基于多色上转换编码荧光技术的生物传感器

摘要

本发明属于生物传感器技术领域，具体为基于多色上转换编码荧光技术的生物传感器。其由样品扫描平台、信号激发系统、信号采集系统、信号处理与整机控制软件组成。样品扫描平台由样本阵列和二维扫描平台组成；信号激发系统由微球编码激光器、报告基团信号激光器、激光聚焦透镜组组成，微球编码激光器用于激发编码微球的上转换荧光信号，信号采集与处理后得到微球的编码信息，报告基团信号激光器用于激发待检测物质的通用报告基团的荧光信号；信号采集系统由信号聚焦/准直镜、滤光片轮、滤光片轮控制电机、光电倍增管、放大电路、模数转换器组成；信号处理与控制软件装载于微机中。该传感器能够实现对核酸、抗体等生物分子的快速检测。

说明书

技术领域

本发明属于生物传感器技术领域，具体涉及使用荧光编码微球技术的生物传感器，该的生物传感器能够在较短的时间内高效率地实现对核酸、抗体等生物分子的识别与浓度测定。

背景技术

在疾病诊断、生物多元分析等研究领域往往需要对大量的蛋白和基因靶向进行识别并获取其浓度信息。荧光编码微球技术是近年内出现的一种检测技术，它能够大幅度提升对蛋白和基因靶向信息的检测效率，且可提供更多的分析识别位点，在医疗诊断、药物筛选、环境保护、基因测序等领域具有很好的应用前景。

荧光编码微球是通过在微米量级的微球内部装入已知比例的多种具有不同发射波长及强度的上转换荧光材料制作而成。由于每个微球具有不同的发射波长、荧光强度信息，所以其光谱编码是唯一的。当利用特定波长的外来光照射微球时，会激发出不同波段的荧光，对这些荧光的波长及强度进行检测，就可以得出该微球的光谱编码，进而确定此微球的种类。上述用来激发微球荧光信号的外来光为激光，称其为微球编码激光。

将某种下转换荧光物质标记于待测生物大分子上，如核酸或抗原，这种荧光物质必须被波长不同于微球编码激光的的另外一种激光照射才会发出荧光，称这种激光为荧光检测激光。为便于探测，由下转换荧光物质激发出的荧光与编码微球激发出的荧光的波长区域一般不重叠。测量时，在微球表面嫁接已知种类的探针，如抗体、核酸序列，并将这种处理后的微球与处理后的待测样品混合。根据杂交原理，同种类的抗体和抗原或者基因序列互补的核酸会相互结合。此时，通过检测微球内部荧光物质的编码即可确定微球表面的探针种类，进而就确定了与探针相结合的样品的种类。确定待测样品种类之后，用荧光测定激光激发标记于待测样品上的荧光物质，测定其发出荧光的强度大小，即可确定该样品的浓度。

在先专利“量子点编码荧光免疫分析仪”（CN 101825570 A）提出了一种量子点荧光检测装置。其基本原理是：激光器发出的激光经处理后照射至样品槽上，样品被注射泵送到样品槽中被激光照射而激发出一定波长的荧光，该荧光被光电倍增管放大后经由半透半反镜分别进入CCD摄像头和光谱仪，CCD摄像头检测其荧光强度，光谱仪检测其波长，根据得出的信息即可判断样品种类。

在先专利“微流控芯片荧光检测光学装置”（CN 100557419 C）提出了一种微流控芯片荧光检测光学装置。其基本原理为：样品置于检测平台上，激光器出射光波经滤光片与准直系统后变为平行光束，该光束经过半透半反镜后的反射光照射至样品上。样品被激发出的荧光经过物镜、反射镜以及滤光片后进入光电倍增管，光电倍增管将信号放大后进行模数转换，转换后的信号值送至计算机进行处理。此外，该系统中还采用了CCD摄像头对系统进行对焦。

