一种盐酸克仑特罗分子印迹膜电化学发光传感器的制备方法

摘要

本发明提供了一种盐酸克仑特罗分子印迹膜电化学发光传感器的制备方法，其特征在于，在玻碳电极表面包裹复合薄膜，所述复合薄膜由还原氧化石墨烯、上转换纳米粒子和分子印迹聚合物组成。本发明优点是将具有稳定的阴极信号、高的发光强度的上转换纳米粒子的电化学发光与具有良好选择性的分子印迹聚合物结合起来，用于动物源性食品中盐酸克仑特罗的痕量检测。

说明书

技术领域

本发明属于光电化学传感材料制备技术领域，具体涉及一种基于上转换纳米粒子的盐酸克仑特罗分子印迹膜电化学发光传感器的制备方法。

背景技术

上转换纳米粒子由于具有较大的Stokes位移，稳定的荧光信号，低毒性，良好的生物相容性等优点，在光学传感器领域应用广泛。但在电化学发光领域鲜有报道。上转换纳米材料作为一种新型的电化学发光材料具有稳定的阴极信号，高的电化学发光强度，在电化学发光领域具有广阔的应用前景。分子印迹聚合物具有高的选择性和亲和力，制备简单，成本低，能够特异性识别待测物质，可以作为识别原件引入到电化学发光传感器中，实现对目标物的特异性检测。

盐酸克仑特罗属于肾上腺素类神经兴奋剂，被广泛用于提高动物体的瘦肉率，其易在眼睛，肝脏，肾脏，肌肉等部位残留，人食用添加盐酸克仑特罗的食物后易发生中毒。包括中国在内的许多国家已经禁止将盐酸克仑特罗用作动物生长促进剂添加到动物饲料中。目前用于检测动物源性食品中盐酸克仑特罗的常用方法是色谱法，但色谱法依赖于昂贵的仪器，样品处理过程费时，测试过程复杂。而分子印迹传感材料制备简单，成本低，抗恶劣环境能力强，检测快速，具有很大的发展潜力。

目前将电化学发光与分子印迹聚合物结合用于盐酸克仑特罗检测的研究尚未见报道。

发明内容

本发明利用了上转换纳米粒子的阴极电化学发光，分子印迹材料对目标物的特异性吸附，以及目标物对电化学发光的猝灭作用，制备了一种吸附痕量盐酸克仑特罗分子印迹电化学发光传感材料并提供了一种用于实际样品中盐酸克仑特罗的检测方法。

原理如下：(1)在玻碳电极表面电沉积氧化石墨烯，得到还原氧化石墨烯薄膜，其作为信号放大剂用于增强上转换纳米材料的电化学发光信号；然后再将上转换纳米材料滴涂到电极表面，其中上转换纳米材料用作电化学发光材料产生光信号；(2)通过在含邻苯二胺和盐酸克仑特罗的醋酸缓冲液中进行循环伏安扫描，电聚合分子印迹膜，然后洗脱得到能特异性识别模板分子的分子印迹孔穴；(3)在吸附时，盐酸克仑特罗进入到印迹膜上具有特异性识别的分子印迹孔穴中，对电化学发光强度产生一定猝灭，通过测量电化学发光信号随不同浓度的盐酸克仑特罗的变化情况，可以实现对盐酸克仑特罗的定量检测。

