一种洗护用品中氯霉素类抗生素化学风险物质的筛查方法

摘要

本发明公开了一种洗护用品中氯霉素类抗生素化学风险物质筛查方法，包括如下步骤：(1)建立待测化合物的精确质量数据库和质谱谱库；(2)实际样品的前处理和检测：洗护用品样品经提取、离心、净化、过滤等前处理步骤，得到的样品溶液进行高压液相色谱‑四极杆‑静电场轨道阱高分辨质谱分析检测；(3)将步骤(2)得到的试验结果与步骤(1)中建立的精确质量数据库和质谱谱库比对分析，进行化学风险物质的筛查。本发明建立的洗护用品中氯霉素类抗生素化学风险物质筛查方法准确性高、特异性强、灵敏度高，可适用于洗护用品的日常检测和质量控制。

说明书

技术领域

本发明涉及一种化学物质的筛查方法，特别是涉及一种基于高压液相色谱-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱联用技术的洗护用品中氯霉素类抗生素化学风险物质的筛查方法。

背景技术

1.洗护用品中的化学风险物质对消费者人身健康存在潜在危害作用。

洗护用品从诞生之初就是为人们追求洁净、健康和时尚的生活提供保障，随着社会的不断发展进步，人们对洁净、健康和时尚的生活方式的追求也不断升级，从而带动洗护用品行业步入了发展和升级的快车道。当前，洗护用品市场产品琳琅满目，功能化、细分化、专业化产品不断涌现，满足着广大消费者的多元化需求。

在洗护用品日益成为人们生活必需品的今天，其安全性也越来越受到广泛重视。2014年，韩伊洗发水被第三方权威检测机构检测出含有可能的致癌物丙烯酰胺，其中两种防腐剂-甲基异噻唑啉酮和甲基氯异噻唑啉酮也被检出超标近两倍，极易引起人体皮肤过敏；作为强生标志性产品之一的婴儿洗发水，其最大卖点就是不刺激眼睛，但该产品在2009年被美国查出含有毒物质二噁烷和能释放出甲醛的季铵盐成分；2010年，北京市疾病预防控制中心在抽查国内洗护用品过程中，相当比例产品被检出邻苯二甲酸酯，其中香水的检出率高达92.3％(邻苯二甲酸酯是危害人类生殖能力的环境激素)；另外，洗漱用品中的三氯生以及其它洗护用品中的抗生素和激素等也是潜在的化学风险物质。

长期使用含有上述有毒有害物质的洗护产品可导致面部皮肤黑斑、萎缩变薄、骨质疏松、肌肉萎缩、代谢紊乱等问题，严重可引起癌症的发生。商家为了它短期带来的效果，以吸引顾客购买，仍然采用套装组合系类，在某种或某几种产品中加有激素等类似活性成分，也便于逃避检查。因此，其危害性不容小觑。

2.洗护用品中化学风险物质监管相对滞后，预防能力不足。

根据美国国家电子伤害监测系统(NEISS)统计，2001～2009年各类洗护用品引发的安全事件累计达7405起。欧盟非食品类消费品快速预警系统(RAPEX)、美国消费品安全委员会(CPSC)、美国食品药品监督管理局(FDA)也均发布了针对洗护用品中违规添加化学物质的风险预警。

近年来，我国在洗护用品安全监管方面投入的财力、人力和物力越来越多，但在愈演愈烈的产品安全事件面前，仍显得力不从心。其中主要问题是我国的监管模式多以事后补救为主，在产品前期的预防方面所下功夫尚显不足，其主要表现为发达国家屡屡出台新的法规制度，导致我国的产品频频被召回，如2013年，强生的婴儿洗护用品被召回48次；宝洁(中国)有限公司在2011年召回问题漱口水等事件。

