一种分离纯化飞燕草素‑3‑O桑布双糖苷的方法及其降糖用途

摘要

本发明公开了一种分离纯化飞燕草素‑3‑O桑布双糖苷的方法及其降糖用途。仅通过大孔树脂及固相萃取即可从玫瑰茄中大量制备得到纯度为96％的飞燕草素‑3‑O‑桑布双糖苷，方法简单、快速，成本低廉，使之易于工业化生产。体外细胞实验表明，飞燕草素‑3‑O‑桑布双糖苷能够通过促进糖原合成来促进细胞对葡萄糖的消耗，从而起到降糖作用。因此，飞燕草素‑3‑O‑桑布双糖苷可作为降糖功能食品、保健品或降糖药物用于糖代谢异常相关疾病的防治，本发明能为综合开发利用我国玫瑰茄资源提供新的思路。

说明书

技术领域

本发明涉及天然产物的分离纯化及医药领域，特别涉及一种从天然来源的玫瑰茄中分离纯化飞燕草素-3-O-桑布双糖苷的方法,以及飞燕草素-3-O-桑布双糖苷在制备降糖功能食品、保健品或降糖药物中的应用。

背景技术

糖尿病是当前威胁人类健康最重要的非传染性疾病之一。糖尿病往往会并发其他代谢综合症，如高血脂、肾衰竭和炎症等，给人类带来巨大的肉体与精神上的痛苦。糖尿病分为两种：I型糖尿病(胰岛素依赖)和II型糖尿病(非胰岛素依赖)。根据国际糖尿病联盟IDF统计，2011年全球糖尿病患者人数高达3.7亿，其中II型糖尿病患者人数占总糖尿病患者人数的90％。到2030年，预计全球将有近5.5亿糖尿病患者。因此，对于研究糖尿病及其并发症的预防及控制策略刻不容缓。

玫瑰茄是锦葵科木槿属的一年生草本植物，广布于热带和亚热带地区，原产于西非、印度，目前在我国的广东、广西、福建、云南、台湾等地均有栽培。玫瑰茄的花萼肉质多汁，并可用于提取天然食用色素(花色苷)。现代研究表明玫瑰茄含有黄酮、原儿茶酸、花青素、异黄酮以及丰富的氨基酸、维生素、等活性物质，这些活性物质能够有效降低胆固醇和甘油三脂、抑制低密度脂蛋白的氧化等功能。因此玫瑰茄具有巨大的商业应用价值。

发明内容

申请人在研究中发现玫瑰茄中富含飞燕草素-3-O-桑布双糖苷，且飞燕草素-3-O-桑布双糖苷能够促进细胞对葡萄糖的消耗及促进细胞糖原的合成，具有一定的降糖活性。基于此，本发明提供了一种从玫瑰茄中大量分离制备高纯度的飞燕草素-3-O-桑布双糖苷的方法，并提供飞燕草素-3-O-桑布双糖苷在制备降糖功能食品、保健品或降糖药物中的应用。

本发明的技术方案如下：

本发明首先公开了一种分离纯化飞燕草素-3-O桑布双糖苷的方法，其步骤如下：

1)将干燥的玫瑰茄与酸性乙醇溶液按照料液比1g：4mL～1g：10mL混合后避光搅拌12-24h，过滤，滤液离心取上清液，上清液在40-45℃下真空旋转蒸发除去乙醇，得到花色苷粗提液Ⅰ；