这种分子印迹电化学发光材料的制备方法和具体步骤如下：

一种盐酸克仑特罗分子印迹膜电化学发光传感器的制备方法，在玻碳电极表面包裹复合薄膜，所述复合薄膜由还原氧化石墨烯、上转换纳米粒子和分子印迹聚合物组成。

具体制备方法包括如下步骤：

(1)电极预处理

(2)电沉积氧化石墨烯

将步骤(1)中处理好的玻碳电极浸于3mL氧化石墨烯分散液中，在0.6～-1.4V范围内电沉积5圈，得到还原氧化石墨烯修饰的电极；

(3)滴涂上转换纳米粒子

在步骤(2)中得到的还原氧化石墨烯修饰的电极表面滴涂10μL的0.5mg/mL的上转换纳米粒子，在空气中自然晾干；

(4)电聚合分子印迹膜

将步骤(3)中得到的修饰电极在电聚合溶液中进行循环伏安扫描，电聚合形成分子印迹膜；

(5)模板分子的洗脱

将步骤(4)中得到的修饰电极在甲醇：乙酸＝2：1(v/v)溶液中震荡洗脱20min，除去模板分子。

进一步，所述步骤(1)电极预处理是玻碳电极表面依次使用1.0，0.3，0.05μm的氧化铝粉末进行抛光，用双蒸水完全冲洗后，在含有0.2mol/L KNO₃的1mmol/L>3[Fe(CN)₆]溶液中采用循环伏安法在0.6～-0.2V范围内扫描，直至获得稳定的电化学响应，然后在空气中干燥，备用。

进一步，步骤(2)中，在玻碳电极表面电沉积氧化石墨烯时，先将2mg/mL的氧化石墨烯分散液用双蒸水稀释成0.5mg/mL，0.5mg/mL的电沉积溶液在使用之前氮吹5min除去溶解氧，在0.6～-1.4V范围内电沉积5圈，扫描速度50mV/s。

进一步，步骤(3)中，将2mg/mL的上转换纳米材料用双蒸水稀释成0.5mg/mL，然后用移液枪取10μL的0.5mg/mL上转换纳米材料滴涂到步骤(2)中的修饰电极表面。

进一步，步骤(4)中，将步骤(3)得到的修饰电极浸于含6mmol/L邻苯二胺和1.2mmol/L盐酸克仑特罗的醋酸缓冲液中，醋酸缓冲液pH 5.2，浓度0.1mol/L，采用循环伏安法在0～+0.8V范围内扫描7圈，扫描速率为50mV/s。

进一步，步骤(5)中在25mL甲醇：乙酸＝2：1(v/v)溶液中震荡洗脱20min以除去模板分子。

进一步，所述氧化石墨烯分散液为羧基化的，浓度为0.5mg/mL。羧基化的好处主要是利用它上面的羧基带负电荷，可以和上转换纳米粒子上的氨基(带正电荷)靠静电作用吸引在一起，使上转换纳米粒子结合更为牢固一点，不易从电极表面脱落，使电化学发光信号更为稳定。

进一步，所述上转换纳米粒子为氨基修饰的，组成为NaYF₄:Yb,Er，粒径为35nm。

目前存在的技术难题：

1.滴涂的上转换纳米粒子有可能易从电极表面脱落；

2.电化学发光信号不稳定；

3.上转换纳米材料的电化学发光信号需要用其他增敏物质来进一步提高信号，使构建的传感器灵敏度更高，从而使检出限更低。

4.模板分子的洗脱问题，模板分子完全洗脱下来较困难。

本发明利用电沉积得到的还原氧化石墨烯上的羧基带负电荷，上转换纳米材料的氨基带正电荷，使两者结合更牢固一点，同时使电化学发光信号更稳定，可以解决1或2的问题，同时还原氧化石墨烯具有大的比表面积，优良的导电性，能增强上转换纳米粒子的发光强度，解决了3的问题。

本发明选择洗脱条件甲醇/乙酸(2：1)，洗脱效果较好。

按照所述的制备方法得到的电化学发光传感器用于食品中盐酸克仑特罗的检测。

本发明检测方法：

在室温即25℃下，将步骤(5)制得的分子印迹修饰电极置于含浓度为10^-8～10^-4mol/L的盐酸克仑特罗的磷酸缓冲液中(pH>

盐酸克仑特罗含量的测定：

随着越来越多的盐酸克仑特罗分子被分子印迹膜上的识别位点所吸附，电化学发光信号逐渐降低；盐酸克仑特罗浓度(10^-8～10^-4mol/L)的对数值lgC_CLB与电化学发光信号的变化值和空白值的比值(F₀-F)/F₀呈良好的线性关系：(F₀-F)/F₀＝0.1367lgC_CLB+1.1311，其线性相关系数r²＝0.9957，该分子印迹电化学发光传感器对盐酸克仑特罗的最低检出限(LOD)为6.3×10^-9mol/L(S/N＝3)。

