一种腐皮镰刀菌及其发酵生产右旋糖酐酶的方法

摘要

本发明属于微生物应用技术领域，尤其涉及一种腐皮镰刀菌及其发酵生产右旋糖酐酶的方法。一种腐皮镰刀菌，其特征在于，其分类命名为腐皮镰刀菌Fusarium solani DJ72，保藏编号CGMCC No.14542，保藏日为2017年07月27日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。本发明首次提供了一种高产右旋糖酐酶的新菌株‑腐皮镰刀菌Fusarium solani DJ72，该菌株可用于发酵生产右旋糖酐酶，并且其发酵液酶活力达到124.3U/ml。

说明书

技术领域

本发明属于微生物应用技术领域，尤其涉及一种腐皮镰刀菌及其发酵生产右旋糖酐酶的方法。

背景技术

右旋糖酐酶是一种能够催化断裂右旋糖酐中α-1,6-糖苷键的水解酶，在医药行业、制糖业中都具有重要作用。在医药行业中，右旋糖酐酶能够水解高分子右旋糖酐生产替代血浆的小分子右旋糖酐；在制糖业中，右旋糖酐酶能够降低糖黏度，提高糖回收率。

目前已报道的右旋糖酐酶产生菌有很多，包括真菌、细菌等，其中青霉菌株居多，真菌所产右旋糖酐酶大多稳定性好，酶活力高，具有很高的研究价值。

本发明提供一种生产右旋糖酐的腐皮镰刀菌(Fusarium solani)，腐皮镰刀菌在工业应用上主要有大黄素生产等，尚未有生产右旋糖酐酶的相关报道。

公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

发明内容

本发明第一个目的是提供一种右旋糖酐酶生产菌株DJ72，该菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮政编码：100101)，保藏号为CGMCCNo.14542，保藏时间为：2017年07月27日，分类命名为腐皮镰刀菌Fusarium solani。

该菌株是从糖厂排污口土壤中，经平板培养基初筛、摇瓶复筛，经酶活力检测后得到。

右旋糖酐酶活力的检测采用3，5-二硝基水杨酸(3,5-dinitrosalicylate,DNS)法：在最适pH、最适温度下，经适当稀释后的酶液与1％(w/v)右旋糖酐T70反应10min，加入DNS终止反应。每分钟水解产生1μmol还原糖量所需酶量定义为一个单位酶活力单位。

本发明的第二个目的是提供利用腐皮镰刀菌Fusarium solani DJ72菌株生产右旋糖酐酶的方法，该方法为：发酵腐皮镰刀菌Fusarium solani DJ72菌株，然后收集发酵产物，即得到右旋糖酐酶。

本发明还提供了腐皮镰刀菌Fusarium solani DJ72菌株发酵生产有右旋糖酐酶的方法，包括如下步骤：

(1)菌株的平板筛选培养基培养：接种菌株至平板培养基上，28-37℃下静置培养2-4天；

(2)种子培养：从平板筛选培养基上转接菌株至液体种子培养基中，28-37℃，150-200rpm震荡培养2-3天；

(3)发酵产酶：将步骤2培养所得种子以1-3％的体积比接种到发酵培养基中，28-37℃，震荡培养4-7天后检测发酵液酶活力。

作为优选，所述的平板筛选培养基配方(g/L)：酵母粉10；蛋白胨5；K₂HPO₄>4>

作为优选，所述的液体种子培养基配方(g/L)：酵母粉5；蛋白胨5；K₂HPO₄>41；右旋糖酐T500>4>

作为优选，所述的发酵培养基配方(g/L)：酵母粉10；蛋白胨5；K₂HPO₄>42.5；右旋糖酐T500>4>

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明首次提供了一种高产右旋糖酐酶的新菌株-腐皮镰刀菌Fusariumsolani DJ72。