2)用乙酸乙酯对花色苷粗提液Ⅰ进行萃取，静置分层，收集水相，重复萃取2-6次，收集并合并水相，40-45℃真空旋转蒸发除去残留的乙酸乙酯，得到花色苷粗提液Ⅱ；

3)将所述花色苷粗提液Ⅱ用大孔树脂纯化，纯化的步骤为：将乙醇浸泡12-48h后的大孔树脂装入层析柱中，用水洗至无醇味后，再用HCl溶液和NaOH溶液进行活化，然后将玫瑰茄花色苷粗提物Ⅱ以0.5-1BV/h的流速注入大孔树脂，使得吸附花色苷的树脂的体积为树脂总体积的1/2至4/5，之后使用去离子水以5-8BV/h的流速淋洗树脂，再分别使用3-5BV的5％和10％的乙醇溶液以2-3BV/h的流速洗脱花色苷，收集10％的乙醇溶液洗脱液，40-45℃下真空旋转蒸发除去乙醇，得到花色苷浸膏；所述5％和10％的乙醇溶液中含有体积比为1.5％的盐酸；

4)将上述浸膏用少量去离子水溶解得到样品液，使用固相萃取柱纯化，纯化的步骤为将固相萃取柱使用甲醇活化，然后使用6-10BV去离子水清洗柱体至无甲醇残留，将样品液注入固相萃取柱柱中，用6-10BV的含1.5％甲酸的去离子水冲洗柱体，然后使用5-8BV的5％乙腈水溶液洗脱，所述乙腈水溶液中含1.5％甲酸，收集乙腈洗脱液，40-45℃下真空旋转蒸发，得到飞燕草素-3-O-桑布双糖苷浸膏，用少量去离子水溶解，之后冷冻干燥得到飞燕草素-3-O-桑布双糖苷粉末。

优选的，所述步骤1)中的酸性乙醇溶液是体积百分比为50％-80％的乙醇溶液，乙醇溶液中含酸体积百分比为0.1％-2％，所述的酸为盐酸、甲酸或乙酸中的一种或多种。

优选的，所述步骤1)中的过滤采用三层纱布过滤，滤液离心的方法为转速4000r/min，离心时间为15min。

优选的，所述步骤2)中的每次萃取过程中，乙酸乙酯与花色苷粗提液Ⅰ的体积比为1：1。

优选的，所述大孔树脂为AB-8大孔树脂，比表面积为480-520m²/g，平均孔径为13-14nm，粒径范围在0.3-1.25mm。

优选的，所述步骤3)用HCl溶液和NaOH溶液进行活化的具体步骤为：用2-6倍BV的4％HCl溶液，以3-5BV/h的流速通过树脂层，并浸泡3小时，而后用去离子水以同样流速洗至水洗液呈中性，用2-6倍柱体积4％的NaOH溶液，以3-5BV/h的流速通过树脂层并浸泡3小时，而后用去离子水以同样流速洗至水洗液呈中性。

优选的，所述固相萃取柱为C18色谱柱。优选为C18Sep-Pak cartridge固相萃取柱(Waters Corporation)。

优选的，所述步骤4)样品液注入固相萃取柱的上样体积为柱体积的2/3。

本发明还公开了一种所述飞燕草素-3-O-桑布双糖苷粉末在制备降糖功能食品或降糖药物中的应用。

本发明所建立的方法，仅使用大孔树脂柱和固相萃取柱(C₁₈)即可从玫瑰茄中大量制备得到纯度为96％的飞燕草素-3-O-桑布双糖苷。相对其他液相色谱及逆流色谱方法，本发明中涉及方法更为简单、快速，成本低廉，易于工业化生产。

本发明所述方法制备得到的飞燕草素-3-O-桑布双糖苷展现出显著的葡萄糖消耗活性，即促进细胞对葡萄糖的消耗，从而起到降糖作用。

附图说明

图1为实施例2中纯化后的飞燕草素-3-O-桑布双糖苷高效液相色谱图；

图2为实施例2中飞燕草素-3-O-桑布双糖苷的化学结构式；

图3为实施例5中飞燕草素-3-O-桑布双糖苷分离纯化的高速逆流色谱图；

图4为实施例6中飞燕草素-3-O-桑布双糖苷(D3S)促进细胞对葡萄糖消耗作用；

图5为实施例7中飞燕草素-3-O-桑布双糖苷(D3S)促进细胞糖原合成作用。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步描述，以下列举的仅是本发明的具体实施例，但本发明的保护范围并不仅限于此。