本发明优点是：

(1)本发明提供的传感器使用寿命长、稳定性好、灵敏度高、线性范围宽、检测限低，能够特异性识别盐酸克仑特罗。

(2)本发明提供的盐酸克仑特罗分子印迹膜电化学发光传感器的制备方法克服了传统方法检测盐酸克仑特罗时存在的样品前处理过程繁琐、仪器昂贵，操作复杂等问题，为实际样品中痕量盐酸克仑特罗的检测提供了一种新颖、快速和准确的分析检测方法。传统的检测盐酸克仑特罗的方法，如高效液相色谱法，前处理过程比较复杂，仪器比较昂贵，分析时间较慢，本研究提供的方法新型、分析时间快速(50s)，前处理过程无需过固相萃取小柱等过程，同时定量准确、线性范围宽、可重复多次使用。

附图说明

图1为本发明创造实施例盐酸克仑特罗含量与电化学发光强度的关系图。

具体实施方式

本发明创造的示意性实施例及其说明用于解释本发明创造，并不构成对本发明创造的不当限定。下面结合附图说明和具体实施例对本发明做进一步详细描述。

本发明使用的上转换纳米材料是购买自南京先锋纳米材料科技有限公司。

实施例1

(1)电极预处理

在制备之前，玻碳电极表面依次使用1.0，0.3，0.05μm的氧化铝粉末进行抛光，用双蒸水完全冲洗后，在含有0.2mol/L KNO₃的1mmol/L>3[Fe(CN)₆]溶液中采用循环伏安法在0.6～-0.2V范围内扫描，直至获得稳定的电化学响应，然后在空气中干燥；

(2)电沉积氧化石墨烯

先将2mg/mL的氧化石墨烯分散液用双蒸水稀释成0.5mg/mL，将步骤(1)处理好的玻碳电极浸于3mL氧化石墨烯分散液(0.5mg/mL)中，在0.6～-1.4V范围内电沉积5圈，扫描速度50mV/s，得到还原氧化石墨烯修饰的电极。电沉积液在使用之前氮吹5min来除去溶解的氧气。

(3)滴涂上转换纳米粒子

将2mg/mL的上转换纳米粒子用双蒸水稀释成0.5mg/mL，然后用移液枪取10μL滴涂到步骤(2)中的修饰电极表面，空气中自然晾干。

(4)电聚合分子印迹膜

将步骤(3)得到的修饰电极浸于含6mmol/L邻苯二胺和1.2mmol/L盐酸克仑特罗的醋酸缓冲液中(pH 5.2，0.1mol/L)，使用循环伏安法在0～+0.8V范围内扫描7圈，扫描速率为50mV/s，电聚合形成分子印迹膜；

(5)模板分子的洗脱

将步骤(4)得到的修饰电极置于25mL甲醇/乙酸(2:1，v/v)溶液中，震荡洗脱20min以除去模板分子。

(6)检测方法

在室温即25℃下，将步骤(5)制得的修饰电极置于含浓度为10^-8～10^-4mol/L的盐酸克仑特罗的磷酸缓冲液中(pH>

(7)盐酸克仑特罗含量的测定：

随着越来越多的盐酸克仑特罗分子被分子印迹膜上的识别位点所吸附，电化学发光信号逐渐降低；盐酸克仑特罗浓度(10^-8～10^-4mol/L)的对数值lgC_CLB与电化学发光信号的变化值和空白值的比值(F₀-F)/F₀呈良好的线性关系：(F₀-F)/F₀＝0.1367lgC_CLB+1.1311，其线性相关系数r²＝0.9957，该分子印迹电化学发光传感器对盐酸克仑特罗的最低检出限(LOD)为6.3×10^-9mol/L(S/N＝3)。

实施例2

(1)电极预处理

在制备之前，玻碳电极表面依次使用1.0，0.3，0.05μm的氧化铝粉末进行抛光，用双蒸水完全冲洗后，在含有0.2mol/L KNO₃的1mmol/L>3[Fe(CN)₆]溶液中采用循环伏安法在0.6～-0.2V范围内扫描，直至获得稳定的电化学响应，然后在空气中干燥；