(2)本发明新菌株-腐皮镰刀菌Fusarium solani DJ72可用于发酵生产右旋糖酐酶，并且其发酵液酶活力达到124.3U/ml。

附图说明

图1为腐皮镰刀菌Fusarium solani DJ72的菌丝形态学观察结果。

保藏信息说明

腐皮镰刀菌Fusarium solani DJ72，其保藏编号为CGMCC No.14542，保藏日期为2017年07月27日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

具体实施方式

以下实施例以便更好的理解本发明，并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂商店购买得到的。下述实施例中的定量实验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

平板筛选培养基配方(g/L)：酵母粉10；蛋白胨5；K₂HPO₄>4>

液体种子培养基配方(g/L)：酵母粉5；蛋白胨5；K₂HPO₄>4>4>

发酵培养基配方(g/L)：酵母粉10；蛋白胨5；K₂HPO₄>4>4>

实施例1：菌株的筛选

(1)平板培养基初筛：准确称取5g制糖厂排污口土样，加入50ml无菌水，置入摇床室温震荡30-60min，震荡速率100rpm。静置30min后取上清进行梯度稀释。将梯度稀释液分别涂布于平板筛选培养基，28-37℃倒置培养2-4天。

(2)从步骤(1)中筛选平板上挑选产生水解圈的菌株，接入发酵培养基进行三角瓶发酵，28-37℃，180rpm震荡培养4-7后检测酶活力。

最终得到一株右旋糖酐酶高产菌株菌株DJ72，该菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号,邮政编码：100101)，保藏号为CGMCC No.14542，保藏时间为：2017年07月27日)。

实施例2：菌株的鉴定

(1)菌株的形态学分析

如图1所示，该菌株的菌落整齐，显白色或淡黄色，呈绒毛状，菌丝有隔，分支。小分生孢子呈纺锤状或卵圆形，大分生孢子呈梭形或月牙形。

(2)菌株的分子鉴定；具体鉴定步骤如下：提取菌株DJ72的总DNA并作为模板，应用通用引物ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’和ITS4：5’–TCCTCCGC TTATTGATATG-3’，PCR扩增得到其ITS，经测序获得一条521bp的核苷酸序列，其序列为SEQ ID NO.1所示。

经同源性比对分析表明：其与腐皮镰刀菌(Fusarium solani)菌株的同源性最高，达100％。

根据形态学及分子鉴定结果，将DJ72鉴定为腐皮镰刀菌(Fusarium solani)。

实施例3：菌株DJ72发酵生产右旋糖酐酶的方法

(1)种子培养：从平板筛选培养基上转接菌株至液体种子培养基中，28℃，150-200rpm震荡培养2-3天；

(2)将步骤1培养所得种子以1-3％的体积比接种到装有35L发酵培养基的50L发酵罐中，28℃，培养6-7天，控制搅拌转速为200-250rpm，发酵液pH控制为5.5。

发酵过程中间隔12-24h流加1L浓度为10g/L右旋糖酐T500作为补料。

发酵结束后，检测右旋糖酐酶最终活力为124.3U/ml。

前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。

序列表

<110> 广西鼎乐生物科技有限公司

<120> 一种腐皮镰刀菌及其发酵生产右旋糖酐酶的方法

<130> HZLT

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 521

<212> DNA

<213> 人工序列(一种腐皮镰刀菌及其发酵生产右旋糖酐酶的方法)

<400> 1

cactcatcac cctgtgacat acctaaaacg ttgcttcggc gggaacagac ggccccgtaa 60

cacgggccgc ccccgccaga ggacccccta actctgtttc tattatgttt cttctgagta 120

aaacaagcaa ataaattaaa actttcaaca acggatctct tggctctggc atcgatgaag 180

aacgcagcga aatgcgataa gtaatgtgaa ttgcagaatt cagtgaatca tcgaatcttt 240

gaacgcacat tgcgcccgcc agtattctgg cgggcatgcc tgttcgagcg tcattacaac 300

cctcaggccc ccgggcctgg cgttggggat cggcgaggcg ccccctgcgg gcacacgccg 360

tcccccaaat acagtggcgg tcccgccgca gcttccattg cgtagtagct aacacctcgc 420

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