实施例1玫瑰茄花色苷的制备

(1)将500g干燥的玫瑰茄与70％乙醇溶液(含1.5％(v/v)盐酸)按照料液比1g：8mL混合后搅拌24h(避光，37℃)，三层纱布过滤，滤液以4000r/min离心15min，取上清液，在45℃下真空旋转蒸发除去乙醇，得到花色苷粗提液Ⅰ；

(2)按花色苷粗提液Ⅰ：乙酸乙酯体积比为1：1的比例加入乙酸乙酯萃取，静置分层，收集水相，重复萃取4次，收集并合并水相，40-45℃真空旋转蒸发除去残留的乙酸乙酯，得到花色苷粗提液Ⅱ；

(3)将所述花色苷粗提液Ⅱ注入活化后的AB-8大孔树脂中，先用5BV的去离子水以2.5BV/h的流速冲洗树脂，再分别使用5％和10％的乙醇溶液(含1.5％(v/v)盐酸)以2.5BV/h的流速梯度各洗脱5BV，收集10％的乙醇洗脱液，45℃下真空旋转蒸发除去乙醇，得到花色苷浸膏；

实施例1中的活化方法为：将乙醇浸泡12-48h后的大孔树脂装入层析柱中，用水洗至无醇味后，用2-6倍BV的4％HCl溶液，以3-5BV/h的流速通过树脂层，并浸泡3小时，而后用去离子水以同样流速洗至水洗液呈中性，用2-6倍柱体积4％的NaOH溶液，以3-5BV/h的流速通过树脂层并浸泡3小时，而后用去离子水以同样流速洗至水洗液呈中性。

(4)将所述浸膏用少量的去离子水溶解后，注入C18柱(C18Sep-Pak cartridge，Waters)中，先用8BV含1.5％甲酸去离子水冲洗柱体，然后用8BV的5％乙腈水溶液(含1.5％甲酸)洗脱，收集乙腈洗脱液，45℃下真空旋转蒸发，得到玫瑰茄花色苷浸膏，用少量去离子水溶解，之后冷冻干燥得到玫瑰茄花色苷冻干粉。经计算，500g干燥的玫瑰茄经上述步骤纯化后可得到60mg花色苷冻干粉。

实施例2玫瑰茄花色苷冻干粉组分鉴别

将实施例1中的花色苷冻干粉，配成1mg/mL的溶液，通过0.45μm膜过滤后，使用高效液相色谱检测，检测方法如下：流动相为A相(1.5％甲酸水溶液)，B相(乙腈)，梯度洗脱：95％-40％A相洗脱30min，进样量10μL，温度30℃，流速0.8mL/min，检测波长520nm。同时用飞燕草素-3-O-桑布双糖苷标准品进行定性和定量分析，结果显示，经上述方法制备得到的花色苷冻干粉飞燕草素-3-O-桑布双糖苷，其纯度达到96.2％；图1为实施例2中纯化后的飞燕草素-3-O-桑布双糖苷高效液相色谱图；图2为实施例2中飞燕草素-3-O-桑布双糖苷的化学结构式。

实施例3玫瑰茄花色苷的制备

(1)将500g干燥的玫瑰茄与70％乙醇溶液(含1.5％(v/v)盐酸)按照料液比1g：10mL混合后搅拌24h(避光，37℃)，三层纱布过滤，滤液以4000r/min离心15min，取上清液，在45℃下真空旋转蒸发除去乙醇，得到花色苷粗提液Ⅰ；

(2)按花色苷粗提液Ⅰ：乙酸乙酯体积比为1：1的比例加入乙酸乙酯萃取，静置分层，收集水相，重复萃取6次，收集并合并水相，40-45℃真空旋转蒸发除去残留的乙酸乙酯，得到花色苷粗提液Ⅱ；

