一种百部多糖、共混改性壳聚糖膜及在制备防粘连膜材料中的应用

摘要

本发明公开了一种百部多糖、共混改性壳聚糖膜及在制备防粘连膜材料中的应用。所述百部多糖以百部为原料，经水提醇沉、除蛋白后得到粗多糖，再对粗多糖用透析袋透析截留分子量15000‑25000kD的多糖即得。所述多糖共混改性壳聚糖膜以壳聚糖和所述百部多糖为原料，经过涂膜、烘干、碱洗再干燥的过程制备而成。本发明提供的百部多糖的分子量为15000‑25000kD，该分子量的百部多糖与壳聚糖共混改性制备得到改性壳聚糖膜不仅具有良好的生物相容性，而且在体内的降解速度适宜，约4周即可完全降解，可有效抑制术后粘连发生，且具有消炎作用，可用作手术防粘连材料。

说明书

技术领域

本发明属于材料领域，涉及防粘连膜材料，具体涉及一种百部多糖、共混改性壳聚糖膜及在制备防粘连膜材料中的应用。

背景技术

术后粘连是影响手术效果甚至手术成败的关键问题之一。粘连是结缔组织纤维带与相邻的组织或器官结合在一起而形成的异常结构，其程度可以从一片纤细的薄膜到稠密的血管疤痕组织。各种研究表明，粘连的产生是正常组织愈合过程的一部分，而各种防粘连措施的使用是使组织愈合与粘连形成之间达到一种平衡，在减少粘连形成的同时，又不至于干扰正常组织的愈合。对这一平衡点的掌握是预防粘连形成的难题所在。在术后防粘连的各种方法中，采用防粘连材料作为隔离物是目前主要采用的方法。理想的防粘连材料应具有良好的生物相容性；适宜的组织粘附性(不需缝合)；能完全覆盖创伤表面并且具有足够的体内存留时间；能降解吸收而不需二次手术将其取出；既能有效防止粘连形成，又不影响伤口的正常愈合；还应具有一定的机械强度，便于实施操作等。

壳聚糖是由甲壳素部分脱去或全部脱去N-乙酰基团获得的衍生物。壳聚糖具有无毒性、无刺激性、无免疫抗原性、无热源性、不溶血、无致突变反应等优异性能，是一种组织相容性良好的可吸收降解的体内植入生物材料，能被广泛存在于动物组织中的溶菌酶降解，生成天然的无毒代谢产物，且能被生物体完全吸收；具有止血、抑菌、促进上皮细胞生长、抑制成纤维细胞生长、防粘连等功能。

壳聚糖膜材料是以壳聚糖为原料制成的一种防粘连膜材料，具有有效的防粘连作用。但是，纯壳聚糖膜在体内降解速度较慢，常常在创伤已经愈合以后还未完全降解，容易产生副作用(参考文献：Anew method to prepare chitosan membrane as a biomedical material,Chin J Polym Sci,2001)。为了解决纯壳聚糖膜体内降解较慢引发的副作用，明胶和海藻酸钠等用来改善壳聚糖的降解性能。虽然明胶的引入提高了壳聚糖在体内的降解速率，但是此种壳聚糖/明胶共混膜的防粘连作用却不尽理想。如周卸来等发现壳聚糖/明胶共混膜的粘连程度不但强于对照组，而且强于单纯壳聚糖膜治疗组，他们认为产生这一现象的原因可能是由于明胶的引入虽然加速了共混膜的降解速度，但是术后2周，共混膜仍未完全降解，残留的共混膜仍可以引起机体的异物反应，而且明胶作为一种多肽混合物，可能具有抗原性，使机体产生免疫排斥反应，从而促进了局部粘连的形成(参考文献：壳聚糖/明胶共混膜对大鼠腹膜粘连形成的作用，2013)。Shahram等通过改变组分比例制备了一系列壳聚糖/明胶复合薄膜，并探究了其在大鼠盲肠模型中的粘连预防作用，研究发现：当共混膜中壳聚糖的含量为25％时，共混膜的防粘连作用并不显著，而当壳聚糖含量超过25％以后，不仅无法减少粘连的形成，而且会引起炎症反应(参考文献：Evaluation ofchitosan-gelatin films for use as postoperative adhesion barrier in rat cecum model,2013)。

因此，有必要对壳聚糖进行改性，提高其在体内的降解速率。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种百部多糖、共混改性壳聚糖及在制备防粘连膜材料中的应用。

