一种紫脊百合试管小鳞茎繁殖方法

摘要

本发明公开了一种紫脊百合试管小鳞茎繁殖方法，属于生物领域，本发明的目的是提供一种紫脊百合试管小鳞茎繁殖方法，以解决现有百合组织培养常用到的方法对于紫脊百合繁殖会造成幼苗生长缓慢的问题。包括鳞片外植体的消毒步骤，试管小鳞茎的诱导步骤，试管小鳞茎的膨大和生根步骤，小鳞茎催芽生长步骤。小鳞茎诱导培养基由基础培养基和激素组成，基础培养基组成如下:MS基本培养液、蔗糖60g/L、精氨酸0.5g/L、谷氨酰胺0.5g/L、活性炭2g/L、琼脂6g/L、二硫苏糖醇500mg/L、尼泊金丁酯300‑800 mg/L。本发明具有繁殖系数高、培养周期短、效率高、移栽成活率高、方便运输、操作简便、成本低的优点。

说明书

技术领域

本发明属于生物领域，具体涉及一种培育紫脊百合试管小鳞茎的方法。

背景技术

宜昌百合是中国特有种，主要分布在湖北和四川，花为喇叭形，有微香，不仅可以提取精油 ，而且具有较高的观赏价值，可用于园林绿化行业，其鳞茎具有镇痛、消炎拔毒、抑菌、抗氧化等作用，可用于功能性食品和药品的开发。紫脊百合野生资源主要分布在甘肃陇南、甘南等秦巴山区沿线；紫脊百合作为宜昌百合的变种，在功能和用途上与宜昌百合具有相似性，在形态上与宜昌百合的区别在于花被片外面为紫色或褐色脊带，紫脊百合分布的海拔在1500-2500m，明显高于宜昌百合分布的海拔范围450-1500m，因此，紫脊百合的耐寒抗旱性强于宜昌百合，年生长期和生长量都小于宜昌百合。特殊的生境塑造了紫脊百合特殊的生物性状，据笔者野外调查及当地农民介绍：紫脊百合繁殖较为困难，生长缓慢，民间有采挖供观赏和食用其鳞茎的习惯，但受制于其繁殖性能，目前尚未规模化种植。

关于紫脊百合的文献报道甚少，但作为一种具有潜在的巨大开发价值的野生资源，对其进行系统地研究具有重大的意义。关于紫脊百合的繁殖问题，笔者采用百合传统的繁殖方法进行了相关研究并总结如下：紫脊百合主要有种子繁殖和鳞片扦插繁殖两种方式，未观察到分株繁殖和株芽繁殖。紫脊百合种子存在形态和生理双重休眠、种子发芽率低（第一个生长周期发芽率大约10%，第二个生长周期发芽率大约50%）、幼苗生长缓慢、实生苗育苗周期长；鳞片扦插繁殖受到次生代谢产物含量高的影响繁殖效率低下（外层鳞片染菌严重、内层鳞片不易分化、只有中层鳞片分化1-2个小鳞茎）、周期长（鳞片基质扦插需要经过6个月的休眠才能开始分化小鳞茎，鳞片大田春季扦插和夏季扦插都要等到秋季或次年春季才开始生长）。

百合组织培养常用到的方法是通过不定芽或体细胞胚诱导的方式培养百合幼苗，进而促进幼苗生根和小鳞茎的膨大，上述方法的不足之处在于幼苗及叶片的生长消耗了大量的营养、费力耗时、增加成本，而且受制于组培条件下光照强度和二氧化碳浓度的问题，组培中产生的叶片光合效率十分低下，炼苗移栽时部分叶片枯死，需要重新长出新的叶片，消耗小鳞茎的营养，造成幼苗生长缓慢，因此，上述方法并不是一种高效的培养策略。

发明内容

本发明的目的是提供一种紫脊百合试管小鳞茎繁殖方法，以解决现有百合组织培养常用到的方法对于紫脊百合繁殖会造成幼苗生长缓慢的问题。

本发明技术方案如下：一种紫脊百合试管小鳞茎繁殖方法，包括以下步骤：

（1）鳞片外植体的消毒

采挖可开花的成年紫脊百合鳞茎，除去最外层有病斑的鳞片，冲洗干净，沿着鳞茎盘将外层和中层鳞片掰下，浸泡，冲洗干净，切去鳞片尖部1/3部分，剩余鳞片纵切为1.5-2厘米的条状备用；