3.高分辨质谱在化学风险物质的筛查方面具有优势。

目前，对于目标化合物的定量检测，国内外相关研究均主要采用三重四极串联质谱。而采用高分辨质谱技术的洗护用品检测方法未见报道。

发明内容

随着法规的日益严格，要求检测的化学风险物质数量越来越多，通过多反应监测模式进行检测的传统方法已经无法满足这种高通量筛查的要求，化学风险物质的测定应向快速和高通量发展。高分辨质谱其分辨率和质量精度明显优于三重四极质谱，是一类能同时定性和定量的质谱；可在宽质量范围内实现高分辨，得到物质精确分子量；获得真实的同位素分布；具有高灵敏度串联质谱功能，实现母离子和子离子的精确质量测定。因此，本发明要解决的技术问题是提供一种具有高分辨率和质量精度，可在宽质量范围内得到物质精确分子量信息，获得真实的同位素分布，具有高灵敏度串联质谱功能，实现母离子和子离子的精确质量测定的洗护用品中化学风险物质的筛查方法。

一种洗护用品中氯霉素类抗生素化学风险物质的检测方法，包括如下步骤：

样品的前处理和检测：洗护用品样品经提取、离心、净化、过滤等前处理步骤，得到的样品溶液进行高压液相色谱-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱分析检测；所述高压液相色谱-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱分析检测中，色谱分离条件如下：

色谱柱：Agilent ZORBAX XDB-C₈，长度150mm，内径2.1mm，粒径3.5μm；柱温：25℃；流速：0.35mL>-1；进样量：10μL；

所述氯霉素类抗生素包括氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考。

本发明所述的洗护用品中氯霉素类抗生素化学风险物质的检测方法，其中，所述高压液相色谱-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱分析检测中，流动相及梯度洗脱程序见表1：

表1 色谱流动相及梯度洗脱程序

所述高压液相色谱-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱分析检测中，四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱检测条件如下：

电喷雾电压：负离子模式2.7kV；鞘气压力：34，任意单位；辅助气压力：5，任意单位；离子源温度：360℃；传输金属毛细管温度：330℃；透镜射频电压：54V；扫描范围：质荷比100-800；一级质谱全扫描分辨率：70000，半峰全宽；轨道阱最大容量：1×10⁶；轨道阱最大注入时间：95ms；

数据依赖的二级子离子全扫描分辨率：17500，半峰全宽；隔离窗口：质荷比±2；归一化碰撞能量：20,40,60eV；轨道阱最大容量：1×10⁵；轨道阱最大注入时间：95ms；动态排除时间：6s。

本发明所述的洗护用品中化学风险物质的检测方法，其中，所述前处理包括如下步骤：

称取0.5g的洗护用品样品至10mL塑料离心管中，加入2mL饱和氯化钠溶液，涡旋30s进行混合破乳，然后加入8mL甲醇，超声提取30min；提取液在12000rpm转速下离心15min，吸取上清提取液，经0.22μm微孔滤膜过滤后进行高压液相色谱-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱分析检测。

一种洗护用品中化学风险物质的筛查方法，包括如下步骤：

(1)建立待测化合物的精确质量数据库和质谱谱库，所述精确质量数据库包括化合物名称、分子式、色谱保留时间及一个前体离子和两个特征碎片离子的精确质量数信息，所述质谱谱库中包括对待测化合物分别施加不同碰撞能量后产生的二级质谱图；

(2)本发明所述的样品前处理和检测方法；

(3)将样品前处理和检测方法得到的试验结果与建立的待测化合物的精确质量数据库和质谱谱库进行比对分析，只有当前体离子及两个特征碎片离子的精确质量数、色谱保留时间、前体离子的同位素峰分布和二级质谱图与精确质量数据库及质谱谱库信息全部匹配时，可确定实际样品中筛查检测出待测化合物。

本发明所述的洗护用品中化学风险物质的筛查方法，其中，所述待测化合物的精确质量数据库和质谱谱库建立方法具体包括如下步骤：

精确质量数据库：分别配制浓度为100μg/L的待测化合物标准溶液，采用高压液相色谱-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱仪器配备的蠕动泵直接进样，分别在正、负离子模式下进行分析检测，确定相应待测化合物的前体离子精确质量数；