(2)电沉积氧化石墨烯

先将2mg/mL的羧基化的氧化石墨烯分散液用双蒸水稀释成0.5mg/mL，将步骤(1)处理好的玻碳电极浸于3mL氧化石墨烯分散液(0.5mg/mL)中，在0.6～-1.4V范围内电沉积5圈，扫描速度50mV/s，得到还原氧化石墨烯修饰的电极。电沉积液在使用之前氮吹5min来除去溶解的氧气。

(3)滴涂上转换纳米粒子

将2mg/mL的上转换纳米粒子用双蒸水稀释成0.5mg/mL，然后用移液枪取10μL滴涂到步骤(2)中的修饰电极表面，空气中自然晾干。所述上转换纳米粒子为氨基修饰的，组成为NaYF₄:Yb,Er，粒径为35nm。

(4)电聚合分子印迹膜

将步骤(3)得到的修饰电极浸于含6mmol/L邻苯二胺和1.2mmol/L盐酸克仑特罗的醋酸缓冲液中(pH 5.2，0.1mol/L)，使用循环伏安法在0～+0.8V范围内扫描7圈，扫描速率为50mV/s，电聚合形成分子印迹膜；

(5)模板分子的洗脱

将步骤(4)得到的修饰电极置于25mL甲醇/乙酸(2:1，v/v)溶液中，震荡洗脱20min以除去模板分子。

(6)检测方法

在室温即25℃下，将步骤(5)制得的修饰电极置于含浓度为10^-8～10^-4mol/L的盐酸克仑特罗的磷酸缓冲液中(pH>

(7)盐酸克仑特罗含量的测定：

随着越来越多的盐酸克仑特罗分子被分子印迹膜上的识别位点所吸附，电化学发光信号逐渐降低；盐酸克仑特罗浓度(10^-8～10^-4mol/L)的对数值lgC_CLB与电化学发光信号的变化值和空白值的比值(F₀-F)/F₀呈良好的线性关系：(F₀-F)/F₀＝0.1367lgC_CLB+1.1311，其线性相关系数r²＝0.9957，该分子印迹电化学发光传感器对盐酸克仑特罗的最低检出限(LOD)为6.3×10^-9mol/L(S/N＝3)。

实施例3

实际样品中盐酸克仑特罗含量的测定：

利用本发明实施例2的分子印迹电化学发光传感器对实际样品(猪肉，猪肝，猪肾)中的盐酸克仑特罗进行了分析测定，未检出盐酸克仑特罗，采用标准加入法进行加标回收实验。选用LK5100型电化学发光分析系统的电化学发光和循环伏安法同时检测的模式对待测的样品溶液进行扫描测定，扫描电压0～-2.5V，光电倍增管电压800V。读取电化学发光猝灭后的发光强度，经过换算后代入(F₀-F)/F₀＝0.1367lgC_CLB+1.1311，计算出C_CLB。平行测定三次，计算回收率为89.3～100.4％，说明利用本发明的制备方法构建的分子印迹电化学发光传感器具有较高的准确度。

虽然本实验使用的上转换发光材料具有优异的电化学发光性能，但是由于分子印迹聚合物不导电，覆盖在修饰了发光材料的电极表面，会使发光信号急剧下降，虽然模板分子洗脱后，会出现印迹孔穴，为固定在电极表面的电化学发光材料与溶液中的共反应剂K₂S₂O₈提供电子转移的通道，但是除了印迹孔穴外，电极表面其他地方仍被不导电的印迹膜覆盖，导致电化学发光信号相比不聚合分子印迹聚合物时还是很低，因此需要其他增敏物质来进一步提高发光材料的电化学发光信号，来提高灵敏度，通过本实施例可以看出本发明增强了灵敏度和准确度。

以上所述仅为本发明创造的较佳实施例而已，并不用以限制本发明创造，凡在本发明创造的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明创造的保护范围之内。