（2）试管小鳞茎的诱导

以上述鳞片为外植体，接种于小鳞茎诱导培养基中，在黑暗条件，温度为25-27℃培养，

小鳞茎诱导培养基由基础培养基和激素组成，基础培养基组成如下: MS基本培养液、蔗糖60g/L、精氨酸0.5g/L、谷氨酰胺0.5g/L、活性炭2g/L、琼脂6g/L、二硫苏糖醇500mg/L、尼泊金丁酯300-800 mg/L；

激素组成如下：吲哚乙酸3mg/L、细胞分裂素3mg/L、油菜素内酯0.3-0.7 mg/L、茉莉酸甲酯5-13 mg/L；

（3）试管小鳞茎的膨大和生根

将上述长有小鳞茎的鳞片转接入小鳞茎膨大和生根培养基，暗培养;

(4)小鳞茎催芽生长

将上述生根小鳞茎从培养基中取出，流水冲洗干净后，播种于混合基质中，置于自然条件下生长。

优选地，所述鳞片外植体的消毒步骤中：对外层和中层的鳞片用0.2%的升汞浸泡15-20分钟。

优选地，所述步骤（2）细胞分裂素为反式玉米素或6-苄基腺嘌呤。

优选地，所述步骤（2）尼泊金丁酯浓度为600 mg/L。

优选地，所述步骤（2）油菜素内酯浓度为0.5 mg/L，

优选地，所述步骤（2）茉莉酸甲酯的浓度为8mg/L。

优选地，所述步骤（3）小鳞茎膨大和生根培养基由基本培养基和激素构成，基本培养基的组成为：MS基本培养液、蔗糖60g/L、酸水解酪蛋白1g/L、精氨酸0.5g/L、谷氨酰胺0.5g/L、活性炭2g/L、琼脂6g/L，激素为吲哚乙酸0.5mg/L、独角金内酯0.3-0.8mg/L和植物生长调节剂5-20mg/L。

优选地，所述植物生长调节剂为烯效唑或茉莉酸甲酯。

优选地，所述独角金内酯的浓度为0.5mg/L，所述烯效唑的浓度为8mg/L，所述茉莉酸甲酯的浓度为20mg/L。

优选地，所述小鳞茎催芽生长步骤中生根小鳞茎浸泡在3-10 mg/L karrikinolide溶液中，浸泡60分钟，混合基质为体积比为1：1的蛭石和珍珠岩。

本发明小鳞茎诱导基础培养基中的成分MS基本培养液、60g/L蔗糖为外植体材料的培养提供了基本的矿质营养和炭源；0.5g/L精氨酸、0.5g/L谷氨酰胺的添加增加了培养基中有机胺的含量，有助于小鳞茎的形成；2g/L活性炭的添加不仅提供了黑暗的环境，而且可以吸附培养过程中产生的醌类等有害物质，500 mg/L二硫苏糖醇的添加有效的抑制了褐化，在这些基本条件的基础上添加尼泊金丁酯和不同的激素才能够最终达到诱导试管小鳞茎的目的。尼泊金丁酯的有益作用在于显著降低了外植体污染率，抑制了外植体内生真菌的生长，而对外植体自身的生长发育没有明显的抑制作用。

鳞片外植体在小鳞茎诱导培养基培养25天，试管小鳞茎开始发生，60天时平均每个外植体产生2-3个试管小鳞茎，直径0.5-0.8厘米，并且开始有发芽长叶的趋势。试管小鳞茎在鳞片上直接发生，有别于不定芽和体细胞胚途径先长叶后基部膨大产生小鳞茎的方式。

小鳞茎膨大和生根基础培养基中的成分MS基本培养液、60g/L蔗糖为小鳞茎的膨大和生根提供了基本的矿质营养和炭源；1g/L酸水解酪蛋白、0.5g/L精氨酸、0.5g/L谷氨酰胺的添加增加了培养基中小分子氨基酸的含量，小分子有机氮的加入有助于喜氮作物紫脊百合的生长和膨大；2g/L活性炭的添加不仅提供了黑暗的环境，而且可以吸附培养过程中产生的醌类等有害物质。在此基础上不同激素的添加才能够达到促进小鳞茎膨大和生根的目的。