对每种待测化合物施加碰撞能量，得到每种化合物的碎片离子，选择两个响应强度较高的碎片离子作为特征碎片离子；

在上述过程中，分别对电喷雾电压、离子源温度、鞘气压力、分辨率等质谱关键参数进行优化；

配制浓度为100μg/L的待测化合物的混合标准溶液，优化高压液相色谱分离条件，得到每种化合物的色谱保留时间；

建立精确质量数据库：分别输入每种化合物的名称、分子式、化学文摘编号、前体离子精确质量数、两个特征碎片离子的精确质量数、色谱保留时间及保留时间窗口，另外还输入待测化合物的响应阈值，当待测化合物的信号响应超过该阈值时，相应前体离子进一步进行二级质谱分析；待测化合物及其前体离子和碎片离子的精确质量数信息见表2；

表2 待测化合物及其前体离子和碎片离子的精确质量数信息

建立质谱谱库：分别配制浓度为100μg/L的待测化合物标准溶液，采用高压液相色谱-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱仪器配备的蠕动泵直接进样分析，设置一系列不同碰撞能量，将目标化合物打碎获得每种化合物的二级质谱图；输入、存储所有二级质谱图，即得到全部待测化合物的质谱谱库。

图1为本发明方法中氯霉素类抗生素化学风险物质的质谱图，其中，各代号指代关系如下：1.氯霉素；2.甲砜霉素；3.氟苯尼考。

本发明所述的洗护用品中氯霉素类抗生素化学风险物质的筛查方法，其中，待测化合物中采用负离子模式进行质谱分析；

标准溶液的配制包括如下步骤：分别配制500-1000μg>-1的标准储备溶液，于4℃条件下避光保存；配制10μg>-1的混合标准溶液，然后经甲醇稀释，配制成一系列不同浓度的基质匹配标准溶液；

氯霉素类抗生素采用甲醇溶剂溶解。本发明洗护用品中氯霉素类抗生素化学风险物质的筛查方法与现有技术不同之处在于：

本发明建立了基于高压液相色谱-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱联用技术的洗护用品中氯霉素类抗生素化学风险物质的筛查方法，将有效解决洗护用品中氯霉素类抗生素的筛查确证技术难题，可用来开展洗护用品中有毒有害物质的风险评估及限量标准的制定工作，从而降低由化学风险物质对消费者造成伤害事件的发生几率，营造健康良好的消费环境；研究成果还可以引导企业在产品生产过程中避免使用导致安全隐患的化学风险物质，使消费者更加清楚认识到洗护用品中化学风险物质的潜在危害，从而提高社会的整体安全消费观，产生良好的社会效益。

洗护用品的相关法律法规和标准是衡量和控制产品质量特性的主要手段和技术依据，企业等只有了解了这些法律法规和标准，才能有效促进洗护产品的健康和规范发展，从而使产品获得良好经济效益。本发明建立的筛查方法可为相关检测机构提供有效技术支撑，进一步完善与提高洗护用品的各项管理法规标准，规范洗护用品行业的市场经济规则与经营秩序，提高洗护用品行业的技术创新能力，缩短与国际洗护用品行业的技术差距，将对加快中国相关企业的可持续健康发展有重要的经济意义。

本发明所述方法具有高分辨率和质量精度，可在宽质量范围内得到物质精确分子量，获得真实的同位素分布，具有高灵敏度串联质谱功能，实现母离子和子离子的精确质量测定的洗护用品中化学风险物质的筛查方法。

本发明建立了一种基于高压液相色谱-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱结合精确质量数据库和谱库的洗护用品中氯霉素类抗生素的快速筛查和定量分析策略。通过对本发明的方法的检出限、定量限、线性关系、稳定性和基质效应的考察以及实际样品的检测，本发明建立的快速分析方法准确性高、特异性强、灵敏度高，可适用于洗护用品的日常检测和生产质量控制。

