LDLR基因突变体及其应用

摘要

本发明公开了LDLR基因突变体及其应用，涉及分离的编码LDLR突变体的核酸、分离的多肽、筛选易感高胆固醇血症的生物样品的方法、筛选易感高胆固醇血症的生物样品的试剂盒、包括LDLR突变体的核酸的突变体和重组细胞以及降低血浆低密度脂蛋白胆固醇的LDLR基因突变体重组蛋白。其中，该分离的编码LDLR突变体的核酸，与SEQ NO：1相比，所述核酸具有选自下列的至少一种突变：c.C2164T、c.G2146T、c.G2167T、c.A2188T、c.C2215T、c.C2230T以及c.G2287T，使所述LDLR基因的表达终止。通过检测该新突变体在生物样品中是否存在，可有效地检测生物样品是否易感高胆固醇血症疾病。同时该LDLR基因突变体重组蛋白可以降低血浆中低密度脂蛋白胆固醇浓度。

说明书

技术领域

本发明涉及LDLR基因突变体及其应用。具体地，本发明涉及分离的编码LDLR突变体的核酸、一种分离的多肽，一种筛选易感高胆固醇血症的生物样品的方法，一种筛选易感高胆固醇血症的生物样品的系统，一种筛选易感高胆固醇血症的生物样品的试剂盒以及降低血浆低密度脂蛋白胆固醇的LDLR基因突变体重组蛋白。

背景技术

家族性高胆固醇血症(Familial hypercholesterolemia，FH)是一种严重的常染色体显性单基因遗传性疾病。世界范围内FH杂合患者的发病率为1/500，成为最常见的代谢性疾病之一。纯合子患者症状严重，发病率为1/1000000，血浆低密度脂蛋白胆同醇(Low density lipoprotein cho1esterol，LDL-c)水平大幅度增高，多部位肌腱黄色瘤和早发动脉粥样硬化(Atherosclerosis，As)，严重者青少年时期可发生冠心病甚至心梗死亡。

LDLR基因突变是FH的主要病理基础，在临床确诊的FH患者中约50％可检测到LDLR基因突变。目前为止，英国FH的LDLR突变数据库(http：www.ucl.ac.uk/ldlr/LOVDv.1.1.0/)报道世界范围内LDLR基因突变有l,741种。有关我国人群FH的报道较少。

LDLR基因位于第19号染色体短臂(Chl9p13.1.13.3)，全长45kb，由18个外显子和17个内含子组成，编码含有839个氨基酸的前体蛋白。LDLR基因外显子区域可与LDLR蛋白7个结构域相对应：(1)启动子翻译信号区域；(2)外显子l编码的5’端序列及信号肽；(3)外显子2-6编码LDLR配体结合域；(4)外显子7-14编码EGF前体结构域；(5)外显子15编码LDLR氧连接糖链结构域；(6)外显子16和17编码跨膜结构域；(7)外显子17和18编码的胞浆区。

细胞内新合成的LDLR前体由860个氨基酸残基组成，分子量120KDa，在由内质网向尔基体转运中，切去由21个氨基酸残基组成的信号肤，加上18个氧连接和2个氮连接的寡糖链，成熟LDLR分子量160KDa，于合成后约45分钟时到达细胞表面，并丛集于由细胞内陷形成的特殊有被小窝(coatediPt)内。LDLR与LDL结合后，在有被小窝内吞成内体，多个内体相互融合为不规则的大泡，大泡膜上质子泵的活性使泡内pH降至6.5以下，在此酸性条件下，LDLR与LDL分离，前者回到细胞表面重新起作用，后者则进入溶酶体,在多种水解酶作用下分解代谢。LDLR基因突变引起细胞膜表面的LDL-R缺如或结构功能异常，导致肝脏对血循环低密度脂蛋白(lowdensity lipoprotein,LDL)清除障碍并在组织内过度淤积。

家族性高胆固醇血症亚型之一的常染色体隐性家族性高胆固醇血症(autosomal recessive hypercholesterolemia，ARH)，目前大多数ARH为LDLRAP1突变患者。ARH表型和LDLR纯合子相似，但同一ARH家系不同个体可有不同表型，并且较LDLR突变患者血清TC和LDL-c水平稍低，HDL-c稍高，无论辅以LDL血浆置换治疗，其对降脂药物的反应均较LDLR纯合FH患者敏感。ARH患者中冠心病的发病可相对延迟，目前报道病例的冠心病均发生于20岁之后，而FH纯合患者中超过40％的个体在20岁之前已发展为冠心病。本研究中，我们首次发现常染色体隐性高胆固醇血症LDLR突变患者。

由于LDLR对于胆同醇代谢至关重要，以致该基因任何部位出现突变均可致病。以LDLR蛋白合成与功能为基础突变可划分为5型：l型突变为不表达等位基因，包括启动子序列突变、无义突变、移码突变、剪接突变，这类突变导致细胞不表达LDLR；2型突变为转运缺陷型等位基因，主要发生在配体结合域和表皮生长因子前体结构域，虽然能合成受体，但从内质网向高尔基体的转运障碍，堆积在内质网中最终被降解；3型突变为结合缺陷型等位基因，本型较常见，特点为突变基因编码的异常受体蛋白可以到达细胞表面，但丧失了结合LDL的功能，这类突变同样发生在配体结合域和表皮生长因子前体结构域；4型突变为内移缺陷型等位基因，本型罕见，发生在胞浆区域或是跨膜域，由于编码NPVY序列的密码子发生突变而致，特点为受体能与LDL结合，但不能将其转运至细胞表面并聚集于被覆陷窝；5型突变为再循环缺陷型等位基因，受体能够结合LDL，也能内移进人细胞，但在溶酶体内不能与LDL分离，受体与配体被同时降解，导致LDLR不能够再循环到细胞表面，这类突变多发生在表皮生长因子前体结构域。而在我们的研究中，首次发现在氧连接糖链结构域发生终止突变，导致突变的LDLR不能正确的锚定在细胞膜上并分泌到胞外。分泌后的突变蛋白仍然具有LDL结合活性，但是转运LDL至肝细胞进行降解的效率降低。随着基因检测技术的发展，将有等多的LDLR基因突变被我们发现，为FH的基因诊断和治疗提供依据。目前最重要的降胆固醇药物有三类，即他汀类、胆固醇吸收抑制剂(依折麦布)与PCSK9抑制剂。这三类药物分别作用于胆固醇代谢的不同环节而发挥降低胆固醇的作用。他汀类药物是降低胆固醇最主要的药物，有非常好的风险-得益比，但是他汀类药物面临的两大严重问题：第一，15％患者对他汀类药物不耐受，临床实践中多少患者对大剂量、高强度他汀的依从性并不清楚；第二是他汀类药物有无法逾越的6％瓶颈(初始剂量基础上，剂量翻倍，降低LDL-c的效果仅增加6％，但副作用的风险却大幅增加)。新药依折麦布或者PCSK9抑制剂的临床得益并不弱，但是费用昂贵。本研究中，LDLR突变体重组蛋白能够降低血清中的LDL-c，为高胆固醇血症的治疗提供新的思路与方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供了一种分离的编码LDLR突变体的核酸、一种分离的多肽，该突变位点位于氧连接糖链结构域，使得LDLR突变体不能正确的锚定在细胞膜上而分泌到胞外，分泌的突变体蛋白仍具有LDL结合活性。本发明还涉及一种筛选易感高胆固醇血症的生物样品的方法，一种筛选易感高胆固醇血症的生物样品的系统，一种筛选易感高胆固醇血症的生物样品的试剂盒以及降低血浆低密度脂蛋白胆固醇的LDLR基因突变体重组蛋白。LDLR基因突变体重组蛋白，不同于其他降脂药物的抑制胆固醇合成或抑制胆固醇吸收而降低血浆胆固醇，重组蛋白直接改善LDL-c的受体LDLR。LDLR基因突变体重组蛋白作为一种蛋白类药物，具有高活性，特异性强，低毒性，生物功能明确，有了利于临床应用的特点。

