一种化合物在制备抑制HIV体内扩散药物的应用

摘要

本发明涉及生物医疗技术领域，特别涉及一种化合物在制备抑制HIV体内扩散药物的应用。对于本发明涉及的针对CD169靶点的化合物在制备抑制HIV体内扩散药物中的应用属于首次公开，该化合物对CD169+巨噬细胞具有很强的靶向作用，可以通过竞争性的与巨噬细胞表面的CD169相结合从而有效阻断HIV利用CD169粘性蛋白来结合巨噬细胞，抑制病毒在体内的扩散，具有良好的开发应用前景，制成的药物对抑制和治疗AIDS有着积极的意义。

说明书

技术领域

本发明涉及生物医疗技术领域，特别涉及一种化合物在制备抑制HIV体内扩散药物的应用。

背景技术

CD169又称唾液酸黏附素，是唾液酸结合性免疫球蛋白样凝集素家族的一员，表达于特定的巨噬细胞亚群表面。CD169+巨噬细胞通过该受体与其他细胞表面的配体识别并结合，完成细胞间的“交流”，在抗原递呈、调节淋巴细胞增殖、诱导炎症反应和免疫耐受中发挥重要作用。CD169+巨噬细胞存在于正常人的脾脏、淋巴结、骨髓、肝脏、结肠、肺、神经系统中，而在外周血中很少表达。但在疾病状态下，如自身免疫性疾病，可在病变组织、淋巴结及外周血中检测到其数量的明显变化。在艾滋病病毒体内传播过程中，CD169+巨噬细胞发挥着重要作用。

艾滋病病毒(HIV)是一种感染人类免疫系统细胞的慢病毒(lentivirus)，属逆转录病毒的一种。HIV感染并杀死免疫系统细胞，包括T细胞和巨噬细胞。这会破坏免疫系统，使病人容易感染上常见的细菌、病毒和其他在拥有健康免疫系统的人们体内不会导致问题的病原体，从而致使各种疾病在人体内蔓延，最终导致AIDS(Acquired Immune DeficiencySyndrome)。由于HIV的变异极其迅速，难以生产特异性疫苗，至今无有效治疗方法，对人类健康造成极大威胁。

为了攻克艾滋病，大量的研究工作被投入进去。迄今为止治疗HIV的研究都聚焦于清除T细胞(免疫系统中一种非常重要的免疫细胞)中的病毒。但是有研究发现HIV病毒会持续存在于感染HIV病毒的巨噬细胞中，使巨噬细胞为艾滋病病毒的卷土重来和扩散提供庇护。对于艾滋病毒(HIV)的扩散，HIV是通过其表面的唾液酸与CD169相结合从而进入巨噬细胞，捕获病毒颗粒的巨噬细胞向一种罕见类型的B细胞开放，随后病毒颗粒就会将自身吸附于这些B细胞的尾部，并且被拖入淋巴结内部，在一至两天内这些B细胞就会同组织建立稳定的联系，从而促进病毒的完全传递。

如何防止HIV病毒持续存在于感染HIV病毒的巨噬细胞中，使巨噬细胞为艾滋病病毒的卷土重来和扩散提供庇护是现有技术一直无法有效解决的难题。

发明内容

为解决以上背景技术中提到的如何防止HIV病毒持续存在于感染HIV病毒的巨噬细胞中，使巨噬细胞为艾滋病病毒的卷土重来和扩散提供庇护的问题，本发明提供一种化合物在制备抑制HIV体内扩散药物的应用，其中所述化合物的化学式为：

进一步地，所述药物为液态药物。

进一步地，所述药物为药片药物。

进一步地，所述药物为胶囊药物。

进一步地，所述药物为散剂药物。

以上化合物为针对CD169靶点的化合物，记为M1，本发明在通过对M1的药性评估中意外发现，M1对CD169+巨噬细胞具有很强的靶向作用，可以通过竞争性地与巨噬细胞表面的CD169相结合从而有效阻断HIV利用CD169粘性蛋白来结合巨噬细胞，从而抑制病毒在体内的扩散，制成的药物具有良好的开发应用前景，对抑制和治疗AIDS有着积极的意义。

对于本发明涉及的化合物M1在制备抑制HIV体内扩散药物中的应用属于首次公开；其对于抑制HIV体内扩散起到了意想不到，不存在由其他化合物给出任何启示的可能，具备突出的实质性特点，同时用于抑制HIV在体内扩散显然具有显著的进步。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为对注射不含M1和含M1的溶液药物后C57BL/6小鼠腘窝淋巴结处捕获的HIVGag-GFP的比较分析图；

图2为对正常小鼠C57BL/6和基因敲除小鼠Siglec1^-/-腘窝淋巴结处捕获的HIVGag-GFP的比较分析图；

图3为免疫系统人源化BLT小鼠在不含M1和含M1时脾脏中捕获的HIVGag-GFP的比较分析图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明提供一种能够针对CD169靶点的化合物，该化合物其化学式为：

