盐酸去氢骆驼蓬碱联合氟康唑的抗白色念珠菌产品及其应用

摘要

本发明公开了盐酸去氢骆驼蓬碱联合氟康唑的抗真菌产品及其应用，属于医药技术领域，本发明以多种方法研究氟康唑和盐酸去氢骆驼蓬碱联用对耐药白色念珠菌的联合抗真菌作用。盐酸去氢骆驼蓬碱与氟康唑联合应用时的有效浓度配比：氟康唑：盐酸去氢骆驼蓬碱=1:32（μg/mL，对CA3）或1:16（μg/mL，对CA4），最低抑菌浓度分别为：8μg/mL与0.25μg/mL（对CA3）或0.5μg/mL（对CA4）。盐酸去氢骆驼蓬碱联合氟康唑时，可以增强氟康唑对耐药白色念珠菌的抗菌活性，可以产生协同抗真菌作用，并能够逆转耐药白色念珠菌对氟康唑的耐药性，为新药的开发及老药新用提供了研究方向。

说明书

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体涉及盐酸去氢骆驼蓬碱联合氟康唑的抗真菌产品及其

应用。

背景技术

白色念珠菌(Candida albicans，CA)为常见的条件致病性真菌，属于酵母科念珠菌属。在人体免疫功能正常的情况下极少出现系统性真菌感染，但在过去30年里，由于免疫抑制、器官移植、获得性免疫缺陷综合症等多种易感因素的出现，侵袭性念珠菌感染(invasive Candidia infection，ICI)率呈不断升高的态势，严重威胁患者的生命安全。尽管由各种非白色念珠菌(non-Candida albicans)引起的ICI有所上升，但当前白色念珠菌仍然是导致ICI最主要的病原菌。以国内一份2013年进行的多中心调查研究结果为例，由白色念珠菌引起的ICI占总ICI病人数的41.8％，患者接受治疗后病死率仍高达36.6％。另一份由中国医院侵袭性真菌检测网(CHIFNET)新发布的数据也显示，白色念珠菌占引起ICI病原菌总数的50.1％。

联合用药是抗真菌耐药联合用药研究包括两种抗真菌药联合及非抗真菌药与抗真菌药联合，由于目前临床可用的抗真菌药物品种有限，且大多价格昂贵、毒副作用明显，使得非抗真菌药物与抗真菌药物的联合应用研究备受关注。氟康唑(fluconazole，FLC)为第三代三唑类抗真菌药，自上市后凭借良好的临床疗效被广泛应用，但长期大剂量使用导致院内感染耐药菌分离率越来越高，世界上最大规模的抗真菌监测网络ARTEMIS项目(ARTEMIS program)2010年发布的数据显示，2001年至2007年期间从世界各地临床上分离出的超过12万株的白色念珠菌中发现氟康唑耐药率为1.4％。然而，在我国白色念珠菌的耐药率较世界平均水平高，尽管缺乏全国性大面积调查，但有资料显示，目前我国部分医院的白色念珠菌对氟康唑的耐药率已高达10.4％，可见院内感染中白色念珠菌耐药菌感染问题日益严峻，这就亟需开展及加强抗耐药白色念珠菌药物的研究。联合用药是抗真菌耐的有效途径，药联合用药研究主要包括两种抗真菌药联合及非抗真菌药与抗真菌药联合，由于目前临床可用的抗真菌药物品种有限，且大多价格昂贵、毒副作用明显，而寻找氟康唑的增敏剂对抗耐药白色念珠菌已成为国内外的研究热点。