下面结合附图对本发明的洗护用品中氯霉素类抗生素化学风险物质的筛查方法作进一步说明。

附图说明

图1为本发明方法中氯霉素类抗生素化学风险物质的质谱图，其中，各代号指代关系如下：1.氯霉素；2.甲砜霉素；3.氟苯尼考。

具体实施方式

实施例1

一种洗护用品中化学风险物质的检测方法，包括如下步骤：

洗护用品样品经提取、离心、净化、过滤等前处理步骤，得到的样品溶液进行高压液相色谱-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱分析检测；高压液相色谱-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱分析检测中，色谱分离条件如下：

色谱柱：Agilent ZORBAX XDB-C₈，长度150mm，内径2.1mm，粒径3.5μm；柱温：25℃；流速：0.35mL>-1；进样量：10μL，流动相及梯度洗脱程序见表1：

表1 色谱流动相及梯度洗脱程序

所述高压液相色谱-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱分析检测中，四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱检测条件如下：

电喷雾电压：负离子模式2.7kV；鞘气压力：34，任意单位；辅助气压力：5，任意单位；离子源温度：360℃；传输金属毛细管温度：330℃；透镜射频电压：54V；扫描范围：质荷比100-800；一级质谱全扫描分辨率：70000，半峰全宽；轨道阱最大容量：1×10⁶；轨道阱最大注入时间：95ms；

数据依赖的二级子离子全扫描分辨率：17500，半峰全宽；隔离窗口：质荷比±2；归一化碰撞能量：20,40,60eV；轨道阱最大容量：1×10⁵；轨道阱最大注入时间：95ms；动态排除时间：6s。

前处理包括如下步骤：

称取0.5g的洗护用品样品至10mL塑料离心管中，加入2mL饱和氯化钠溶液，涡旋30s进行混合破乳，然后加入8mL甲醇，超声提取30min；提取液在12000rpm转速下离心15min，吸取上清提取液，经0.22μm微孔滤膜过滤后进行高压液相色谱-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱分析检测。

所述氯霉素类抗生素包括氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考。

采用本实施例1的方法对38种洗护用品样品进行了氯霉素类抗生素化学风险物质的检测。结果表明，有2个样品筛查出含有氯霉素，含量分别为15.078mg/kg和59.213mg/kg。

实施例2

一、仪器与试剂

Dionex UltiMate 3000快速高效液相色谱系统(美国Thermo Fisher公司)；QExactive Focus四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱仪(美国Thermo Fisher公司)；Milli-Q超纯水仪(美国Millipore公司)；Vortex-Genie 2涡旋振荡器(美国ScientificIndustries公司)。

甲醇、乙腈(色谱纯，美国Thermo Fisher公司)；氢氧化铵、甲酸(色谱纯，美国DimaTechnology公司)；实验室用水为去离子水。碳十八、N-丙基乙二胺和石墨化碳黑(德国Macherey-Nagel公司)；多壁碳纳米管(德国Miltenyi Biotec GmbH公司)；无水硫酸镁、氯化钠(广州西陇化工有限责任公司)；0.22μm微孔滤膜(美国Pall公司)。

分别配制500-1000μg>-1的标准储备溶液，于4℃条件下避光保存。配制10μg>-1的混合标准溶液，然后经甲醇稀释，配制成一系列不同浓度的基质匹配标准溶液。

目标化合物的分子式、分子量、化学文摘编号、油水分配系数及配制溶剂等信息见表3。

表3 目标化合物的名称、分子式、分子量、化学文摘编号、油水分配系数及配制溶剂等信息

二、精确质量数据库和质谱谱库的建立

精确质量数据库包括化合物名称、分子式(用来计算同位素峰分布)、保留时间及前体离子和两个特征碎片离子的精确质量数(表4)。谱库中包括针对每种化合物采用不同碰撞能量后经分析产生的二级质谱图。谱库可以看作是对采样数据经精确质量数据库筛查后的辅助确证手段。