根据本发明的第一方面，提供了一种分离的编码LDLR基因突变体的核酸，该核酸包括下列目标片段，所述目标片段与SEQ NO：1相比，具有选自下列的至少一种突变：c.C2164T、c.G2146T、c.G2167T、c.A2188T、c.C2215T、c.C2230T以及c.G2287T。该核酸包括下列目标片段，所述目标片段与SEQ NO：1相比，具有选自下列的至少一种突变：c.C2164T、c.G2146T、c.G2167T、c.A2188T、c.C2215T、c.C2230T以及c.G2287T。

根据本发明的另一方面，提供了一种分离的多肽，所述分离的多肽与SEQ ID NO:2相比，所述分离的多肽具有选自下列的至少一种突变：p.Q722X、p.D716X、p.E723X、p.K730X、p.Q739X、p.R744X以及p.E763X。

根据本发明的另一方面，提供了一种非诊断和治疗目的的筛选易感高胆固醇血症的生物样品的方法，包含以下步骤：

(1)从待检测生物样品提取核酸样本；

(2)以步骤(1)中的核酸样本为模板特异性扩增LDLR基因，回收纯化扩增产物，并确定所述扩增产物的核酸序列；

(3)判断步骤(2)所述核酸序列与SEQ ID NO:1相比，是否具有c.C2164T、c.G2146T、c.G2167T、c.A2188T、c.C2215T、c.C2230T以及c.G2287T突变，若有其中至少一种突变，则步骤(1)中所述的生物样品即为易感高胆固醇血症的生物样品。

根据本发明的另一方面，提供了一种非诊断和治疗目的的筛选易感高胆固醇血症的生物样品的方法，其特征在于，包含以下步骤：

(1)从待检测生物样品提取总蛋白样本；

(2)Western blot确定步骤(1)所述总蛋白样本中LDLR基因表达的多肽；

(3)判断步骤(2)所述多肽与SEQ ID NO:2相比，是否具有选自下列的至少一种突变：p.Q722X、p.D716X、p.E723X、p.K730X、p.Q739X、p.R744X以及p.E763X，若有其中至少一种突变，则步骤(1)中的生物样品即为易感高胆固醇血症的样品。

根据本发明的另一方面，提供了一种非诊断和治疗目的的检测高胆固醇血症的生物样品的试剂盒，其特征在于，含有适于检测LDLR基因突变体的试剂，其中所述LDLR基因突变体为上述LDLR基因突变。

优选地，所述试剂为核酸探针或引物；

优选地，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:3-4所示。

优选地，所述试剂为识别特异性位点的抗体。

根据本发明的另一方面，提供了一种非疾病诊断和治疗目的的筛选易感高胆固醇血症的生物样品的系统，包括：

核酸提取装置，所述核酸提取装置用于从所述生物样品提取核酸样本；

核酸序列确定装置，所述核酸序列确定装置与素数核酸提取装置相连，用于对所述核酸样本进行分析，以确定所述核酸样本的核酸序列；

判断装置，所述判断装置与所述核酸序列确定装置相连，以确定所述核酸样本的核酸序列与SEQ ID NO:1相比，是否具有c.C2164T、c.G2146T、c.G2167T、c.A2188T、c.C2215T、c.C2230T以及c.G2287T突变，若具有以上至少一种突变，即判断所述生物样品为易感高胆固醇血症的生物样品。

优选地，所述核酸提取装置进一步包括：

RNA提取单位，所述RNA提取单元用于从所述生物样品提取RNA样本；

反转录单元，所述反转录单元与所述RNA提取单位相连，用于对所述RNA样本进行反转录反应，以便获得cDNA样本，所述cDNA样本构成所述核酸样本。

优选地，所述核酸序列确定装置进一步包括：

文库构建单元，所述文库构建单元用于针对所述核酸样本，构建核酸测序文库；

测序单元，所述测序单元与所述文库构建单元相连，用于对所述核酸序列文库进行测序，以便获得由测序数据构成的测序结果。

优选地，所述文库构建单元进一步包括：

PCR扩增模块，所述PCR扩增模块中设置有LDLR基因外显子特异性引物，用于对所述核酸样本进行PCR扩增。

优选地，所述特异性引物具有如SEQ ID NO:3-4所示。

优选地，所述测序单元为HISEQ2000、SOLID、454、ABI3730或单分子测序装置。

根据本发明的另一方面，提供了一种构建体，包含以上分离的编码LDLR突变体的核酸。

根据本发明的另一方面，提供了一种重组细胞，所述重组细胞是通过以上构建体转化受体细胞获得的。

根据本发明的另一方面，提供了一种用于制备预防或治疗高胆固醇血症的药物的重组蛋白，所述重组蛋白由以上重组细胞表达。

根据本发明的另一方面，提供了一种用于制备预防或治疗高胆固醇血症的药物的重组蛋白，由以下步骤获得：

(1)构建含有权利要求1或2所述的分离的编码LDLR突变体的核酸的重组腺病毒；

(2)将步骤(1)所述的重组腺病毒酶切后获得两末端是ITR序列的线性双链DNA，将所述线性双链DNA转染到包装细胞中；

(3)所述重组腺病毒在细胞内成熟后，释放到培养液中；反复冻融细胞和培养液的混合物，离心收集上清，获得粗病毒；

(4)将步骤(3)所述的粗病毒重新感染包装细胞，当包装细胞出现病变斑时，收集包装细胞；反复冻融包装细胞，离心收集上清，并将上清转导细胞或组织，获得制备预防或治疗高胆固醇血症的药物的重组蛋白。

本发明具有以下有益效果：

第一方面，本发明通过全外显子组测序联合候选基因突变验证的方法确定了高胆固醇血症在氧连接糖链结构域片段上的致病突变。一方面，克服了高胆固醇血症基因突变多发生在配体结合结构域、EGF同源前体结构域、跨膜结构域的技术偏见，氧连接糖链结构域片段的突变同样发生了高胆固醇血症，这一结构域的功能可能为突出在胞外的结合结构域提供一个“柄”，使得大分子脂蛋白颗粒与配体结合结构域在空间上易于接近。发生在氧连接糖链结构域的突变，使原本锚定在细胞膜上的LDLR分泌到胞外，因其配体结合结构域完整，故其仍具有LDL结合活性，结合血液中的LDL进行清除。结合LDL的突变LDLR蛋白，一方面可能返回肝细胞进行脂质的降解，另一方面可能被体循环中的巨噬细胞等吞噬并清除。