本发明由如下技术方案得以实现：

一种百部多糖，通过如下方法制备：以百部为原料，经水提醇沉、除蛋白后得到粗多糖，再对粗多糖用透析袋透析截留分子量15000-25000kD的多糖即得。

优选地，所述百部为直立百部、蔓生百部或对叶百部的块根，提取前先进行清洗、粉碎。

优选地，所述粗多糖的制备方法为：以百部为原料，沸水回流提取，收集提取液，离心过滤，将滤液浓缩后，加入3-5倍体积的无水乙醇进行醇沉，放置过夜后，过滤，沉淀以Sevage法除蛋白后复溶，再以60-90％乙醇进行沉淀，沉淀经无水乙醇、丙酮反复洗涤后即得粗多糖。

优选地，除蛋白复溶后优选75％乙醇进行沉淀。

上述任一百部多糖在对壳聚糖改性制备多糖共混改性壳聚糖膜中的应用。

一种多糖共混改性壳聚糖膜，以壳聚糖和上述任一所述百部多糖为原料，经过涂膜、烘干、碱洗再干燥的过程制备而成。

优选地，所述的多糖共混改性壳聚糖膜通过如下方法制备而成：在55-65℃将壳聚糖和百部多糖按一定比例溶解于体积百分浓度为1.5-2.5％的乙酸溶液，过滤，静置脱泡，涂膜，放入55-65℃烘箱干燥；取出后在质量百分浓度为4-6％的氢氧化钠溶液中浸泡0.5-1.5h，用蒸馏水洗至中性，干燥即得。

优选地，所述壳聚糖和百部多糖的质量之比优选3-5:1。

上述多糖共混改性壳聚糖膜用作手术防粘连材料的用途。

本发明的优点：

本发明提供的百部多糖的分子量为15000-25000kD，该分子量的百部多糖与壳聚糖共混改性制备得到改性壳聚糖膜不仅具有良好的生物相容性，而且在体内的降解速度适宜，约4周即可完全降解，可有效抑制术后粘连发生，且具有消炎作用，可用作手术防粘连材料。

附图说明

图1为分别采用实施例1中分子量25000kD以上、15000-25000kD多糖对壳聚糖进行共混改性制备的改性壳聚糖膜的SEM电镜图(其中，a为分子量25000kD以上多糖共混改性壳聚糖膜，膜表面的纤维毛状物较为粗短；b为分子量15000-25000kD多糖共混改性壳聚糖膜，膜表面的纤维毛状物较为细长)。

具体实施方式

下面结合实施例详细介绍本发明的实质性技术方案。

实施例1共混改性壳聚糖膜的制备和防防粘连效果评价

一、百部多糖的制备

对叶百部药材50℃恒温干燥，粉碎过60目筛。称取100g药材粉末，以料液比(m/V)1:30，沸水回流提取3次，每次2h，收集提取液，离心过滤，将滤液浓缩为100ml，加入400ml无水乙醇进行醇沉，放置过夜后，过滤，沉淀以Sevage法除蛋白后复溶，再以75％乙醇进行沉淀，沉淀经无水乙醇、丙酮反复洗涤后得到对叶百部多糖，对得到的多糖用透析袋透析截留，透析袋采用美国光谱医学spectrumlabs产品，用截留分子量15000和截留分子量25000的透析袋配合截留分子量15000-25000kD的多糖(百部多糖A)，用截留分子量25000的透析袋截留分子量25000kD的多糖(百部多糖B)，分别将样品浓缩，冷冻干燥即得。

二、共混改性壳聚糖膜的制备

在60℃将壳聚糖和百部多糖A或B按一定比例(壳聚糖和百部多糖的质量比4:1)溶解于体积百分浓度为2％的乙酸溶液，过滤，静置脱泡，涂膜，放入60℃烘箱干燥；取出后在质量百分浓度为5％的氢氧化钠溶液中浸泡1h，用蒸馏水洗至中性，干燥即得。

图1为分别采用上述分子量25000kD以上、15000-25000kD多糖对壳聚糖进行共混改性制备的改性壳聚糖膜的SEM电镜图(其中，a为分子量25000kD以上多糖共混改性壳聚糖膜，膜表面的纤维毛状物较为粗短；b为分子量15000-25000kD多糖共混改性壳聚糖膜，膜表面的纤维毛状物较为细长)。