现有的这些技术主要存在着以下几个缺点：

（1）只能利用编码微球测出待测样品的种类，并不能测出待测样品浓度；

（2）半透半反镜的使用使光能利用率下降，不利于编码的精确测定；

（3）光谱仪的价格昂贵，成本过高，同时不利于仪器的小型化与便携性。CCD摄像头增加仪器成本，并且还需要光路对焦等操作，使用起来较为不便；

（4）样品放在样品槽中进行测定，需要注射泵等设备将样品泵至激光光斑上，不易于操作，花费时间长，检测通量小；

（5）系统中可动器件太多，光路不固定，需要调焦等操作，操作复杂，并且还会增加仪器成本。

发明内容

本发明旨在克服上述现有技术的不足，提供一种检测灵敏度高、精度高且效率高的基于多色上转换编码荧光技术的生物传感器。

本发明提供的基于多色上转换编码荧光技术的生物传感器，主要由样品扫描平台、信号激发系统、信号采集系统、信号处理与整机控制软件这几部分组成。其中，样品扫描平台由样本阵列和二维扫描平台组成；信号激发系统由微球编码激光器、报告基团信号激光器、激光聚焦透镜组成，其中微球编码激光器用于激发编码微球的上转换荧光信号，信号采集与处理后得到微球的编码信息，报告基团信号激光器用于激发待检测物质的通用报告基团的荧光信号，其荧光强度能够反映出待检测物质的浓度；信号采集系统由信号聚焦/准直镜、滤光片轮、滤光片轮控制电机、光电倍增管、放大电路、模数转换器组成；信号处理与整机控制软件装载于微控制器与微机中。

上述部件的位置关系如下：

整个传感器为上下结构，样品扫描平台位于最上方，信号激发系统位于样品扫描平台的下方两侧，信号采集系统处于样品扫描平台的正下方，装载有信号处理与整机控制软件的微控制器与微机则可以在任意位置。具体来说，最上面的是样品阵列，它放置在二维扫描平台上设置的卡槽中。卡槽位于聚焦/准直镜的焦平面上，在任一时刻，正被测量的微球则位于聚焦/准直镜的焦点上。微球编码激光器与报告基团信号激光器对称地放置在二维扫描平台下方的左右两侧，且它们的出射光以相同角度斜入射到样品上。激光聚焦透镜由一个透镜或透镜组构成，分别置于两个激光器正前方，保证有足够小的光斑照射在样品微球上，需要指出的是：两个激光器的焦点与聚焦/准直镜的焦点重合。信号聚焦/准直镜与滤光片轮在二维扫描平台的正下方，用来聚焦、收集荧光信号，需要注意的，滤光片轮置于信号聚焦/准直镜的平行光路中，放置在其上的多块滤光片均垂直于平行光路的光轴。滤光片轮控制电机与滤光片轮连接，控制滤光片轮的旋转。光电倍增管的信号采集窗口在信号聚焦/准直镜焦平面位置处。光电倍增管将采集到的微弱光信号放大为电流信号后传递给放大电路，放大电路将电流信号进一步放大并将其转换为电压信号后传递给模数转换器，模数转换器将此模拟信号转换为数字信号后交由微控制器处理。放大电路、模数转换器与微控制器制作在一块电路板上，该电路板的位置可以随意安置。微控制器最终将信号预处理后传递给微机做最终的处理。

所述样品阵列由多个微球组成，微球内部封装有待测上转换荧光材料。

所述二维扫描平台由两个步进电机、两个导轨及卡槽平台构成，这两个电机可以分别沿着两个导轨方向带动卡槽平台做二维机械运动，实现激光光束相对样品阵列的二维扫描运动。

所述微球编码激光器与报告基团信号激光器均为半导体激光器，它们出射光中心波长有所差别。

所述激光聚焦透镜采用双透镜结构或者单透镜结构，对激光器出射光聚焦后使其光斑尺寸略小于微球直径。

所述信号聚焦/准直镜为多透镜组合而成的透镜组。

所述滤光片轮上安装有多个窄带滤光片。

所述滤光片轮控制电机是一个步进电机，用来控制滤光片轮的转动。

所述光电倍增管为侧窗型光电倍增管，在可见光区域具有平坦且很高的量子效率。

所述放大电路由高精度低漂移运算放大器组成。

所述模数转换器可以为单独模块或者微控制器内部自带模数转换器。

所述微控制器为市场上通用MCU芯片。

所述微机为普通的计算机。

与现有技术相比，本发明具有下列的有益效果：

1、使用的纳米粒子为掺杂了稀土元素的无机固体化合物，其荧光光谱仅与稀土元素的掺杂浓度有关。发射的荧光峰宽较窄且多个发射峰之间没有重叠，因而很容易实现单一波长激发的多色荧光编码。此外，由于不需要荧光补偿校正，提高了检验精度，减少了样品制备工作量，降低了检验成本；