待测化合物的精确质量数据库和质谱谱库建立方法具体包括如下步骤：

精确质量数据库：分别配制浓度为100μg/L的待测化合物标准溶液，采用高压液相色谱-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱仪器配备的蠕动泵直接进样，分别在正、负离子模式下进行分析检测，确定相应待测化合物的前体离子精确质量数；

对每种待测化合物施加碰撞能量，得到每种化合物的碎片离子，选择两个响应强度较高的碎片离子作为特征碎片离子；

在上述过程中，分别对电喷雾电压、离子源温度、鞘气压力、分辨率等质谱关键参数进行优化；

配制浓度为100μg/L的待测化合物的混合标准溶液，优化高压液相色谱分离条件，得到每种化合物的色谱保留时间；

建立精确质量数据库：分别输入每种化合物的名称、分子式、化学文摘编号、前体离子精确质量数、两个特征碎片离子的精确质量数、色谱保留时间及保留时间窗口，另外还输入待测化合物的响应阈值，当待测化合物的信号响应超过该阈值时，相应前体离子进一步进行二级质谱分析；

建立质谱谱库：分别配制浓度为100μg/L的待测化合物标准溶液，采用高压液相色谱-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱仪器配备的蠕动泵直接进样分析，设置一系列不同碰撞能量，将目标化合物打碎获得每种化合物的二级质谱图；输入、存储所有二级质谱图，即得到全部待测化合物的质谱谱库。

图1为本发明方法中氯霉素类抗生素化学风险物质的质谱图，其中，各代号指代关系如下：1.氯霉素；2.甲砜霉素；3.氟苯尼考。

三、样品前处理

称取0.5g的洗护用品样品至10mL塑料离心管中，加入2mL饱和氯化钠溶液，涡旋30s进行混合破乳，然后加入8mL甲醇，超声提取30min；提取液在12000rpm转速下离心15min，吸取上清提取液，经0.22μm微孔滤膜过滤后进行高压液相色谱-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱分析检测。

四、色谱分离条件

色谱柱：Agilent ZORBAX XDB-C₈，长度150mm，内径2.1mm，粒径3.5μm；柱温：25℃；流速：0.35mL>-1；进样量：10μL，流动相及梯度洗脱程序见表1：

表1 色谱流动相及梯度洗脱程序

五、质谱检测条件

电喷雾电压：负离子模式2.7kV；鞘气压力：34，任意单位；辅助气压力：5，任意单位；离子源温度：360℃；传输金属毛细管温度：330℃；透镜射频电压：54V；扫描范围：质荷比100-800；一级质谱全扫描分辨率：70000，半峰全宽；轨道阱最大容量：1×10⁶；轨道阱最大注入时间：95ms；

数据依赖的二级子离子全扫描分辨率：17500，半峰全宽；隔离窗口：质荷比±2；归一化碰撞能量：20,40,60eV；轨道阱最大容量：1×10⁵；轨道阱最大注入时间：95ms；动态排除时间：6s。

六、实验数据比对分析

将样品检测实验数据结果与建立的待测化合物的精确质量数据库和质谱谱库进行比对分析，只有当前体离子和两个特征碎片离子的精确质量数、色谱保留时间、前体离子的同位素峰分布和二级质谱图与精确质量数据库及质谱谱库中全部匹配时，结果方显示为阳性样品。

具体包括如下步骤：

设置质量数提取窗口、保留时间窗口和同位素分布阈值参数，按照所设置的参数，对所采集的样品数据进行比对分析：

第一，根据设定的参数，如质量数提取窗口±5ppm、色谱峰面积不小于1×10⁶，进行数据库中前体离子精确质量数的提取；如果样品全扫描采集数据中出现数据库中目标化合物的前体离子质量数，且色谱峰面积不小于1×10⁶，则视为前体离子精确质量数比对成功；