第二方面，本发明通过检测受试者是否携带LDLR基因的致病突变，可以早期筛查受试者高胆固醇血症基因突变携带者，为分子诊断提供依据。收集受试者的外周血或其他生物样品，提取基因组DNA，检测本发明中的LDLR突变位点是否存在变异，并根据突变类型给与受试者不同的干预治疗。本发明中LDLR突变位点若为纯合突变，则受试者高胆固醇血症症状严重并伴有冠心病等其他心血管疾病；若为杂合突变，受试者患病症状不明显，其血脂水平稍高，但处在正常水平。

第三方面，本发明所提供的诊断试剂盒可用于快速、有效地预测或诊断高胆固醇血症。本发明中的LDLR突变位点较为罕见，在之前的研究中尚未报道过，在诊断试剂盒中收录本发明中的突变位点，可进一步丰富高胆固醇血症诊断试剂盒的诊断位点。

第四方面，本发明提供的治疗高胆固醇血症的重组蛋白不同于其他降脂药物的抑制胆固醇合成或抑制胆固醇吸收而降低血浆胆固醇，重组蛋白直接改善LDL-c的受体LDLR。LDLR基因突变体重组蛋白作为一种蛋白类药物，具有高活性，特异性强，低毒性，生物功能明确，利于临床应用。克服了他汀类药物的不耐受型，及其无法逾越的6％瓶颈。而新药依折麦布或者PCSK9抑制剂费用昂贵。

附图说明

图1是一个高胆固醇血症患者家系图谱。

图2是实施例1中高胆固醇血症患者先证者LDLR基因c.2164C>T突变位点的Sanger测序验证峰图。

图3是实施例1中先证者的母亲的LDLR基因c.2164C>T突变位点的Sanger测序验证峰图。

图4是具有c.2164C>T突变位点的LDLR重组腺病毒，尾静脉注射LDLR敲除鼠，血清中血脂四项指标图。T-CHO总胆固醇、TG甘油三酯、HDL-c高密度脂蛋白胆固醇、LDL-c低密度脂蛋白胆固醇。

图5是构建质粒载体转染HepG2细胞Western blot图，其中NC表示细胞中转染空载质粒，LDLR-Mut表示转染LDLR基因突变体质粒，LDLR-WT表示转染LDLR野生型质粒。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

根据本发明的第一方面，本发明提供了一种分离的编码LDLR基因突变体的核酸。在该基因片段的氧连接糖链结构域片段上，即在SEQ ID NO.1序列的2141位至2311位碱基之间，发生基因突变，使所述核酸的表达终止。所述核酸具有选自下列的至少一种突变：c.C2164T、c.G2146T、c.G2167T、c.A2188T、c.C2215T、c.C2230T以及c.G2287T。

在本文所使用的表达方式“编码LDLR突变体的核酸”，是指与编码LDLR突变体的基因相对应的核酸物质，即核酸的类型不受限制，可以是任何包含与LDLR突变体的编码基因相对应的脱氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸的聚合物，包括但不限于DNA、RNA或cDNA。

本提供了一种非诊断和治疗目的的筛选易感高胆固醇血症的生物样品的方法，包含以下步骤：

本发明还提供了一种非诊断和治疗目的的检测高胆固醇血症的生物样品的试剂盒，其特征在于，含有适于检测LDLR基因突变体的试剂，其中所述LDLR基因突变体为上述LDLR基因突变。所述试剂为核酸探针或引物，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:3-4所示。

本发明还提供了一种非疾病诊断和治疗目的的筛选易感高胆固醇血症的生物样品的系统，包括：

核酸提取装置，所述核酸提取装置用于从所述生物样品提取核酸样本；

核酸序列确定装置，所述核酸序列确定装置与素数核酸提取装置相连，用于对所述核酸样本进行分析，以确定所述核酸样本的核酸序列；

判断装置，所述判断装置与所述核酸序列确定装置相连，以确定基于所述核酸样本的核酸序列与SEQ ID NO:1相比，是否具有c.C2164T、c.G2146T、c.G2167T、c.A2188T、c.C2215T、c.C2230T以及c.G2287T突变，若具有以上至少一种突变，即判断所述生物样品为易感高胆固醇血症的生物样品。

所述核酸提取装置进一步包括：

RNA提取单位，所述RNA提取单元用于从所述生物样品提取RNA样本；

反转录单元，所述反转录单元与所述RNA提取单位相连，用于对所述RNA样本进行反转录反应，以便获得cDNA样本，所述cDNA样本构成所述核酸样本。

所述核酸序列确定装置进一步包括：

文库构建单元，所述文库构建单元用于针对所述核酸样本，构建核酸测序文库；

测序单元，所述测序单元与所述文库构建单元相连，用于对所述核酸序列文库进行测序，以便获得由多个测序数据构成的测序结果。

所述文库构建单元进一步包括：

PCR扩增模块，所述PCR扩增模块中设置有LDLR基因外显子特异性引物，以便利用所述引物，对所述核酸样本进行PCR扩增。

所述特异性引物具有如SEQ ID NO:3-4所示。

所述测序单元为HISEQ2000、SOLID、454、ABI3730或单分子测序装置。

本发明还提供了一种构建体，包含以上分离的编码LDLR突变体的核酸。

本发明还提供了一种重组细胞，所述重组细胞是通过以上构建体转化受体细胞获得的。

本发明还提供了一种用于制备预防或治疗高胆固醇血症的药物的重组蛋白，所述重组蛋白由以上重组细胞表达。

对于本发明说明书和权利要求书中，提及核酸，本领域技术人员应当理解，实际包括互补双链的任意一条，或者两条。为了方便，在本说明书和权利要求书中，虽然多数情况下只给出了一条链，但实际上也公开了与之互补的另一条链。例如，提及SEQ ID NO:1，实际包括其互补序列。本领域技术人员还可以理解，利用一条链可以检测另一条链，反之亦然。

该编码LDLR突变体的核酸，是发明人通过全外显子组测序联合突变验证的方法确定的高胆固醇血症的致病基因上的新突变。虽然有关于高胆固醇血症的基因的报道，但本发明人首次证实了LDLR基因与高胆固醇血症有关的新的突变位点，在现有技术中并未被提到。野生型的LDLR基因的cDNA序列如SEQ ID NO:1所示，共含有2583个碱基。LDLR基因位于19p13，编码的蛋白含有860个氨基酸，具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。

发明人发现的新突变体与SEQ ID NO:1相比，具有c.C2164T突变，即相对野生型LDLR基因，本发明的LDLR基因突变体的cDNA中第2164位的C突变为T，由此所编码的产物与蛋白(SEQ ID NO:2)相比，具有p.Q722X突变，即722位的Q(谷氨酰胺)突变为X(终止子)。或者其他同类型突变p.D716X即716位的D(天冬氨酸)突变为X(终止子)、p.E723X即723位的E(谷氨酸)突变为X(终止子)、p.K730X即730位的K(赖氨酸)突变为X(终止子)、p.Q739X即739位的Q(谷氨酰胺)突变为X(终止子)、p.R744X即744位的R(精氨酸)突变为X(终止子)、p.E763X即763位的E(谷氨酸)突变为X(终止子)或其无法正确表达的多肽。