2、微球编码激发波长属于近红外光，对生物分子的毒性小，对样品的光损伤与光漂白都比较小；

3、不论是在微球编码激光还是在荧光测定激光的激发下，微球的荧光与荧光报告分子的荧光光谱均不会发生重叠。因此多个不同颜色的荧光报告分子可以同时使用，可以进一步提高检测的灵敏度与数量；

4、本发明使用样品阵列，一次可以检测多达十万个样品，检测通量大大提高；

5、在样品阵列已制备完成的情况下，本发明检测样品所花费的时间很短，实现了快速检验；

6、本发明使用了滤光片对各色荧光强度逐一检测，不需要光谱仪检测波长，减小了此类传感器的体积，降低了成本，有利于仪器的小型化与便携性，对实现此类传感器的“病床边检测”十分有利；

7、采用信号聚焦/准直镜与光电倍增管相结合的方式，提高了系统的信噪比，提高了检验精度。此外，由于未使用CCD摄像头，降低了仪器操作难度与成本；

8、系统采用了微球编码激光器和报告基团信号激光器，可以同时测定待测样品的种类和浓度。

附图说明

图1为本发明基于多色上转换编码荧光技术的生物传感器的装置简化示意图。

图2为本发明基于多色上转换编码荧光技术的生物传感器的装置与光路示意图。

图3为本发明控制程序流程图。

图4为本发明微球检测实例图。

图中标号：101为样本阵列，102为二维扫描平台，201为微球编码激光器，202为报告基团信号激光器，203为激光聚焦透镜组；301为信号聚焦/准直镜，302为滤光片轮，303为滤光片轮控制电机，304为光电倍增管，305为放大电路，306为模数转换器；401为微控制器，402为微机。

具体实施方式

下面结合附图和实例对本发明作进一步说明，但不应以此限制本发明的保护范围。

请参阅图2，图2为本发明基于多色上转换编码荧光技术的生物传感器的装置与光路示意图。由图可见，本发明分为四个系统，又可进一步细分为十三个部分。四个系统分别为：样品扫描平台、信号激发系统、信号采集系统、信号处理与整机控制软件。其中，样品扫描平台分为样本阵列101和二维扫描平台102两个部分；信号激发系统分为微球编码激光器201、报告基团信号激光器202、激光聚焦透镜组203三个部分；信号采集系统分为信号聚焦/准直镜301、滤光片轮302、滤光片轮控制电机303、光电倍增管304、放大电路305、模数转换器306六个部分；信号处理与整机控制软件装载于微控制器401与微机402这两个部分中。上述部件的位置关系如下：

整个传感器是上下结构，样品扫描平台在上，信号激发系统在样品扫描平台的下方两侧，而信号采集系统处于样品扫描平台的正下方，装载有信号处理与整机控制软件的微控制器与微机则可以在任意位置。具体来说，在最上面的是样品阵列101，样品阵列放置在二维扫描扫描平台102的卡槽中。980nm微球编码激光器201与635nm报告基团信号激光器202一左一右在二维扫描平台的下方两侧，激光聚焦透镜203由一个透镜或透镜组构成，分别置于两个激光器正前方，保证有足够小的光斑照射在样品微球上。信号聚焦/准直镜301与滤光片轮302在二维扫描平台的正下方，用来收集、聚焦荧光信号，需要注意的是，滤光片轮置于信号聚焦/准直镜的平行光路中，滤光片轮控制电机303与滤光片轮连接，控制滤光片轮的旋转。光电倍增管304的信号采集窗口在信号聚焦/准直镜焦平面附近。光电倍增管对采集到的微弱光信号放大为电流信号后将信号传递给放大电路305，放大电路将此信号继续放大并将其转换为电压信号，之后传递给模数转换器306，模数转换器将此模拟信号转换为数字信号后交由微控制器401处理，放大电路、模数转换器与微控制器在一张电路板上，这张电路板的位置可以随意安置。微控制器最终将信号预处理后传递给微机402做最终的处理。