(3)将所述花色苷粗提液Ⅱ注入活化后的AB-8大孔树脂中，先用5BV的去离子水以2.5BV/h的流速冲洗树脂，再分别使用5％和10％的乙醇溶液(含1.5％(v/v)盐酸)以2.5BV/h的流速梯度各洗脱4BV，收集10％的乙醇洗脱液，45℃下真空旋转蒸发除去乙醇，得到花色苷浸膏；其中AB-8大孔树脂的活化方法与实施例1相同；

(4)将所述浸膏用少量的去离子水溶解后，注入C18柱(C18Sep-Pak cartridge，Waters)中，先用6BV含1.5％甲酸去离子水冲洗柱体，然后用5BV的5％乙腈水溶液(含1.5％甲酸)洗脱，收集乙腈洗脱液，45℃下真空旋转蒸发，得到玫瑰茄花色苷浸膏，用少量去离子水溶解，之后冷冻干燥得到玫瑰茄花色苷冻干粉。经计算，500g干燥的玫瑰茄经上述步骤纯化后可得到65mg的飞燕草素-3-O-桑布双糖苷，经实施例2的HPLC检测方法检测分析，其纯度达到95.7％。

实施例4玫瑰茄花色苷的制备

(1)将500g干燥的玫瑰茄与50％乙醇溶液(含1.5％(v/v)盐酸)按照料液比1g：6mL混合后搅拌24h(避光，37℃)，三层纱布过滤，滤液以4000r/min离心15min，取上清液，在45℃下真空旋转蒸发除去乙醇，得到花色苷粗提液Ⅰ；

(2)按花色苷粗提液Ⅰ：乙酸乙酯体积比为1：1的比例加入乙酸乙酯萃取，静置分层，收集水相，重复萃取2次，收集并合并水相，40-45℃真空旋转蒸发除去残留的乙酸乙酯，得到花色苷粗提液Ⅱ；

(3)将所述花色苷粗提液Ⅱ注入活化后的AB-8大孔树脂中，先用5BV的去离子水以2.5BV/h的流速冲洗树脂，再分别使用5％和10％的乙醇溶液(含1.5％(v/v)盐酸)以2.5BV/h的流速梯度各洗脱5BV，收集10％的乙醇洗脱液，45℃下真空旋转蒸发除去乙醇，得到花色苷浸膏；其中AB-8大孔树脂的活化方法与实施例1相同；

(4)将所述浸膏用少量的去离子水溶解后，注入C18柱(C18Sep-Pak cartridge，Waters)中，先用10BV含1.5％甲酸去离子水冲洗柱体，然后用8BV的5％乙腈水溶液(含1.5％甲酸)洗脱，收集乙腈洗脱液，45℃下真空旋转蒸发，得到玫瑰茄花色苷浸膏，用少量去离子水溶解，之后冷冻干燥得到玫瑰茄花色苷冻干粉。经计算，500g干燥的玫瑰茄经上述步骤纯化后可得到49mg的飞燕草素-3-O-桑布双糖苷，经实施例2的HPLC检测方法检测分析，其纯度达到97.3％。

对本发明实施例1、实施例3和实施例4中步骤(3)中5％乙醇溶液(含1.5％(v/v)盐酸)的洗脱液进行收集和分析，发现5％乙醇溶液洗脱液中几乎无飞燕草素-3-O桑布双糖苷。

实施例5玫瑰茄花色苷的制备-高速逆流色谱法

(1)将500g干燥的玫瑰茄与70％乙醇溶液(含1.5％(v/v)盐酸)按照料液比1g：8mL混合后搅拌24h(避光，37℃)，三层纱布过滤，滤液以4000r/min离心15min，取上清液，在45℃下真空旋转蒸发除去乙醇，得到花色苷粗提液Ⅰ；

(2)按花色苷粗提液Ⅰ：乙酸乙酯体积比为1：1的比例加入乙酸乙酯萃取，静置分层，收集水相，重复萃取4次，收集并合并水相，40-45℃真空旋转蒸发除去残留的乙酸乙酯，得到花色苷粗浸膏II；