针对以上化合物的制备方法，包括以下步骤：

1、制备TCC-COOH

1)、在0℃下，将6-氯-8-氟苯并二氢吡喃-4-酮1(5g，24.9mmol)溶解于15mL二甲基甲酰胺(N,N-Dimethylformamide，简称DMF)中，并逐滴加入磷酰氯(2.3mL，24.9mmol)，得到混合物M51；

2)、将S410得到的混合物M51在0℃下搅拌30分钟后加热至80℃，保温1.5小时后冷却至室温，得到混合物M52；

3)、将S420得到的混合物M52冷却至室温后，加入1N NaOAc溶液淬灭后，加入二氯甲烷(2×25mL)进行萃取，将萃取后的有机层进行真空浓缩，得到4,6-二氯-8-氟-2H-色烯-3-甲醛，不经进一步纯化即可进行下一步骤；

4)、在0℃下，于100ml圆底烧瓶中，将得到的4,6-二氯-8-氟-2H-色烯-3-甲醛(6.1g，24.9mmol)溶解在30mL乙醇溶液中，逐滴加入的巯基乙酸乙酯(2.73mL，24.9mmol)与乙醇钠(21wt％，在乙醇中，18.7mL，49.8mmol)于溶液中，得到混合物M53；

5)将S440得到的混合物M53升温至室温并搅拌过夜后，进行过滤，得到沉淀物后，用水洗涤并收集沉淀物；

6)将S450得到的沉淀物加入四氢呋喃(Tetrahydrofuran，简称THF)和1N NaOH溶液中，并在50℃下搅拌24小时，得到混合物M54；

7)将S460得到的混合物M54冷却至室温，用CH₂Cl₂(2×50mL)洗涤，并加入1N>

其中，TCC-COOH的化学结构式为：

该制备方法中，合成TCC-COOH的化学反应式为：

2、制备^TosSia>

1)、将唾液酸(15.0g，50mmol)、1ml三氟乙酸和300ml无水甲醇混合后在室温下搅拌至澄清，得到混合物M41；其中，该处表述的唾液酸的化学结构式如下所示：

2)、将得到的混合物M41采用蒸发的方式除去溶剂，得到唾液酸甲酯，为白色固体，无需进一步纯化；

3)、将得到的固体唾液酸甲酯和P₂O₅在真空干燥过夜，得到混合物M42；

4)、在得到的混合物M42与无水吡啶共蒸发两次以除去痕量水分，得到混合物M43；

5)、将得到的混合物M43溶于200ml无水吡啶中后，冷却至0℃，并加入对甲苯磺酰氯(10.0g，53mmol)，得到混合物M44；

6)、将得到的混合物M44加热至室温并搅拌过夜后，通过减压加热除去溶剂；

7)、将上一步除去溶剂后的残余物通过柱层析(EtOAc:MeOH＝20:1)纯化，得到白色固体(18.0g，38mmol)，即为^TosSiamethylester，制得的^TosSiamethyl>

3、制备^N3Sia>

1)、将8.0g叠氮化钠和^TosSiamethyl>

2)、将S210中得到的混合物M31加热至80℃过夜后，除去溶剂；

3)、将S220去除溶剂后的残余物通过柱层析(EtOAc:MeOH＝20:1)纯化，得到固体即为^N3Sia>

4、制备^TCCSia>

1)、将^N3Sia>

2)、在S110得到的混合物M21中加入乙酰氯，调节pH为1～2，得到混合物M22；

3)、将S120得到的混合物M22置于H₂中搅拌，并通过薄层色谱监测(TCL监测)至反应完全，约12小时，得到混合物M23；

4)、将S130得到的混合物M23通过过滤以除去Pd/C催化剂，并采用蒸发的方式去除溶剂，得到残留混合物M24；

5)、将S140中得到的残留混合物M24、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)(2.0g，10.3mmol)、1-羟基苯并三唑(HOBT)(1.4g，10.3mmol)、三乙胺(3.6ml，25.8mmol)、TCC-COOH(2.0g，8.6mmol)和150ml二甲基甲酰胺(DMF)混合，并在黑暗中搅拌48小时，得到混合物M25；

6)、将S150中得到的混合物M25蒸发除去溶剂，并将去除溶剂后的残余物通过柱层析(CH₂Cl₂：MeOH＝10：1)进行纯化，得到固体(2.6g,4.8mmol)即为^TCCSia>

5、制备针对CD169靶点的化合物(TCC-Neu5Ac)

1)、将^TCCSia>

2)、在混合物M11中，加入2M HCl水溶液，调节混合物M11的pH为7，得到混合物M12；

3)、将混合物M12溶剂的溶剂完全去除，将去除溶剂后的残余物通过柱层析进行纯化，所述柱层析中采用的CH₂Cl₂：MeOH＝2：1，制得浅黄色固体(287mg,0.55mmol)即为针对CD169靶点的化合物。

