一种治疗非小细胞肺癌的联合用药物

摘要

本发明所述的一种治疗非小细胞肺癌的联合用药物，该药物的活性成分包括美洲大蠊和吉非替尼，其中，所述的美洲大蠊是美洲大蠊提取物或美洲大蠊药粉，所述的药物的活性成分重量配比为：美洲大蠊提取物：吉非替尼＝4200～5000：233；优选地，美洲大蠊提取物：吉非替尼＝4500：233；美洲大蠊药粉：吉非替尼＝2300～3200：233；优选地，美洲大蠊药粉：吉非替尼＝3000：233。所述的药物在治疗癌症方面有明显的效果，特别是在非小细胞肺癌治疗药物方面效果显著，所述的美洲大蠊和吉非替尼联用后具有明显的增效作用，其效用高于单独使用吉非替尼或美洲大蠊，同时能够降低单独使用吉非替尼或美洲大蠊时所产生的耐药性，从而保证其在治疗癌症中的效果。

说明书

技术领域

本发明属于医药领域，特别涉及一种更治疗非小细胞肺癌的联合用药物。

背景技术

肺癌是临床常见的恶性肿瘤，在诸多癌症中，肺癌位居全球癌症死亡率中的第一位，非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer，简称NSCLC)占肺癌的80％。肺癌是率先在临床中应用靶向治疗的癌症种类之一。小分子化合物酪氨酸激酶抑制剂在临床上广泛应用于NSCLC患者的靶向治疗，其靶点为表皮生长因子受体(Epidermal Growth FactorReceptor，EGFR)。

吉非替尼(Gefitinib)，化学名为4-(3-氯-4-氟苯胺)-7-甲氧基-6-(3-异构亚丙氧基)喹唑啉，为人工合成苯胺喹唑啉化合物，是一种选择性表皮生长因子受体(EGFR)酪氨酸激酶抑制剂。适用于表皮生长因子受体酪氨酸激酶(EGFRTK)基因具有敏感突变的局部晚期或转移性非小细胞肺癌(NSCLC)患者的三线、二线甚至一线治疗。吉非替尼是在临床上应用于EGFR突变的NSCLC患者的靶向药物之一。吉非替尼在治疗非小细胞肺癌中取得了显著的疗效，但长期使用后，会产生一定的耐药性和副作用。有研究表明某些中药可降低抗癌药物在使用过程中产生的耐药性和副作用，从而提高其治疗效用。

美洲大镰(Periplaneta american)属昆虫纲，蜚镰科。目前研究中发现美洲大蠊乙醇提取物体外对肺癌(Lewis)、慢性髓源性白血病(K562)、原髓细胞白血病(HL60)、小鼠白血病(P388D1)细胞株，鼻咽癌(CNE)、肺癌(A549)、口腔上皮癌(KB)细胞株，卵巢癌(HO8910)、宫颈癌(Hela)和前列腺癌(PC3)细胞株，食管癌(Ecal09)、胃腺癌(BGC823)、结肠癌(LS174T)细胞株具有生长抑制作用。目前，尚未见美洲大蠊与吉非替尼的联合用药物用于癌症治疗相关报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种治疗非小细胞肺癌的联合用药物，该药物的活性成分包括美洲大蠊和吉非替尼，并公开了所述药物的制备方法以及在治疗非小细胞肺癌的药物中的应用。

1.本发明所述的药物的活性成分包括美洲大蠊和吉非替尼。

其中，所述的美洲大蠊为美洲大蠊提取物或美洲大蠊药粉。

进一步，所述的药物的活性成分重量配比为：美洲大蠊提取物：吉非替尼＝4200～5000：233；

优选地，美洲大蠊提取物：吉非替尼＝4500：233。

进一步，所述的药物的活性成分重量配比为：美洲大蠊药粉：吉非替尼＝2300～3200：233；

优选地，美洲大蠊药粉：吉非替尼＝3000：233。

进一步，所述的美洲大蠊提取物的制备方法为：

称取美洲大蠊，粉碎，加入原药材重量的10～12倍的70～90％的乙醇在70～95℃下回流提取3次，时间为1～3小时，过滤，滤液减压浓缩后，在60～65℃测其比重为1.10～1.20，浓缩液中加入浓缩液重量的10～12倍的纯水，70～80℃下搅拌20分钟，冷藏静置，上层油脂用滤纸吸去，将下层液经过滤后再减压浓缩、干燥、粉碎，即为美洲大蠊提取物。