第二，色谱保留时间，设置的保留时间窗口标准偏差为±3，如果前体离子的色谱保留时间落在数据库中相应保留时间标准偏差±3范围内，则视为保留时间匹配成功；

第三，根据待测化合物的分子式进行同位素分布计算，设置的阈值为90％，当样品数据中前体离子的同位素分布与数据库比对匹配度90％，则视为匹配成功；

第四，根据数据库中的两个特征碎片离子与实验结果采集获得的两个碎片离子的比对情况，如果实验值与数据库中碎片离子精确质量数偏差不超过±5ppm，则视为匹配成功；

第五，将实验采集获得的二级质谱图与质谱谱库进行比对；在该阶段，前体离子、全部碎片离子以及相对离子丰度比均进行比对，如果全部吻合，则视为匹配成功。

七、结果

采用本实施例2的方法对38种洗护用品样品进行了氯霉素类抗生素化学风险物质的检测。结果表明，有2个样品筛查出含有氯霉素，含量分别为15.078mg/kg和59.213mg/kg。

八、讨论

1、筛查方法的建立

为充分发挥静电场轨道阱高分辨质谱在筛查分析中的优势，本研究采用全扫描-数据依赖的二级子离子扫描方式。在这种采集方式中，质谱首先进行全质量数(m/z 100-800)扫描，当数据库中某些目标化合物的离子被检测出且其强度不低于某一设定阈值时，则该离子将被送入高能碰撞池中进行碎裂，并产生子离子碎片。

在化合物筛查阶段，目标物质的检测主要依据三大关键参数：前体离子精确质量数、保留时间和同位素峰分布。精确质量数提取窗口的设置对于方法的检测灵敏度和选择性有着至关重要的影响。在本发明中，分别采用了浓度为100μg L^-1的混合标准溶液和500μgkg^-1的加标试样进行本参数的优化。实验结果表明，在两种溶液中，质量数偏差分别优于2ppm和3.5ppm。考虑到后续的特征碎片离子和二级谱图确证，同时也尽量避免假阴性结果的出现，本研将质量数的提取窗口设置为5ppm，此时既能保证无假阴性结果的出现，又对方法检测的选择性和灵敏度无显著影响。对于保留时间参数，保留时间窗口的合理设置对于筛查结果的准确性起着较为重要的作用。由于不同高分辨质谱系统的应用和不同人员的操作，保留时间可能会存在轻微漂移，因此，本研究设置了保留时间窗口为平均保留时间±3×保留时间标准偏差。在质谱全扫描阶段，由于不同分辨率的设置对方法的选择性和灵敏度也存在一定的影响，本研究也对质谱分辨率参数进行了详细优化。实验设置了三个不同的分辨率(30000,50000,70000半峰全宽)分别进行数据采集，结果表明，在70000半峰全宽的分辨率下，所有目标化合物的质量精度最高，灵敏度较前两者无明显区别，而且仍可提供10～15的扫描点以获得优良的色谱峰形。

在确证阶段，本研究采集了各目标化合物的二级质谱图，并记录了每种化合物的两个特征碎片离子精确质量数。在一级质谱扫描阶段，70000半峰全宽的分辨率已提供足够高的选择性，此时，灵敏度应是考虑的主要方面，因此，在确证阶段，我们将质谱分辨率设定为较低且常用的17500半峰全宽。为获得较完整的二级质谱图，本研究采用了归一化碰撞能量20，40和60eV，并记录其中两个响应强度较高碎片离子的精确质量数至数据库中。在高分辨质谱分析中，针对一些关键参数，如喷雾电压、毛细管温度、气帘气、吹扫气以及透镜射频电压也进行了详细优化。

2、线性关系、检出限及定量限

用处理过的样品溶液将混合标准储备溶液依次稀释成系列浓度梯度的混合工作溶液，在优化的色谱质谱条件下进行测定，以各目标物质的分子离子峰面积(y)对浓度(x)进行线性考察，目标化合物的线性范围、检出限及定量限结果表5。目标化合物的线性回归系数均大于0.99，表明方法的线性关系良好，可以进行精确定量。分别以3倍和10倍信噪比计算目标化合物的检出限和定量限，结果如表5。

以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。