更具体地，本发明提供的针对CD169靶点的化合物的化学式合成路线如下所示：

将针对CD169靶点的化合物按照以下实施例步骤配制不同浓度的药物：

实施例1：配制浓度为10mM的M1药物储备液

步骤a、采用分析天平准确称取130.2mg M1于干净的烧杯中，用少量新鲜无菌的PBS(0.01M,pH 7.4)溶解。将玻璃棒一端靠在25mL容量瓶颈内壁上(注意不要让玻璃棒其它部位触及容量瓶口，防止液体流到容量瓶外壁上)，把溶液转入容量瓶中，接着用少量PBS多次洗涤烧杯，并把洗涤溶液全部转移到容量瓶里。

步骤b、向容量瓶中补充PBS至离标线1cm左右时，改用滴管小心滴加，最后使液体的弯月面与标线正好相切。

步骤c、盖紧瓶塞，用倒转和摇动的方法使瓶内的液体混合均匀，即得到浓度为10mM的M1药物储备液；配置好后置于4℃冰箱中避光保存。

实施例2：配制浓度为50μM的M1药物储备液

取实施例1制备的10mM的M1药物储备液50μL，加入9.95mL PBS稀释即得到浓度为50μM的M1药物储备液。

实施例3：配制浓度为100μM的M1药物储备液

取实施例1制备的10mM的M1储备液100μL，加入9.9mL PBS稀释即得到浓度为100μM的M1药物储备液。

实施例4：配制浓度为200μM的M1药物储备液

取实施例1制备的10mM的M1储备液200μL，加入9.8mL PBS稀释即得到浓度为100μM的M1药物储备液。

根据具体需要可以将M1的药物储备液制成液态药液、药片药物、胶囊药物或散剂药物。

通过以下实验证明M1的药物抑制HIV在体内扩散的作用。

研究中设计不同的小鼠模型进行了验证，验证方法如下。

对于正常小鼠C57BL/6或者基因敲除小鼠Siglec1^-/-，先通过尾静脉注射M1溶液给药10ml，30分钟后，对荧光标记的HIV>-/-的足底，一段时间后分离出小鼠的腘窝淋巴结，经胶原酶TL(0.2mg/mL,Roche)和DNA酶I(20μg/mL,Roche)在37℃孵育30分钟，之后将组织通过70μm的细胞过滤器，添加10％的FCS使蛋白酶失活，然后用4％的多聚甲醛固定样品，接着进行流式分析，对腘窝淋巴结处捕获的HIV进行定量分析。

其中，如图1所示，对注射不含M1(图中对应空白组)和含M1(图中对应加药组)的溶液药物后C57BL/6小鼠腘窝淋巴结处捕获的HIV Gag-GFP进行比较分析；采用正常C57BL/6小鼠对M1是否能抑制HIV传播进行了探究，因为HIV在体内的传播主要依靠各免疫器官，并将其作为巢穴繁殖，所以研究中对小鼠采用足下注射病毒悬液后，分离出腘窝淋巴结并对其中的HIV进行定量，从图1可以看出提前注射M1可有效减少HIV在腘窝淋巴结处的含量。

如图2所示，对正常小鼠C57BL/6(图中对应正常小鼠)和基因敲除小鼠Siglec1^-/-(图中对应基因敲除小鼠)腘窝淋巴结处捕获的HIV>-/-对比正常小鼠进行了探究，从图2结果发现基因敲除小鼠Siglec1^-/-腘窝淋巴结处的HIV含量要明显低于正常小鼠，考虑到基因敲除小鼠Siglec1^-/-不能表达CD169，可以证明CD169对于HIV病毒在体内的传播和在淋巴结处的聚集具有重要作用，HIV潜伏在CD169+巨噬细胞中随血液循环传播。

如图3所示，免疫系统人源化BLT小鼠在不含M1(图中对应空白组)和含M1(图中对应加药组)时脾脏中捕获的HIV Gag-GFP进行比较分析；为了进一步证明M1能有效抑制HIV在小鼠体内的传播，研究采用免疫系统人源化BLT小鼠模型对M1阻止HIV病毒感染远端免疫器官—脾脏进行了探究，图3的结果显示与空白对照组相比，注射M1给药后可以有效减少HIV在脾脏中的积累。脾脏作为主要的免疫器官，也是免疫细胞的主要聚集地之一，是血细胞储备和更新的应急储备库，也是易受HIV病毒攻击的主要器官之一，相对足部来说，脾脏距离较远，HIV病毒必须通过较长距离的血液循环才能聚集在此处，而实验结果表明，M1可有效抑制HIV在远端免疫器官—脾脏中的聚集。

通过以上实验和证据表明HIV病毒能通过CD169+巨噬细胞在体内传播，而M1通过竞争性的与CD169相结合可以有效的抑制这一途径。通过抑制HIV病毒在体内的扩散，可以起到治疗和预防艾滋病的作用。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。