三、防防粘连效果评价

1、实验分组：SD大鼠，体重(200～250)g，随机分成4组：A组-对照组；B组-植入不含百部多糖的壳聚糖膜；C组-植入含百部多糖A的共混膜；D组-植入含百部多糖B的共混膜。每组24只，雌雄各半。大鼠饲养环境温度24～26℃，湿度约40％，每天亮/暗交替各12h，自由饮食、饮水。手术方法：用3％异戊巴比妥钠腹腔内注射麻醉大鼠(剂量为60mg/Kg)，麻醉成功后仰卧位固定大鼠，拔除下腹部鼠毛，常规消毒铺单后下腹部正中切口逐层进腹，切口长约3cm，找到蚓突后将其提至切口外，然后对距盲端3cm内的蚓突作如下处理：用手术刀片轻刮蚓突前侧面的浆膜面，至浆膜面充血且有少量小出血点。经上述处理后，对照组大鼠直接将其蚓突送回腹腔后关腹，其它各组用相应的膜覆盖经处理的浆膜面，然后将蚓突送回腹腔，关腹。每只大鼠从进腹到关腹的时间都控制在5min，以使肠管暴露在空气中的时间相等。手术后2周及4周，每组分别随机取12只大鼠(雌、雄各6只)，麻醉再次打开腹腔，肉眼观察并评定蚓突盲端经处理过的部位同周围肠管、系膜及腹壁的粘连情况，再切取粘连处的蚓突组织，生理盐水洗净腔内容物后立即用福尔马林固定，随后行病理学检查，光镜下观察局部肠壁的病理改变。

2、腹膜粘连程度分级标准：参考Phillips五级分类法，结合大鼠腹膜粘连特点，确定如下标准：0级-无粘连；Ⅰ级-经处理的蚓突盲端同周围的肠壁、系膜、腹壁间的粘连面积占经处理的蚓突盲端浆膜面面积的百分比<20％；Ⅱ级-上述部位间的粘连百分比为～40％；Ⅲ级-上述部位间的粘连百分比为～60％；Ⅳ-上述部位间的粘连百分比≥60％。在植入膜尚存时，因蚓突的处理面被植入膜覆盖，粘连面积以膜外侧面和周围的肠壁、系膜、腹壁间的粘连面积计。

3、统计方法：利用非参数统计中的等级分组资料H检验来分析组间在相同时间点腹膜粘连程度的差异，用方差分析来分析组间羟脯氨酸水平的差异，再分别作各两两组间的多重比较，设定P<0.05为差异具显著意义。

蚓突有穿孔和/或腹腔内有明显感染的样本不列入统计范围。

5、实验结果：

(1)肉眼观察：所有大鼠皮肤切口均为甲级愈合。术后2、4周未见腹腔内有明显的感染灶存在，无蚓突穿孔。植入壳聚糖膜降解情况：B组-术后4周膜仅有变薄、胀大，尚无明显破裂；C组-术后2周已碎裂，4周时膜完全被吸收、消失；D组-术后2周膜有胀大，4周膜仅破裂成碎片，无明显吸收。在膜尚存时，膜内的蚓突浆膜面光滑，和膜之间无明显粘连。

(2)腹膜粘连程度比较：各组腹膜粘连程度如表1所示。从表1可见，与对照组A组相比，植入不含百部多糖的壳聚糖膜B组会明显加重大鼠腹膜粘连程度；与植入不含百部多糖的壳聚糖膜B组相比，植入含百部多糖A的共混膜C组和植入含百部多糖B的共混膜D组明显可以降低大鼠腹膜粘连程度，尤其是含百部多糖A的共混膜C效果更为显著。

表1各组大鼠不同腹膜粘连程度的只数比较

(3)病理组织学改变的比较：

术后2周，A、B、C、D组大鼠粘连处蚓突组织内以不同程度的水肿、毛细血管扩张充血、白细胞和淋巴细胞等炎性细胞浸润及纤维组织增生为主，其中C组不是很明显；术后4周，各组中的急性炎症反应明显减轻，B组纤维组织增生明显加重，在植入膜周围形成完整的纤维包囊，D组虽然也有较弱的纤维组织增生，但是纤维包囊的囊壁明显较B组薄很多，A组、C组未见明显纤维组织增生。

由此可见，上述百部多糖的分子量为15000-25000kD，该分子量的百部多糖与壳聚糖共混改性制备得到改性壳聚糖膜不仅具有良好的生物相容性，而且在体内的降解速度适宜，约4周即可完全降解，可有效抑制术后粘连发生，且具有消炎作用，可用作手术防粘连材料。

实施例2共混改性壳聚糖膜的制备

一、百部多糖的制备

直立百部药材50℃恒温干燥，粉碎过60目筛。称取100g药材粉末，以料液比(m/V)1:30，沸水回流提取3次，每次2h，收集提取液，离心过滤，将滤液浓缩为100ml，加入400ml无水乙醇进行醇沉，放置过夜后，过滤，沉淀以Sevage法除蛋白后复溶，再以75％乙醇进行沉淀，沉淀经无水乙醇、丙酮反复洗涤后得到对叶百部多糖，对得到的多糖用透析袋透析截留，透析袋采用美国光谱医学spectrumlabs产品，用截留分子量15000和截留分子量25000的透析袋配合截留分子量15000-25000kD的百部多糖，将样品浓缩，冷冻干燥即得。