所述样品阵列101大小为30*50mm，由十万多个直径在100 μm以内的微球组成。微球的制作过程为：首先制备蓝光（475 nm）、绿光（550 nm）和红光（650 nm）三种颜色的上转换纳米颗粒，通过溶胀法将三种纳米材料吸附到聚苯乙烯微球中，调节三种纳米颗粒的比例，可以改变微球荧光编码信号。三个荧光发射峰的相对比例不同就意味着不同的荧光编码，这样可以得到多种不同荧光编码的微球。对具有不同编码的微球进行处理，使其表面携带不同的探针分子，这些探针分子可以是已知类别的核酸、抗体或者抗原。能够与这些核酸、抗体或者抗原发生杂交效应或抗原抗体反应的核酸、抗原或者抗体就是系统将要测定的生物分子。将处理过的微球与将要测定的生物分子混合，悬液中的微球与被检测物发生特异性结合。最后，再在被检测生物分子的末端标记上报告荧光，此报告荧光在635nm的红光激发下会发出荧光，这样，本发明要测定的样品就制成了。将制好的样品进行阵列式排布，也就得到了最终用于测量的样品阵列。

所述二维扫描平台102由两个带有导轨、平台的步进电机构成，这两个电机分别沿着X轴方向和Y轴方向驱动工作平台做二维机械运动，实现激光光束相对样品阵列的二维扫描运动。

所述微球编码激光器201与报告基团信号激光器202都是半导体激光器，只是出射光中心波长有所差别。

所述激光聚焦透镜203采用双-单透镜结构，对激光器出射光聚焦后使其光斑尺寸略小于微球直径。

所述信号聚焦/准直镜301为多透镜组合而成的透镜组。

所述滤光片轮302上安装有四个带通滤光片，其通带中心波长分别是650nm、550nm、480nm和670nm。

所述滤光片轮控制电机303是一个步进电机，用来控制滤光片轮的转动。

所述光电倍增管304型号为CR131，为侧窗型光电倍增管，在可见光区域具有平坦且很高的量子效率。

所述放大电路305由高精度低漂移运算放大器组成。

所述模数转换器306为微控制器内部自带16位模数转换器。

信号聚焦/准直镜与滤光片轮起到信号收集的作用，滤光片轮控制电机控制滤光片轮的转动，以适应系统在不同时刻需要不同滤光片的要求。样品经两个激光器激发后发出的荧光信号经聚焦/准直镜和滤光片后投射到光电倍增管的采集窗口上，光电倍增管对此微弱信号信号进行放大，然后放大电路将光电倍增管放大的电流信号继续放大，但是转换为电压信号，最终此电压信号被模数转换器采集，传递给系统中的信号处理部分。

所述微控制器401为STM32系列的一款芯片，型号为STM32F103RBT6。微控制器更多地参与对整机的控制，包括二维平台的运动，激光器光束的发出，以及滤波片控制电机的转动这几个功能，同时它还要把模数转换器传递给它的信号传递给微机。

所述微机402为普通的带有串口或USB接口的计算机。微机是整个系统的最终端，它将系统采集到的信息与数据库中的数据做比对，得出样品中生物分子的类型，并且对信号做计算，得出样品中生物分子的浓度。最终微机将测量得到的结论传达给用户，实现生物传感器的功能。

利用上述器件所构成的基于多色上转换编码荧光技术的生物传感器，具体实施方式包括如下步骤：

①制备样品阵列；

②将样品阵列放在二维扫描平台的卡槽里，打开仪器，校准二维扫描平台的位置，使激光束正好打在第一个样品微球上；

③确定二维扫描平台的位置正确后，开始扫描。使微球编码激光器发出的激光束照射样品，然后控制装有波长分别为480nm，550nm和650nm三种滤光片的滤光片轮转动，与此同时测定出荧光信号经过这三块滤光片后的信号值，即得到这三种颜色光的光强；接着使报告基团信号激光器发出的激光束照射在同一样品上，旋转滤光片轮至670nm滤光片处，得到此时模数转换值，也就得到了荧光强度；

④对得到的数据进行处理。通过步骤①~③可以得到每个微球的编码信息以及荧光信息。通过微球的编码信号，可以判断出微球的类别，而微球表面携带的探针分子类型是已知的，进而可以得出待测生物分子的类别。由于荧光信号强度会随着样品中待测生物分子含量的不同而不同，所以根据系统测定的荧光信号的强度就可以确定样品中所含生物分子的数量；

⑤移动二维扫描平台，使激光束对准下一个样品微球，重复步骤③④；

⑥由微机报告定性判断和定量测定的结果。