进一步，所述的美洲大蠊药粉的制备方法为：

将美洲大蠊成虫置于放置于真空干燥器中，在20～55℃下干燥至含水量为2～5％，得干燥的美洲大蠊成虫；将干燥的美洲大蠊成虫置于温度设置为-200℃～-50℃的超低温粉碎机中粉碎至80～300目，即得美洲大蠊药粉。

2.本发明还提供了美洲大蠊和吉非替尼的联合用药物在制备治疗非小细胞肺癌药物上的应用。

其中，所述的美洲大蠊是美洲大蠊提取物或美洲大蠊药粉。

其中，所述的癌症包含肺癌、子宫内膜癌、肝癌、食道癌、胃癌、鼻咽癌、结肠癌、乳腺癌、头颈部癌、卵巢癌、宫颈癌、膀胱癌。

其中，所述的治疗非小细胞肺癌的药物为美洲大蠊和吉非替尼联合用药物；还可以加上药学上可接受的辅料或辅助性成分。

本发明所述的一种治疗非小细胞肺癌的联合用药物，该药物的活性成分包括美洲大蠊和吉非替尼，所述的药物在癌症治疗方面有明显的效果，特别是在非小细胞肺癌治疗方面效果显著，并且能够降低单独使用吉非替尼或美洲大蠊治疗癌症时所产生的耐药性，从而增加其治疗癌症的效用。

附图说明

图1是梯度浓度下的吉非替尼对A549和A549/ZD细胞活力的影响

具体实施方式

以下结合实施例的具体实施方式对本发明的内容作进一步的详细说明。以下的具体实施方式并不是对本发明的限制，根据本发明的内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

实施例1美洲大蠊提取物的制备

称取美洲大蠊，粉碎，加入原药材重量的12倍的80％的乙醇在80℃下回流提取3次，时间为1小时，过滤，滤液减压浓缩至比重为1.10～1.20(60～65℃测)，浓缩液中加入浓缩液重量的12倍的纯水，75℃下搅拌20分钟，冷藏静置，上层油脂用滤纸吸去，将下层液过滤后再减压浓缩、干燥、粉碎，即为美洲大蠊提取物。

实施例2美洲大蠊药粉的制备

将美洲大蠊成虫置于放置于真空干燥器中，在45℃下干燥至含水量为2％，得干燥的美洲大蠊成虫；将干燥的美洲大蠊成虫置于温度设置为-150℃的超低温粉碎机中粉碎至200目，即得美洲大蠊药粉。

实施例3

所述美洲大蠊与吉非替尼的联合用药物按照重量份计包括：实施例1所述的美洲大蠊提取物4500mg，吉非替尼233mg。

实施例4

所述美洲大蠊与吉非替尼的联合用药物按照重量份计包括：实施例2所述的美洲大蠊药粉3000mg，吉非替尼233mg。

实施例5

所述美洲大蠊与吉非替尼的联合用药物按照重量份计包括：实施例1所述的美洲大蠊提取物4200mg，吉非替尼233mg。

实施例6

所述的美洲大蠊与吉非替尼联合用药物按照重量份计包括：实施例1所述的美洲大蠊提取物5000mg，吉非替尼233mg。

实施例7

所述美洲大蠊与吉非替尼的联合用药物按照重量份计包括：实施例2所述的美洲大蠊药粉2300mg，吉非替尼233mg。

实施例8

所述的美洲大蠊与吉非替尼联合用药物按照重量份计包括：实施例2所述的美洲大蠊药粉3200mg，吉非替尼233mg。

以上实施例3～实施例8任意一项所述的美洲大蠊与吉非替尼的联合用药物可以加上药学上常用的辅料或辅助性成分，制成胶囊剂、片剂、缓释制剂、液体制剂等口服制剂；

以下将通过实验例对本发明所述的药物在制备治疗癌症药物中的应用做进一步的说明。

实验例1本发明所述的药物在制备治疗非小细胞肺癌药物中的应用

1材料

1.1实验动物

健康清洁级BALB/c-nu裸鼠60只，4周龄，体质量15-18g，购自成都达硕实验动物有限公司。

1.2细胞株

人肺癌细胞系A549，系四川大学生物治疗国家重点实验室惠赠。

1.3主要试剂

本实施例中使用的美洲大蠊提取物为实施例1中所述的美洲大蠊提取物，美洲大蠊药粉为实施例2中所述的美洲大蠊药粉。

吉非替尼(易瑞沙，250mg)购自阿斯利康制药有限公司，4℃保存。本实验所用吉非替尼配制方法如下：250mg吉非替尼溶于27.97ml DMSO中配成20mM的浓度，分装，-20℃保存。

