时，反应体系中会出现杂质，使产物纯化难度增加，推测是由于反应溶液碱性过强，糖链发生降解造成的，故选取反应体系pH为10。

保持其他反应条件不变的情况下，反应温度从40℃上升至75℃时，衍生物产量呈上升趋势，表明衍生物会随着反应温度升高而增多，当反应温度大于50℃时，衍生化产率大于60％，而当反应温度大于65℃时，趋于稳定，衍生化产量最高。由于反应温度大于75℃时，易脱去一个PAP，形成单PAP产物，故反应温度保持65℃时反应效果较好。

反应时间从8小时延长至24小时时，衍生物产量呈上升趋势，表明衍生物会随着反应时间延长而增多，当反应时间大于8小时时，衍生化产率大于60％，而当反应时间大于12小时时，趋于稳定，衍生化产量最高。故选取反应时间为12小时时反应效果较好。

以上实施例筛选出了氨基吡唑啉酮类异二官能团试剂PAP在碱性条件下对O-糖链的衍生化最佳实验条件，在优化后的试验条件下进行O-糖链的释放和衍生化，反应效率高，杂质少，易于纯化。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。