(3)将所述花色苷粗提液Ⅱ注入活化后的AB-8大孔树脂中，先用5BV的去离子水以2.5BV/h的流速冲洗树脂，再分别使用5％和10％的乙醇溶液(含1.5％(v/v)盐酸)以2.5BV/h的流速梯度各洗脱5BV，收集10％的乙醇洗脱液，45℃下真空旋转蒸发除去乙醇，得到花色苷浸膏；其中AB-8大孔树脂的活化方法与实施例1相同；

(4)将所述的花色苷浸膏用高速逆流色谱法中的流动相溶解。高速逆流色谱法所采用的溶剂体系为，正丁醇：甲基叔丁基醚：乙腈：水＝2：2：1：5，含0.1％的三氟乙酸。流速为3mL/min，转速900r/min，检测波长为280nm，收集第二个主峰(28min-35min)，即飞燕草素-3-O-桑布双糖苷。45℃下真空旋转蒸发，得到花色苷浸膏，用少量去离子水溶解，之后冷冻干燥得到飞燕草素-3-O-桑布双糖苷冻干粉。经计算，500g的新鲜玫瑰茄经上述步骤纯化后可得到42mg的飞燕草素-3-O-桑布双糖苷，经实施例2的HPLC检测方法检测分析，其纯度达到96.8％。

图3为实施例5中飞燕草素-3-O-桑布双糖苷分离纯化的高速逆流色谱图；相比于实施例1，虽然高速逆流色谱也能制备得到的高纯度的飞燕草素-3-O-桑布双糖苷(收率和高纯度部分得益于本发明步骤(3)中AB-8大孔树脂的使用及酸性乙醇溶液的洗脱方法)，但其得率较低，。此外，高速逆流色谱仪器价格昂贵，需使用大量的有机试剂，后处理复杂，因此本发明提供的方法能更简便的制备飞燕草素-3-O-桑布双糖苷，使之易于工业化生产。

实施例6飞燕草素-3-O-桑布双糖苷促进葡萄糖消耗实验

将HepG2细胞接种于6孔板，每孔约2×105个细胞。细胞培养24h后，加药(飞燕草素-3-O-桑布双糖苷浓度为10μg/mL、20μg/mL和40μg/mL；阳性对照为二甲双胍，终浓度为1mM；)不加药为空白对照。孵育24h后，吸取部分培养基用葡萄糖试剂盒(葡萄糖氧化酶-过氧化酶法)测定葡萄糖含量。葡萄糖消耗量计算按照南京建成生物工程研究所的葡萄糖试剂盒(货号：F006)说明书提供的公式计算。如图4结果显示，20μg/mL和40μg/mL浓度下，飞燕草素-3-O-桑布双糖苷能够促进HepG2细胞的葡萄糖消耗量，与对照组相比有显著性提升。

实施例7飞燕草素-3-O-桑布双糖苷促进糖原合成实验

将HepG2细胞接种于6孔板，每孔约2×10⁵个细胞。细胞培养24h后，加药(飞燕草素-3-O-桑布双糖苷浓度为10μg/mL、20μg/mL和40μg/mL；阳性对照为二甲双胍，终浓度为1mM；)不加药为空白对照。孵育24h后，收集细胞并用PBS洗涤两次，用30％氢氧化钾匀浆后，将样品煮沸30分钟。随后加入1.5mL乙醇使糖原沉淀，然后以15000g离心5分钟。将所得沉淀溶解在0.5mL蒸馏水中，加入用浓硫酸稀释的0.2％蒽酮后煮沸20分钟。在620nm检测吸光值，使用外标法定量。糖原含量值采用葡萄糖当量表示。如图5实验结果表明，20μg/mL和40μg/mL浓度下，飞燕草素-3-O-桑布双糖苷能够促进HepG2细胞的糖原合成量，与对照组相比有显著性提升，并且促进效应强于阳性对照二甲双胍(1mM)。