RPMI-1640培养基、胰酶、二甲基亚砜(DMSO)、噻唑蓝(MTT)和结晶紫均购自Sigma公司；胎牛血清购自Thermo公司产品；生理盐水、青霉素/链霉素为Solarbio公司产品。

2方法

2.1细胞培养

人小细胞肺癌细胞株A549，用含10％胎牛血清，1:100青霉素/链霉素双抗的RPMI-1640培养基培养，置于37℃，5％CO₂的饱和湿度恒温培养箱中，每2-3天以1:3-1:5的比率传代。

2.2制备稳定耐药细胞株，计算耐药倍数

将A549细胞暴露于吉非替尼(200nM)长达3个月，挑选出耐吉非替尼的细胞，克隆成为A549/ZD细胞系，使其具有对吉非替尼稳定耐药的能力。

收集长势形态良好、处于指数生长期的人肺癌细胞A549及其耐药细胞A549/ZD，0.25％胰蛋白酶+0.02％EDTA消化离心，显微镜下计数后培养基重悬成合适的细胞浓度，接种于96孔板，每孔100ul。5％CO₂、37℃孵育24h后置4℃冰箱12h使细胞生长同步化，弃去原培养基，加入含不同浓度吉非替尼的RPMI-1640培养基，使其终浓度分别为0.01、0.05、0.1、0.2、0.5、1、5、10umol/L，每个浓度均设3个平行复孔，对照组只加细胞和培养基，共孵育48h后用MTT法检测各孔OD值，按公式计算耐药倍数。耐药倍数＝耐药细胞IC50值/敏感细胞IC50值。

2.3MTT法测定无细胞毒的美洲大蠊提取物和美洲大蠊药粉浓度

细胞培养及处理方法同上，实验分成3组：空白组、对照组及实验组。空白组只加入RPMI-1640培养基，无需接种细胞；对照组加培养基并接种细胞；实验组在上述基础上再分别加入不同浓度的美洲大蠊提取物和美洲大蠊药粉，使其最终浓度分别为5、10、20、40、80、100、120ug/ml，置于培养箱孵育72h后每孔加入5mg/ml MTT 15ul，继续孵育4h，弃上清，每孔加入DMSO150ul，静置30min，待结晶完全溶解。用酶标仪检测570nm处各孔吸光值OD值，计算肿瘤细胞生长抑制率(inhibition ratio，IR)。抑制率(IR)＝(1-药物组OD值/对照组OD值)×100％，取抑制率10％以下浓度的美洲大蠊提取物和美洲大蠊药粉作为无毒剂量的逆转浓度。

2.4检测无细胞毒浓度美洲大蠊提取物和美洲大蠊药粉逆转人肺腺癌耐药株A549/ZD的作用

细胞培养以及实验方法同上，实验分组如下：A549/ZD组、A549/ZD+美洲大蠊提取物5ug/ml组、A549/ZD+美洲大蠊药粉5ug/ml组，实验组分别加入吉非替尼终浓度为0.01、0.05、0.1、0.2、0.5、1、5、10umol/L，测定各孔的OD值，观察无细胞毒性美洲大蠊提取物(5ug/ml)和美洲大蠊药粉(5ug/ml)联合吉非替尼作用于A549/ZD后，吉非替尼对A549/ZD细胞杀伤作用的变化，计算吉非替尼对人肺腺癌A549/ZD的IC50，并得出逆转倍数。逆转倍数(fold reversal，FR)＝逆转前IC50值/逆转后IC50值。