小鳞茎膨大和生根基础培养基中独角金内酯GR24 和烯效唑S-3307的添加或茉莉酸甲酯MEJA的添加有效抑制了叶片的生长，降低了组培过程中低光合效率叶片的生长对小鳞茎营养的消耗，但不影响叶芽的发生，促进了小鳞茎的生根和膨大，抑制了多头现象的发生，为提高试管小鳞茎的移栽成活率和发芽率提供了保障。

本发明针对紫脊百合繁殖中的各种困难，研究出一种外植体直接诱导试管小鳞茎发生，进而诱导小鳞茎膨大和生根，生根小鳞茎随即催芽移栽的方法。采用组织培养生产试管小鳞茎的方式显著的提高了繁殖系数、缩短了繁殖周期，该方法有效抑制了组培过程中叶片的生长，具有繁殖系数高、培养周期短、效率高、移栽成活率高、方便运输、操作简便、成本低的优点，能够有效提高从试管到大田的繁殖效率，对紫脊百合资源保护及种球生产具有重要意义。为紫脊百合工厂化种球繁殖奠定了坚实的基础。

具体实施方式

下面的实施例可以进一步说明本发明，但不以任何方式限制本发明。

实施例中各原料来源如下：吲哚乙酸（IAA），油菜素内酯（BR），独角金内酯（GR24），茉莉酸甲酯（MEJA），烯效唑（S-3307），反式玉米素（ZT），6-苄基腺嘌呤（6-BA），二硫苏糖醇（DTT），尼泊金丁酯购自上海源叶生物科技有限公司；karrikinolide购自百灵威科技。

水溶性肥料（氮磷钾含量比例为15-15-30+微量元素TE）购自摩尔化工。

以下实验所使用的紫脊百合鳞茎均采自陇南市文县海拔1800米以上，经鉴定为紫脊百合，鳞茎为开花紫脊百合，新鲜或4℃贮藏备用的鳞茎。

实施例1-实施例12：小鳞茎的诱导

一、鳞片外植体消毒：除去紫脊百合最外层有病斑的鳞片，沿着鳞茎盘将外层和中层鳞片掰下，流水冲洗干净，0.2%的升汞浸泡15-20分钟，灭过菌的蒸馏水冲洗干净，切去鳞片尖部1/3部分，剩余鳞片纵切为1.5-2厘米的条状备用。

二、试管小鳞茎的诱导

以上述鳞片为外植体，在温度为25-27℃的黑暗条件下，接种于小鳞茎诱导培养基中，小鳞茎诱导培养基包括基础培养基并添加不同激素进行培养，基础培养基组成为：MS基本培养液、蔗糖60g/L、精氨酸0.5g/L、谷氨酰胺0.5g/L、活性炭2g/L、琼脂6g/L、二硫苏糖醇500 mg/L、尼泊金丁酯，培养基的pH值为6，共培养60天（30天时更换一次相同培养基）。不同激素的配比见表2。

不同实施例的尼泊金丁酯的用量见表1，实施例4-实施例12中尼泊金丁酯的浓度为600mg/L。

实施例的方案表明，随着升汞浸泡时间的延长，染菌率降低，但鳞片外植体活性也降低。

《抑菌试验》

尼泊金丁酯抑菌试验及结果见表1，对比例1的条件参见实施例1，不同之处在于不添加尼泊金丁酯。

试验结果表明尼泊金丁酯能显著的抑制杂菌，随着尼泊金丁酯浓度的增加，染菌率逐渐降低，但仍然不能完全的抑制染菌，考虑到成本因素，600mg/L的尼泊金丁酯浓度为优选浓度。

《不同配比的激素效果试验》

试管小鳞茎的诱导配方中不同配比的激素效果试验结果见表2-1和表2-2，对比例2-5的激素的用量见表2-2，其余条件同实施例1。注：以下数据均为3个重复试验的平均值。