二、共混改性壳聚糖膜的制备

在60℃将壳聚糖和百部多糖按一定比例(壳聚糖和百部多糖的质量比4:1)溶解于体积百分浓度为2％的乙酸溶液，过滤，静置脱泡，涂膜，放入60℃烘箱干燥；取出后在质量百分浓度为5％的氢氧化钠溶液中浸泡1h，用蒸馏水洗至中性，干燥即得。

实施例3共混改性壳聚糖膜的制备

一、百部多糖的制备

蔓生百部药材50℃恒温干燥，粉碎过60目筛。称取100g药材粉末，以料液比(m/V)1:30，沸水回流提取3次，每次2h，收集提取液，离心过滤，将滤液浓缩为100ml，加入400ml无水乙醇进行醇沉，放置过夜后，过滤，沉淀以Sevage法除蛋白后复溶，再以75％乙醇进行沉淀，沉淀经无水乙醇、丙酮反复洗涤后得到对叶百部多糖，对得到的多糖用透析袋透析截留，透析袋采用美国光谱医学spectrumlabs产品，用截留分子量15000和截留分子量25000的透析袋配合截留分子量15000-25000kD的百部多糖，将样品浓缩，冷冻干燥即得。

二、共混改性壳聚糖膜的制备

在60℃将壳聚糖和百部多糖按一定比例(壳聚糖和百部多糖的质量比4:1)溶解于体积百分浓度为2％的乙酸溶液，过滤，静置脱泡，涂膜，放入60℃烘箱干燥；取出后在质量百分浓度为5％的氢氧化钠溶液中浸泡1h，用蒸馏水洗至中性，干燥即得。

实施例4共混改性壳聚糖膜的制备

一、百部多糖的制备

对叶百部药材50℃恒温干燥，粉碎过60目筛。称取100g药材粉末，以料液比(m/V)1:30，沸水回流提取3次，每次2h，收集提取液，离心过滤，将滤液浓缩为100ml，加入300ml无水乙醇进行醇沉，放置过夜后，过滤，沉淀以Sevage法除蛋白后复溶，再以60％乙醇进行沉淀，沉淀经无水乙醇、丙酮反复洗涤后得到对叶百部多糖，对得到的多糖用透析袋透析截留，透析袋采用美国光谱医学spectrumlabs产品，用截留分子量15000和截留分子量25000的透析袋配合截留分子量15000-25000kD的百部多糖，将样品浓缩，冷冻干燥即得。

二、共混改性壳聚糖膜的制备

在55℃将壳聚糖和百部多糖按一定比例(壳聚糖和百部多糖的质量比3:1)溶解于体积百分浓度为1.5％的乙酸溶液，过滤，静置脱泡，涂膜，放入55℃烘箱干燥；取出后在质量百分浓度为4％的氢氧化钠溶液中浸泡1.5h，用蒸馏水洗至中性，干燥即得。

实施例5共混改性壳聚糖膜的制备

一、百部多糖的制备

对叶百部药材50℃恒温干燥，粉碎过60目筛。称取100g药材粉末，以料液比(m/V)1:30，沸水回流提取3次，每次2h，收集提取液，离心过滤，将滤液浓缩为100ml，加入500ml无水乙醇进行醇沉，放置过夜后，过滤，沉淀以Sevage法除蛋白后复溶，再以90％乙醇进行沉淀，沉淀经无水乙醇、丙酮反复洗涤后得到对叶百部多糖，对得到的多糖用透析袋透析截留，透析袋采用美国光谱医学spectrumlabs产品，用截留分子量15000和截留分子量25000的透析袋配合截留分子量15000-25000kD的百部多糖，将样品浓缩，冷冻干燥即得。

二、共混改性壳聚糖膜的制备

在65℃将壳聚糖和百部多糖按一定比例(壳聚糖和百部多糖的质量比5:1)溶解于体积百分浓度为2.5％的乙酸溶液，过滤，静置脱泡，涂膜，放入65℃烘箱干燥；取出后在质量百分浓度为6％的氢氧化钠溶液中浸泡0.5h，用蒸馏水洗至中性，干燥即得。

经测试，实施例2-5制备的共混改性壳聚糖膜具有与实施例1基本一致的性质，不仅具有良好的生物相容性，而且在体内的降解速度适宜，约4周即可完全降解，可有效抑制术后粘连发生，且具有消炎作用，可用作手术防粘连材料。