根据本发明的第二个方面，本发明提供了一种分离的多肽。该多肽序列与SEQ ID NO.2相比，该分离的多肽具有pQ722X突变。根据本发明一些具体示例，该多肽是由前所述的分离的编码LDLR突变体的核酸编码的。通过检测生物样品中是否表达该多肽，可以有效地检测生物样品是否易感高胆固醇血症，也可以通过检测这些多肽在生物体中的存在，可以有效地预测生物体是否易感高胆固醇血症。

根据本发明的第三方面，本发明提出了一种筛选易患高胆固醇血症的生物样品的方法，该方法包括以下步骤：

(1)从待检测生物样品提取核酸样本；

(2)确定所述核酸样本的核酸序列；

(3)判断所述核酸序列与SEQ ID NO:1相比，是否具有c.C2164T、c.G2146T、c.G2167T、c.A2188T、c.C2215T、c.C2230T以及c.G2287T突变，若有其中至少一种突变，则步骤(1)中的生物样品即为易感高胆固醇血症的生物样品。

本发明提供了另外一种筛选易患高胆固醇血症的生物样品的方法，该方法包括以下步骤：

(1)从待检测生物样品提取蛋白样本；

(2)用渗透压法、光散射发、超速离心法、凝胶色谱法或聚丙烯酰氨凝胶电泳(western blot)确定LDLR基因表达的多肽。如图5实施例所示，所检测到的多肽是83KDa，表明该多肽在LDLR蛋白的722位发生了终止突变。

(3)判断所述多肽序列与SEQ ID NO:2相比，所述分离的多肽具有选自下列的至少一种突变：p.Q722X、p.D716X、p.E723X、p.K730X、p.Q739X、p.R744X以及p.E763X突变。

这些突变体与高胆固醇血症的发病密切相关，从而通过检测该新突变体在生物样品中是否存在，可以有效地检测生物样品是否易感高胆固醇血症，也可以通过检测这些突变体在生物体中是否存在，可以有效地预测生物体是否易感高胆固醇血症。

检测方法中生物样品的类型并不受特别限制，只要从该生物样品中能够提取到反映生物样品LDLR是否存在突变的核酸样本即可。生物样品可以为选自人体血液、皮肤、皮下组织的至少一种，优选外周血。由此，可以方便地进行取样和检测，从而能够进一步提高筛选易患高胆固醇血症的生物样品的效率。这里所使用的术语“核酸样本”应做广义理解，其可以是任何能够反映生物样品中LDLR是否存在突变的样本，例如可以是从生物样品中直接提取的全基因组DNA，也可以是该全基因组中包含LDLR编码序列的一部分，可以是从生物样品中提取的总RNA，也可以是从生物样品中提取的mRNA。由此，可以扩大生物样品的来源范围，并且可以同时对生物样品的多种信息进行确定，从而能够提高筛选易患高胆固醇血症的生物样品的效率。另外，根据本发明的实施例，针对采用RNA作为核酸样本，从生物样品提取核酸样本可以进一步包括：从生物样品提取RNA样本，优选RNA样本为mRNA；以及基于所得到的RNA样本，通过反转录反应，获得cDNA样本，所得到的cDNA样本构成核酸样本。由此，可以进一步提高利用RNA作为核酸样本筛选易患高胆固醇血症的生物样品的效率。

在得到核酸样本之后，可以对核酸样本进行分析，从而能够确定所得到核酸样本的核酸序列。确定所得到核酸样本的核酸序列的方法和设备并不受特别限制。可以通过测序的方法，确定核酸样本的核酸序列。可以用于进行测序的方法和设备并不受特别限制。可以采用第二代测序技术，也可以采用第三代以及第四代或者更先进的测序技术。根据本发明的具体示例，可以利用选自HISEQ2000、SOLID、454、ABI3730和单分子测序装置的至少一种对核酸序列进行测序。由此，结合最新的测序技术，针对单个位点可以达到较高的测序深度，检测灵敏度和准确性大大提高，因此能够利用这些测序装置的高通量、深度测序的特点，进一步提高对核酸样本进行检测分析的效率。从而能够提高后续对测序数据进行分析时的精确性和准确度。由此，确定核酸样本的核酸序列可以进一步包括：首先，针对所得到的核酸样本，构建核酸测序文库；以及所得到的核酸序列文库进行测序，以便获得多个测序数据构成的数据结果。根据本发明的一些实施例，可以采用选自HISEQ2000、SOLID、454、ABI3730和单分子测序测序装置中的至少一种对所得到的核酸序列进行测序。

需要说明的是，在这里所使用的术语“核酸序列”应作广义理解，其可以是在对核酸样本进行测序得到的测序数据进行组装后，得到的完整的核酸序列信息，也可以是直接采用通过对核酸样本进行测序所得到的测序数据(reads)作为核酸序列，只要这些核酸序列中含有对应LDLR的编码序列即可。

最后，在确定核酸样本的核酸序列之后，将所得到的核酸样本的核酸序列与SEQ ID NO：1的序列相比对。如果在所得到的核酸序列中具有c.C2164T突变，则指示生物样品易患高胆固醇血症。由此，通过根据本发明实施例的筛选易患高胆固醇血症的生物样品的方法，可以有效地筛选易患高胆固醇血症的生物样品。对核酸序列与SEQ ID NO：1进行比对的方法和设备并不受特别限制，可以采用任意常规的软件进行操作。

需要说明的是，根据本发明实施例的“筛选易患高胆固醇血症的生物样品的方法”的用途不受特别限制，例如可以用作非诊断目的的筛选方法。根据本发明的第四个方面，本发明提供了一种用于筛选易感高胆固醇血症的生物样品的试剂盒，含有适于检测LDLR基因突变体的试剂，其中所述LDLR基因突变体为上述LDLR基因突变，所述试剂为核酸探针或引物，所述引物的核苷酸序列SEQ ID NO:3-4所示。

利用根据本发明的实施例的试剂盒，能够有效地筛选易感高胆固醇血症的生物样品。在本文中，所使用的术语“适于检测LDLR基因突变体的试剂”应做广义理解，既可以是检测LDLR编码基因的试剂，也可以是检测LDLR突变体多肽的试剂，例如可以采用识别特异性位点的抗体，也可以为为核酸探针，由此，可以高效地筛选易感高胆固醇血症的生物样品。

根据本发明的第五方面，提供了一种非疾病诊断和治疗目的的筛选易感高胆固醇血症的生物样品的系统，包括：

核酸提取装置，所述核酸提取装置用于从所述生物样品提取核酸样本；

核酸序列确定装置，所述核酸序列确定装置与素数核酸提取装置相连，用于对所述核酸样本进行分析，以确定所述核酸样本的核酸序列；

判断装置，所述判断装置与所述核酸序列确定装置相连，以确定基于所述核酸样本的核酸序列与SEQ ID NO:1相比，是否具有c.C2164T、c.G2146T、c.G2167T、c.A2188T、c.C2215T、c.C2230T以及c.G2287T突变，若具有以上至少一种突变，即判断所述生物样品为易感高胆固醇血症的生物样品。