2.5建模、分组及给药

为进一步验证美洲大蠊和吉非替尼联用对耐药细胞株A549/ZD移植瘤增殖的抑制效应，我们在裸鼠皮下种植移植瘤，待移植瘤长到约20mm3，将裸鼠随机分成6组，对照组、吉非替尼单药组、美洲大蠊提取物单药组、美洲大蠊药粉单药组、吉非替尼+美洲大蠊提取物组(实施例3)、吉非替尼+美洲大蠊药粉组(实施例4)；根据人和动物间体表面积折算的等效剂量比值，我们分别给予了吉非替尼35mg/Kg，美洲大蠊提取物675mg/Kg，美洲大蠊药粉450mg/Kg，腹腔注射，每3天一次，持续15天。称量小鼠体重后剥离、称重肿瘤块，并根据肿瘤重量计算肿瘤抑制率，按照以下公式计算：

肿瘤抑制率＝(对照组平均瘤重-用药组平均瘤重)/对照组平均瘤重×100％。

3结果

3.1吉非替尼对A549及A549/ZD的IC50

取3个平行复孔的平均值，用GraphPad Prism5软件绘制药物与细胞抑制率的柱形图，见图1，计算其IC50值，吉非替尼对小细胞肺癌细胞A549以及耐药细胞A549/ZD的IC50分别为0.21umol/L和5.45umol/L。按公式计算出耐药倍数为25.9。

3.2MTT法测定无细胞毒的美洲大蠊提取物和美洲大蠊药粉浓度结果

表1美洲大蠊提取物和美洲大蠊药粉对A549、A549/ZD的抑制率

由表1中的结果可知，美洲大蠊提取物、美洲大蠊药粉对人小细胞肺癌细胞A549以及耐药细胞A549/ZD均有抑制增殖的作用，且呈现剂量依赖性。当其浓度低于10ug/ml时，对人小细胞肺癌A549以及耐药细胞A549/ZD的抑制率均低于10％，没有细胞毒性。

3.3美洲大蠊提取物和美洲大蠊药粉对人肺癌耐药细胞A549/ZD的逆转作用

表2美洲大蠊提取物和美洲大蠊药粉对A549/ZD细胞的逆转作用

细胞分组IC50(ug/ml)FRA549/ZD吉非替尼5.45—A549/ZD吉非替尼+美洲大蠊提取物3.251.67A549/ZD吉非替尼+美洲大蠊药粉2.032.68

由表2中的结果可知，美洲大蠊提取物和美洲大量药粉无细胞毒浓度(5ug/ml)联合吉非替尼作用于人肺癌耐药细胞A549/ZD之后，吉非替尼对A549/ZD的IC50降低。5ug/ml美洲大蠊提取物作为逆转剂时，吉非替尼对A549/ZD的IC50为3.25，FR为1.67，以5ug/ml美洲大蠊药粉作为逆转剂时，吉非替尼对A549/ZD的IC50为2.03，FR为2.68。

3.4美洲大蠊联合吉非替尼能协同抑制A549/ZD抑制瘤的生长

表3各药物组对A549/ZD荷瘤小鼠肿瘤体积和瘤重的影响(n＝10)

注：与对照组相比(^*P<0.05，^**P<0.01)；与吉非替尼相比(▲P<0.05，▲▲P<0.01)。

由表3中的结果可知，美洲大蠊与吉非替尼联用后对A549/ZD的抑制率可达到82.01％～87.69％，其中美洲大蠊药粉与吉非替尼的联用抑瘤效果更佳；美洲大蠊与吉非替尼联合使用后较美洲大蠊药粉、美洲大蠊提取物或吉非替尼单独使用对A549/ZD的抑制效果更明显。因此，美洲大蠊与吉非替尼两者的联合使用具有协同增效的作用。

综上所述，通过实验例中的研究表明，美洲大蠊提取物、美洲大蠊药粉对人小细胞肺癌细胞A549以及耐药细胞A549/ZD均有抑制增殖的作用，且呈现剂量依赖性，与吉非替尼联合用药后，吉非替尼对人肺癌耐药细胞A549/ZD的IC50降低，说明美洲大蠊与吉非替尼的联合用药可减少了单独使用吉非替尼所产生的耐药性；美洲大蠊提取物、美洲大蠊药粉以及吉非替尼单药即表现出抑制肿瘤生长的作用，二者联用后其抑制作用显著提高，抑瘤率可达到82.01％～87.69％，美洲大蠊药粉与吉非替尼联用较美洲大蠊提取物与吉非替尼联用对A549/ZD的抑制效果更好。因此，美洲大蠊与吉非替尼两者的联合使用具有协同增效的作用，在癌症治疗药物方面有明显的效果，特别是在非小细胞肺癌治疗药物方面效果显著。