由表2可以看出，生长素IAA和细胞分裂素（ZT或6-BA)浓度比为1:1时，不能诱导出试管小鳞茎，但随着时间的延长，60天前后外植体开始膨大，有发生愈伤组织的迹象；当浓度比为1:10时，60天前后50%的外植体开始产生不定芽。当加入油菜素内酯BR和茉莉酸甲酯MEJA时，有效促进了试管小鳞茎的诱导，随着BR浓度的升高，诱导小鳞茎发生所需的时间有缩短的趋势，平均每片外植体产生试管小鳞茎的个数有增加的趋势，但高浓度的BR(0.7mg/L)表现出诱导愈伤组织的趋势。随着MEJA浓度的增加，诱导小鳞茎发生所需的时间有缩短的趋势，平均每外植体产生试管小鳞茎的个数有增加的趋势，但高浓度的MEJA(13mg/L) 外植体褐化有增加的趋势。作为优选，吲哚乙酸（IAA）浓度为3mg/L，反式玉米素(ZT) 浓度为3mg/L，油菜素内酯（BR）浓度为0.5 mg/L、茉莉酸甲酯（MEJA）浓度为8mg/L及吲哚乙酸（IAA）浓度为3mg/L，6-苄基腺嘌呤（6-BA）浓度为3mg/L，油菜素内酯（BR）浓度为0.5 mg/L、茉莉酸甲酯（MEJA）浓度为8mg/L为最佳配方。

实施例13-实施例22：试管小鳞茎膨大和生根

将长有小鳞茎的鳞片转接入小鳞茎膨大和生根培养基，在每天22℃10小时/16℃14小时的变温条件下暗培养，20天时将小鳞茎与鳞片分离，转入相同的培养基，在相同条件下继续培养至60天。此时，试管小鳞茎根长大约1-3厘米，直径大约1-1.3厘米，小心收获小鳞茎用于基质移栽。

试管小鳞茎膨大和生根培养基由基本培养基添加不同组合和浓度的激素构成，基本培养基的组成为：MS基本培养液、蔗糖60g/L、酸水解酪蛋白1g/L、精氨酸0.5g/L、谷氨酰胺0.5g/L、活性炭2g/L、琼脂6g/L，pH值6.0。不同激素的配比见表3。

《小鳞茎的膨大和生根的效果实验》

表3为小鳞茎的膨大和生根的效果实验结果，对比例6激素的用量见表3，其余条件同实施例13。注：以下数据均为3个重复试验的平均值。

由表3可以看出，方案1中GR24 和S-3307的添加，方案2中GR24和MEJA的添加有效抑制了叶片的生长，但不影响叶芽的发生；显著促进了小鳞茎的生根和膨大，抑制了多头现象的发生。随着GR24 浓度的增加，生根需要的时间有缩短的趋势，小鳞茎的直径有增加的趋势，但根长有缩短的趋势。随着S-3307浓度的增加，小鳞茎直径有增加的趋势，根长有缩短的趋势。随着MEJA浓度的增加，根长有缩短的趋势，高浓度的MEJA（25mg/L）的使用表现出小鳞茎老化趋势。总体分析，方案 2各处理较方案1各处理根更长 、更粗壮。 综合考虑，吲哚乙酸（IAA）浓度为0.5mg/L、独角金内酯（GR24）浓度为0.5mg/L、烯效唑（S-3307）浓度为8mg/L及吲哚乙酸（IAA）浓度为0.5mg/L、独角金内酯（GR24）浓度为0.5mg/L、茉莉酸甲酯（MEJA）20mg/L为最佳配方。

实施例23-实施例26：小鳞茎催芽生长

将生根小鳞茎根长2厘米时从培养基中取出，流水冲洗干净后，浸泡在3-10 mg/Lkarrikinolide 溶液中，浸泡浓度见表4，浸泡60分钟，播种于体积比为1：1的蛭石和珍珠岩的混合基质中，置于自然条件下生长。每7天浇灌1次1g/L的水溶性肥料，水溶性肥料型号为（15-15-30+TE）。播种后20天左右长出叶片，待自然倒苗后，收获种球，用于次年的大田栽培。

《小鳞茎催芽生长试验》

小鳞茎催芽生长处理及结果见表4，对比例7不添加karrikinolide 溶液，其他条件同实施例23。

由表4可以看出，随着Karrikinolide浓度的升高，小鳞茎发芽时间提前，随着Karrikinolide浓度的继续升高（8 mg/L和10 mg/L）促进效果差异不显著。但较对比例而言，Karrikinolide具有明显的促进小鳞茎发芽长叶的作用。水溶性肥料的施入为基质培养提供了基本的营养条件。