优选地，所述核酸提取装置进一步包括：

RNA提取单位，所述RNA提取单元用于从所述生物样品提取RNA样本；

反转录单元，所述反转录单元与所述RNA提取单位相连，用于对所述RNA样本进行反转录反应，以便获得cDNA样本，所述cDNA样本构成所述核酸样本。

优选地，所述核酸序列确定装置进一步包括：

文库构建单元，所述文库构建单元用于针对所述核酸样本，构建核酸测序文库；

测序单元，所述测序单元与所述文库构建单元相连，用于对所述核酸序列文库进行测序，以便获得由多个测序数据构成的测序结果。

优选地，所述文库构建单元进一步包括：

PCR扩增模块，所述PCR扩增模块中设置有LDLR基因外显子特异性引物，以便利用所述引物，对所述核酸样本进行PCR扩增。

优选地，所述特异性引物具有如SEQ ID NO:3-4所示。

优选地，所述测序单元为HISEQ2000、SOLID、454、ABI3730或单分子测序装置。

根据本发明的第六方面，提供了一种构建体，包含以上分离的编码LDLR突变体的核酸；提供了一种重组细胞，所述重组细胞是通过以上构建体转化受体细胞获得的；提供了一种用于制备预防或治疗高胆固醇血症的药物的重组蛋白，所述重组蛋白由以上重组细胞表达。

实施例1：确定高胆固醇血症致病基因，包含以下步骤：

1、样本收集

发明人在福建收集到1个高胆固醇血症的家系，如图1所示，根据患者口述，该家系成员共3人，其中患者1人(先证者)，正常人员2人。□表示正常男性，○表示正常女性，●表示患病女性，表示先证者。参与本发明研究的共2人(先证者及其母亲)，所有参与本发明研究的家系成员均签署了知情同意书。发明人采集获得上述高胆固醇血症患者家系中患者及家系内正常人的外周血样本。

2、全外显子测序

发明人用proteon测序平台，对高胆固醇血症家系中的先证者患者及其母亲进行全外显子组测序。

3、变异检测、注释及数据库比较

对测序公司提供的变异检测、注释结果，对非同义突变、编码区插入和缺失这两类最有可能与病理相关的突变进行研究。结果在这些样本中发现，患者中有51915个变异位点，患者母亲有53006个变异位点。根据家系中疾病的常染色体隐性的遗传方式以及公共数据库dbSNP数据库、HapMap数据库、千人基因组数据库的过滤，去掉所有已知的且在数据库中等位基因频率大于0.01的变异。

由此，发明人发现先证者在LDLR基因15号外显子上存在一个图2所示的纯合终止突变c.C2164T。进一步，通过对高胆固醇血症患者家系进行疾病共分离，如图3所示，患者母亲(正常人)在2164位点为杂合子，发明人发现，LDLR基因15号外显子的该突变可能是该遗传性高胆固醇血症的致病位点。

4、Sanger法测序验证

分别对实施例1中所述分遗传性高胆固醇血症患者家系中的患者和患者母亲(正常人)的LDLR基因进行测序。根据确定序列测定结果数据突变型还是野生型，验证LDLR基因的c.C2164T突变与遗传性高胆固醇血症之间的相关性。

基于测序结果，高胆固醇血症患者家系中，患者LDLR基因15号外显子c.C2164T突变，而患者母亲未携带该突变。由此证明，LDLR基因15号外显子的c.C2164T突变是遗传性高胆固醇血症的致病突变。

5、基因突变体功能

基于上述结果，将能够表达LDLR基因突变体的生物样品，尾静脉注射进入LDLR-/-小鼠体内，10天后，取小鼠的血样进行检测。与对照组相比，注射能够表达LDLR基因突变体的生物样品的小鼠血液中，低密度脂蛋白胆固醇浓度降低。由此证明，具有c.C2164T突变的LDLR突变体，能够部分降低血液中低密度脂蛋白胆固醇的浓度，对高胆固醇血症的治疗起到一定的作用。

实施例2：预防或治疗高胆固醇血症的药物的重组蛋白的制备及应用

预防或治疗高胆固醇血症的药物的重组蛋白的方法，包括以下步骤：

(1)构建含有分离的编码LDLR突变体核酸，即c.C2164T、c.G2146T、c.G2167T、c.A2188T、c.C2215T、c.C2230T以及c.G2287T至少一个突变的核酸的重组腺病毒。

(2)重组腺病毒酶切后获得两末端是ITR序列的线性双链DNA，将所述线性双链DNA转染到包装细胞293A细胞中。

(3)病毒颗粒在细胞内成熟后，会使得细胞破裂，从而使病毒颗粒释放到培养液中。收集细胞和培养液，然后反复冻融细胞和培养液的混合物。离心收集上清，获得粗病毒。

(4)将粗病毒感染更多的293A细胞，以扩增病毒量。病毒扩增后，只收集细胞。再反复冻融细胞，离心收集上清，即可获得转导细胞级别的病毒颗粒。

(5)利用CsCl₂超速离心进一步去除杂质，从而获得纯度更高的注射动物级别的病毒颗粒。

利用本发明的重组蛋白通过尾静脉注射的方法进入LDLR-/-小鼠，可有效降低小鼠的血浆胆固醇，能够有效地用于筛选治疗高胆固醇血症的药物。

首先，将能够表达LDLR基因突变体的生物样品进行培养，其中LDLR基因突变体与SEQ ID NO:1相比，具有c.C2164T突变。这里所使用的术语“培养”应做广义理解，是指生物样品以有活性的状态存在。根据本发明的实施例，生物样品的类型不受特别的限制，只要该生物样品能够表达这一种LDLR突变体即可，该突变体与SEQ ID NO:1相比，具有c.C2164T突变。

其次，将上述重组蛋白尾静脉注射进入LDLR-/-小鼠体内，10天后，取小鼠的血样全自动生化分析仪进行检测。与对照组相比，注射能够表达LDLR基因突变体的生物样品的小鼠血液中，如图4所示低密度脂蛋白胆固醇浓度降低27.4％。

利用本发明的筛选治疗或预防高胆固醇血症的药物的方法，能够有效地筛选治疗或预防高胆固醇血症的药物。

本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>华中科技大学

<120>LDLR基因突变体及其应用

<160>6

<170>SIPOSequenceListing 1.0

<210>1

<211>2583

<212>DNA

<213>人(human)

<400>1

atggggccct ggggctggaa attgcgctgg accgtcgcct tgctcctcgc cgcggcgggg60

actgcagtgg gcgacagatg cgaaagaaac gagttccagt gccaagacgg gaaatgcatc 120

tcctacaagt gggtctgcga tggcagcgct gagtgccagg atggctctga tgagtcccag 180

gagacgtgct tgtctgtcac ctgcaaatcc ggggacttca gctgtggggg ccgtgtcaac 240

cgctgcattc ctcagttctg gaggtgcgat ggccaagtgg actgcgacaa cggctcagac 300

gagcaaggct gtccccccaa gacgtgctcc caggacgagt ttcgctgcca cgatgggaag 360

tgcatctctc ggcagttcgt ctgtgactca gaccgggact gcttggacgg ctcagacgag 420

gcctcctgcc cggtgctcac ctgtggtccc gccagcttcc agtgcaacag ctccacctgc 480

atcccccagc tgtgggcctg cgacaacgac cccgactgcg aagatggctc ggatgagtgg 540

ccgcagcgct gtaggggtct ttacgtgttc caaggggaca gtagcccctg ctcggccttc 600

gagttccact gcctaagtgg cgagtgcatc cactccagct ggcgctgtga tggtggcccc 660

gactgcaagg acaaatctga cgaggaaaac tgcgctgtgg ccacctgtcg ccctgacgaa 720

ttccagtgct ctgatggaaa ctgcatccat ggcagccggc agtgtgaccg ggaatatgac 780

tgcaaggaca tgagcgatga agttggctgc gttaatgtga cactctgcga gggacccaac 840

aagttcaagt gtcacagcgg cgaatgcatc accctggaca aagtctgcaa catggctaga 900

gactgccggg actggtcaga tgaacccatc aaagagtgcg ggaccaacga atgcttggac 960

aacaacggcg gctgttccca cgtctgcaat gaccttaaga tcggctacga gtgcctgtgc1020

cccgacggct tccagctggt ggcccagcga agatgcgaag atatcgatga gtgtcaggat1080

cccgacacct gcagccagct ctgcgtgaac ctggagggtg gctacaagtg ccagtgtgag1140

gaaggcttcc agctggaccc ccacacgaag gcctgcaagg ctgtgggctc catcgcctac1200

ctcttcttca ccaaccggca cgaggtcagg aagatgacgc tggaccggag cgagtacacc1260

agcctcatcc ccaacctgag gaacgtggtc gctctggaca cggaggtggc cagcaataga1320

atctactggt ctgacctgtc ccagagaatg atctgcagca cccagcttga cagagcccac1380

ggcgtctctt cctatgacac cgtcatcagc agagacatcc aggcccccga cgggctggct1440

gtggactgga tccacagcaa catctactgg accgactctg tcctgggcac tgtctctgtt1500

gcggatacca agggcgtgaa gaggaaaacg ttattcaggg agaacggctc caagccaagg1560

gccatcgtgg tggatcctgt tcatggcttc atgtactgga ctgactgggg aactcccgcc1620

aagatcaaga aagggggcct gaatggtgtg gacatctact cgctggtgac tgaaaacatt1680

cagtggccca atggcatcac cctagatctc ctcagtggcc gcctctactg ggttgactcc1740

aaacttcact ccatctcaag catcgatgtc aacgggggca accggaagac catcttggag1800

gatgaaaaga ggctggccca ccccttctcc ttggccgtct ttgaggacaa agtattttgg1860

acagatatca tcaacgaagc cattttcagt gccaaccgcc tcacaggttc cgatgtcaac1920

ttgttggctg aaaacctact gtccccagag gatatggttc tcttccacaa cctcacccag1980

ccaagaggag tgaactggtg tgagaggacc accctgagca atggcggctg ccagtatctg2040

tgcctccctg ccccgcagat caacccccac tcgcccaagt ttacctgcgc ctgcccggac2100

ggcatgctgc tggccaggga catgaggagc tgcctcacag aggctgaggc tgcagtggcc2160

acccaggaga catccaccgt caggctaaag gtcagctcca cagccgtaag gacacagcac2220

acaaccaccc gacctgttcc cgacacctcc cggctgcctg gggccacccc tgggctcacc2280

acggtggaga tagtgacaat gtctcaccaa gctctgggcg acgttgctgg cagaggaaat2340

gagaagaagc ccagtagcgt gagggctctg tccattgtcc tccccatcgt gctcctcgtc2400

ttcctttgcc tgggggtctt ccttctatgg aagaactggc ggcttaagaa catcaacagc2460

atcaactttg acaaccccgt ctatcagaag accacagagg atgaggtcca catttgccac2520

aaccaggacg gctacagcta cccctcgaga cagatggtca gtctggagga tgacgtggcg2580

tga2583

<210>2

<211>860

<212>PRT

<213>人(human)

<400>2

Met Gly Pro Trp Gly Trp Lys Leu Arg Trp Thr Val Ala Leu Leu Leu

1 5 1015

Ala Ala Ala Gly Thr Ala Val Gly Asp Arg Cys Glu Arg Asn Glu Phe

202530

Gln Cys Gln Asp Gly Lys Cys Ile Ser Tyr Lys Trp Val Cys Asp Gly

354045

Ser Ala Glu Cys Gln Asp Gly Ser Asp Glu Ser Gln Glu Thr Cys Leu

505560

Ser Val Thr Cys Lys Ser Gly Asp Phe Ser Cys Gly Gly Arg Val Asn

65707580

Arg Cys Ile Pro Gln Phe Trp Arg Cys Asp Gly Gln Val Asp Cys Asp

859095

Asn Gly Ser Asp Glu Gln Gly Cys Pro Pro Lys Thr Cys Ser Gln Asp

100 105 110

Glu Phe Arg Cys His Asp Gly Lys Cys Ile Ser Arg Gln Phe Val Cys

115 120 125

Asp Ser Asp Arg Asp Cys Leu Asp Gly Ser Asp Glu Ala Ser Cys Pro

130 135 140

Val Leu Thr Cys Gly Pro Ala Ser Phe Gln Cys Asn Ser Ser Thr Cys

145 150 155 160

Ile Pro Gln Leu Trp Ala Cys Asp Asn Asp Pro Asp Cys Glu Asp Gly

165 170 175

Ser Asp Glu Trp Pro Gln Arg Cys Arg Gly Leu Tyr Val Phe Gln Gly

180 185 190

Asp Ser Ser Pro Cys Ser Ala Phe Glu Phe His Cys Leu Ser Gly Glu

195 200 205

Cys Ile His Ser Ser Trp Arg Cys Asp Gly Gly Pro Asp Cys Lys Asp

210 215 220

Lys Ser Asp Glu Glu Asn Cys Ala Val Ala Thr Cys Arg Pro Asp Glu

225 230 235 240

Phe Gln Cys Ser Asp Gly Asn Cys Ile His Gly Ser Arg Gln Cys Asp

245 250 255

Arg Glu Tyr Asp Cys Lys Asp Met Ser Asp Glu Val Gly Cys Val Asn

260 265 270

Val Thr Leu Cys Glu Gly Pro Asn Lys Phe Lys Cys His Ser Gly Glu

275 280 285

Cys Ile Thr Leu Asp Lys Val Cys Asn Met Ala Arg Asp Cys Arg Asp

290 295 300

Trp Ser Asp Glu Pro Ile Lys Glu Cys Gly Thr Asn Glu Cys Leu Asp

305 310 315 320

Asn Asn Gly Gly Cys Ser His Val Cys Asn Asp Leu Lys Ile Gly Tyr

325 330 335

Glu Cys Leu Cys Pro Asp Gly Phe Gln Leu Val Ala Gln Arg Arg Cys

340 345 350

Glu Asp Ile Asp Glu Cys Gln Asp Pro Asp Thr Cys Ser Gln Leu Cys

355 360 365

Val Asn Leu Glu Gly Gly Tyr Lys Cys Gln Cys Glu Glu Gly Phe Gln

370 375 380

Leu Asp Pro His Thr Lys Ala Cys Lys Ala Val Gly Ser Ile Ala Tyr

385 390 395 400

Leu Phe Phe Thr Asn Arg His Glu Val Arg Lys Met Thr Leu Asp Arg

405 410 415

Ser Glu Tyr Thr Ser Leu Ile Pro Asn Leu Arg Asn Val Val Ala Leu

420 425 430

Asp Thr Glu Val Ala Ser Asn Arg Ile Tyr Trp Ser Asp Leu Ser Gln

435 440 445

Arg Met Ile Cys Ser Thr Gln Leu Asp Arg Ala His Gly Val Ser Ser

450 455 460

Tyr Asp Thr Val Ile Ser Arg Asp Ile Gln Ala Pro Asp Gly Leu Ala

465 470 475 480

Val Asp Trp Ile His Ser Asn Ile Tyr Trp Thr Asp Ser Val Leu Gly

485 490 495

Thr Val Ser Val Ala Asp Thr Lys Gly Val Lys Arg Lys Thr Leu Phe

500 505 510

Arg Glu Asn Gly Ser Lys Pro Arg Ala Ile Val Val Asp Pro Val His

515 520 525

Gly Phe Met Tyr Trp Thr Asp Trp Gly Thr Pro Ala Lys Ile Lys Lys

530 535 540

Gly Gly Leu Asn Gly Val Asp Ile Tyr Ser Leu Val Thr Glu Asn Ile

545 550 555 560

Gln Trp Pro Asn Gly Ile Thr Leu Asp Leu Leu Ser Gly Arg Leu Tyr

565 570 575

Trp Val Asp Ser Lys Leu His Ser Ile Ser Ser Ile Asp Val Asn Gly

580 585 590

Gly Asn Arg Lys Thr Ile Leu Glu Asp Glu Lys Arg Leu Ala His Pro

595 600 605

Phe Ser Leu Ala Val Phe Glu Asp Lys Val Phe Trp Thr Asp Ile Ile

610 615 620

Asn Glu Ala Ile Phe Ser Ala Asn Arg Leu Thr Gly Ser Asp Val Asn

625 630 635 640

Leu Leu Ala Glu Asn Leu Leu Ser Pro Glu Asp Met Val Leu Phe His

645 650 655

Asn Leu Thr Gln Pro Arg Gly Val Asn Trp Cys Glu Arg Thr Thr Leu

660 665 670

Ser Asn Gly Gly Cys Gln Tyr Leu Cys Leu Pro Ala Pro Gln Ile Asn

675 680 685

Pro His Ser Pro Lys Phe Thr Cys Ala Cys Pro Asp Gly Met Leu Leu

690 695 700

Ala Arg Asp Met Arg Ser Cys Leu Thr Glu Ala Glu Ala Ala Val Ala

705 710 715 720

Thr Gln Glu Thr Ser Thr Val Arg Leu Lys Val Ser Ser Thr Ala Val

725 730 735

Arg Thr Gln His Thr Thr Thr Arg Pro Val Pro Asp Thr Ser Arg Leu

740 745 750

Pro Gly Ala Thr Pro Gly Leu Thr Thr Val Glu Ile Val Thr Met Ser

755 760 765

His Gln Ala Leu Gly Asp Val Ala Gly Arg Gly Asn Glu Lys Lys Pro

770 775 780

Ser Ser Val Arg Ala Leu Ser Ile Val Leu Pro Ile Val Leu Leu Val

785 790 795 800

Phe Leu Cys Leu Gly Val Phe Leu Leu Trp Lys Asn Trp Arg Leu Lys

805 810 815

Asn Ile Asn Ser Ile Asn Phe Asp Asn Pro Val Tyr Gln Lys Thr Thr

820 825 830

Glu Asp Glu Val His Ile Cys His Asn Gln Asp Gly Tyr Ser Tyr Pro

835 840 845

Ser Arg Gln Met Val Ser Leu Glu Asp Asp Val Ala

850 855 860

<210>3

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列(manual work)

<400>3

ggccgcctct actgggttga c21

<210>4

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列(manual work)

<400>4

cacgctactg ggcttcttct cattt25

<210>5

<211>2583

<212>DNA

<213>人(human)

<400>5

atggggccct ggggctggaa attgcgctgg accgtcgcct tgctcctcgc cgcggcgggg60

actgcagtgg gcgacagatg cgaaagaaac gagttccagt gccaagacgg gaaatgcatc 120

tcctacaagt gggtctgcga tggcagcgct gagtgccagg atggctctga tgagtcccag 180

gagacgtgct tgtctgtcac ctgcaaatcc ggggacttca gctgtggggg ccgtgtcaac 240

cgctgcattc ctcagttctg gaggtgcgat ggccaagtgg actgcgacaa cggctcagac 300

gagcaaggct gtccccccaa gacgtgctcc caggacgagt ttcgctgcca cgatgggaag 360

tgcatctctc ggcagttcgt ctgtgactca gaccgggact gcttggacgg ctcagacgag 420

gcctcctgcc cggtgctcac ctgtggtccc gccagcttcc agtgcaacag ctccacctgc 480

atcccccagc tgtgggcctg cgacaacgac cccgactgcg aagatggctc ggatgagtgg 540

ccgcagcgct gtaggggtct ttacgtgttc caaggggaca gtagcccctg ctcggccttc 600

gagttccact gcctaagtgg cgagtgcatc cactccagct ggcgctgtga tggtggcccc 660

gactgcaagg acaaatctga cgaggaaaac tgcgctgtgg ccacctgtcg ccctgacgaa 720

ttccagtgct ctgatggaaa ctgcatccat ggcagccggc agtgtgaccg ggaatatgac 780

tgcaaggaca tgagcgatga agttggctgc gttaatgtga cactctgcga gggacccaac 840

aagttcaagt gtcacagcgg cgaatgcatc accctggaca aagtctgcaa catggctaga 900

gactgccggg actggtcaga tgaacccatc aaagagtgcg ggaccaacga atgcttggac 960

aacaacggcg gctgttccca cgtctgcaat gaccttaaga tcggctacga gtgcctgtgc1020

cccgacggct tccagctggt ggcccagcga agatgcgaag atatcgatga gtgtcaggat1080

cccgacacct gcagccagct ctgcgtgaac ctggagggtg gctacaagtg ccagtgtgag1140

gaaggcttcc agctggaccc ccacacgaag gcctgcaagg ctgtgggctc catcgcctac1200

ctcttcttca ccaaccggca cgaggtcagg aagatgacgc tggaccggag cgagtacacc1260

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aagatcaaga aagggggcct gaatggtgtg gacatctact cgctggtgac tgaaaacatt1680

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aaacttcact ccatctcaag catcgatgtc aacgggggca accggaagac catcttggag1800

gatgaaaaga ggctggccca ccccttctcc ttggccgtct ttgaggacaa agtattttgg1860

acagatatca tcaacgaagc cattttcagt gccaaccgcc tcacaggttc cgatgtcaac1920

ttgttggctg aaaacctact gtccccagag gatatggttc tcttccacaa cctcacccag1980

ccaagaggag tgaactggtg tgagaggacc accctgagca atggcggctg ccagtatctg2040

tgcctccctg ccccgcagat caacccccac tcgcccaagt ttacctgcgc ctgcccggac2100

ggcatgctgc tggccaggga catgaggagc tgcctcacag aggctgaggc tgcagtggcc2160

acctaggaga catccaccgt caggctaaag gtcagctcca cagccgtaag gacacagcac2220

acaaccaccc gacctgttcc cgacacctcc cggctgcctg gggccacccc tgggctcacc2280

acggtggaga tagtgacaat gtctcaccaa gctctgggcg acgttgctgg cagaggaaat2340

gagaagaagc ccagtagcgt gagggctctg tccattgtcc tccccatcgt gctcctcgtc2400

ttcctttgcc tgggggtctt ccttctatgg aagaactggc ggcttaagaa catcaacagc2460

atcaactttg acaaccccgt ctatcagaag accacagagg atgaggtcca catttgccac2520

aaccaggacg gctacagcta cccctcgaga cagatggtca gtctggagga tgacgtggcg2580

tga2583

<210>6

<211>722

<212>PRT

<213>人(human)

<400>6

Met Gly Pro Trp Gly Trp Lys Leu Arg Trp Thr Val Ala Leu Leu Leu

1 5 1015

Ala Ala Ala Gly Thr Ala Val Gly Asp Arg Cys Glu Arg Asn Glu Phe

202530

Gln Cys Gln Asp Gly Lys Cys Ile Ser Tyr Lys Trp Val Cys Asp Gly

354045

Ser Ala Glu Cys Gln Asp Gly Ser Asp Glu Ser Gln Glu Thr Cys Leu

505560

Ser Val Thr Cys Lys Ser Gly Asp Phe Ser Cys Gly Gly Arg Val Asn

65707580

Arg Cys Ile Pro Gln Phe Trp Arg Cys Asp Gly Gln Val Asp Cys Asp

859095

Asn Gly Ser Asp Glu Gln Gly Cys Pro Pro Lys Thr Cys Ser Gln Asp

100 105 110

Glu Phe Arg Cys His Asp Gly Lys Cys Ile Ser Arg Gln Phe Val Cys

115 120 125

Asp Ser Asp Arg Asp Cys Leu Asp Gly Ser Asp Glu Ala Ser Cys Pro

130 135 140

Val Leu Thr Cys Gly Pro Ala Ser Phe Gln Cys Asn Ser Ser Thr Cys

145 150 155 160

Ile Pro Gln Leu Trp Ala Cys Asp Asn Asp Pro Asp Cys Glu Asp Gly

165 170 175

Ser Asp Glu Trp Pro Gln Arg Cys Arg Gly Leu Tyr Val Phe Gln Gly

180 185 190

Asp Ser Ser Pro Cys Ser Ala Phe Glu Phe His Cys Leu Ser Gly Glu

195 200 205

Cys Ile His Ser Ser Trp Arg Cys Asp Gly Gly Pro Asp Cys Lys Asp

210 215 220

Lys Ser Asp Glu Glu Asn Cys Ala Val Ala Thr Cys Arg Pro Asp Glu

225 230 235 240

Phe Gln Cys Ser Asp Gly Asn Cys Ile His Gly Ser Arg Gln Cys Asp

245 250 255

Arg Glu Tyr Asp Cys Lys Asp Met Ser Asp Glu Val Gly Cys Val Asn

260 265 270

Val Thr Leu Cys Glu Gly Pro Asn Lys Phe Lys Cys His Ser Gly Glu

275 280 285

Cys Ile Thr Leu Asp Lys Val Cys Asn Met Ala Arg Asp Cys Arg Asp

290 295 300

Trp Ser Asp Glu Pro Ile Lys Glu Cys Gly Thr Asn Glu Cys Leu Asp

305 310 315 320

Asn Asn Gly Gly Cys Ser His Val Cys Asn Asp Leu Lys Ile Gly Tyr

325 330 335

Glu Cys Leu Cys Pro Asp Gly Phe Gln Leu Val Ala Gln Arg Arg Cys

340 345 350

Glu Asp Ile Asp Glu Cys Gln Asp Pro Asp Thr Cys Ser Gln Leu Cys

355 360 365

Val Asn Leu Glu Gly Gly Tyr Lys Cys Gln Cys Glu Glu Gly Phe Gln

370 375 380

Leu Asp Pro His Thr Lys Ala Cys Lys Ala Val Gly Ser Ile Ala Tyr

385 390 395 400

Leu Phe Phe Thr Asn Arg His Glu Val Arg Lys Met Thr Leu Asp Arg

405 410 415

Ser Glu Tyr Thr Ser Leu Ile Pro Asn Leu Arg Asn Val Val Ala Leu

420 425 430

Asp Thr Glu Val Ala Ser Asn Arg Ile Tyr Trp Ser Asp Leu Ser Gln

435 440 445

Arg Met Ile Cys Ser Thr Gln Leu Asp Arg Ala His Gly Val Ser Ser

450 455 460

Tyr Asp Thr Val Ile Ser Arg Asp Ile Gln Ala Pro Asp Gly Leu Ala

465 470 475 480

Val Asp Trp Ile His Ser Asn Ile Tyr Trp Thr Asp Ser Val Leu Gly

485 490 495

Thr Val Ser Val Ala Asp Thr Lys Gly Val Lys Arg Lys Thr Leu Phe

500 505 510

Arg Glu Asn Gly Ser Lys Pro Arg Ala Ile Val Val Asp Pro Val His

515 520 525

Gly Phe Met Tyr Trp Thr Asp Trp Gly Thr Pro Ala Lys Ile Lys Lys

530 535 540

Gly Gly Leu Asn Gly Val Asp Ile Tyr Ser Leu Val Thr Glu Asn Ile

545 550 555 560

Gln Trp Pro Asn Gly Ile Thr Leu Asp Leu Leu Ser Gly Arg Leu Tyr

565 570 575

Trp Val Asp Ser Lys Leu His Ser Ile Ser Ser Ile Asp Val Asn Gly

580 585 590

Gly Asn Arg Lys Thr Ile Leu Glu Asp Glu Lys Arg Leu Ala His Pro

595 600 605

Phe Ser Leu Ala Val Phe Glu Asp Lys Val Phe Trp Thr Asp Ile Ile

610 615 620

Asn Glu Ala Ile Phe Ser Ala Asn Arg Leu Thr Gly Ser Asp Val Asn

625 630 635 640

Leu Leu Ala Glu Asn Leu Leu Ser Pro Glu Asp Met Val Leu Phe His

645 650 655

Asn Leu Thr Gln Pro Arg Gly Val Asn Trp Cys Glu Arg Thr Thr Leu

660 665 670

Ser Asn Gly Gly Cys Gln Tyr Leu Cys Leu Pro Ala Pro Gln Ile Asn

675 680 685

Pro His Ser Pro Lys Phe Thr Cys Ala Cys Pro Asp Gly Met Leu Leu

690 695 700

Ala Arg Asp Met Arg Ser Cys Leu Thr Glu Ala Glu Ala Ala Val Ala

705 710 715 720

Thr Xaa