骆驼蓬(Peganum harmala L.)是多年生草本蒺藜科骆驼蓬属植物，是我国维族、蒙古族常用药材，被列入卫生部药品标准维吾尔族分册。主要分布于我国西北地区，在中东、中亚、地中海沿岸、南美也有分布。骆驼蓬性平，味苦、辛，有毒，具有坚固筋脉、助阳暖阴、消散寒湿气等功能，主治筋脉软弱、骨关节痛、咳嗽痰多、偏瘫健忘、神昏头痛、月经不调等症。种子和全草均具有药用价值，其主要活性成分之一为去氢骆驼蓬碱(7-甲氧基-1-甲基-9H-吡啶并[3，4-b]吲哚，harmine，HAR)。去氢骆驼蓬碱又称肉叶云香碱，淡黄色针状晶体，分子量为212.25，分子式为C_l3H₁₂N₂₀，是一种三环β-咔啉类生物碱。去氢骆驼蓬碱在自然界中分布广泛，包括各种植物、海洋生物、昆虫等，最早于1874年被人们从骆驼蓬的种子中提取得到。它在骆驼蓬种子中的含量较高，结构稳定。目前的研究表明，盐酸去氢骆驼蓬碱具有抗细菌、抗疟原虫、抗真菌、抗氧化、抗肿瘤等一系列广泛的药理作用。在传统民间用药积累的经验基础上，针对药用植物中有效单体化合物的研究受到广泛重视。许晏等人采用试管法检测盐酸去氢骆驼蓬碱对金黄色葡萄球菌、乙型溶血性链球菌、绿脓杆菌、大肠杆菌、伤寒沙门菌、福氏志贺菌和白色念珠菌的最小杀菌浓度(MBC)及对金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、白色念珠菌的时间—杀菌曲线。试验结果:盐酸去氢骆驼蓬碱对6种细菌的MBC为125～250μg/mL,对白色念珠菌的MBC为800μg/mL。但是盐酸去氢骆驼蓬碱本身具有一定的毒性，使用量过高可引起中枢幻觉、震颤、心率减慢和心律紊乱，还会抑制呼吸，严重的甚至导致窒息死亡，这些都是限制其使用的重要因素。因此，降低盐酸去氢骆驼蓬碱的使用量在医学研究中具有重要的意义。对于盐酸去氢骆驼蓬碱和氟康唑的联用是否具有协同抗白色念珠菌的作用，目前尚无研究报道，具有广阔的研究前景。

发明内容

针对上述现有技术的不足，本发明的发明目的是为了克服目前真菌耐药和盐酸去氢骆驼蓬碱使用量较高产生的毒副作用较大的问题，提供一种盐酸去氢骆驼蓬碱联合氟康唑的抗真菌产品及其应用。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一个方面，提供一种盐酸去氢骆驼蓬碱联合氟康唑在制备抗白色念珠菌产品中的应用。

优选的，所述产品为药物。

优选的，所述白色念珠菌为耐药白色念珠菌。

所述联合应用时盐酸去氢骆驼蓬碱的最低抑菌浓度为：8μg/mL。

所述联合应用时氟康唑的最低抑菌浓度为：0.25μg/mL或0.5μg/mL。

优选的，所述盐酸去氢骆驼蓬碱与氟康唑联合应用时的有效浓度配比为：氟康唑：盐酸去氢骆驼蓬碱＝1:32或1:16。

本发明的第二个方面，提供一种抗真菌药物组合物，该药物组合物是以盐酸去氢骆驼蓬碱和氟康唑为主要活性成分。

优选的，所述盐酸去氢骆驼蓬碱与氟康唑的有效浓度配比为氟康唑：盐酸去氢骆驼蓬碱＝1:32或1:16。

优选的，所述盐酸去氢骆驼蓬碱的最低浓度为：8μg/mL。

优选的，所述氟康唑的最低浓度为：0.25μg/mL或0.5μg/mL。

结果表明，大于等于8μg/mL的盐酸去氢骆驼蓬碱与大于等于0.25μg/mL或0.5μg/mL的氟康唑联合应用具有协同抗耐药白色念珠菌作用。

进一步优选的，联合应用时，盐酸去氢骆驼蓬碱与氟康唑的浓度分别为：8～128μg/mL、0.25～64μg/mL。

本发明与现有技术相比，具有以下优点与效果：

1.本发明表明，盐酸去氢骆驼蓬碱与氟康唑联合应用时，可以增强氟康唑对耐药白色念珠菌的抗菌活性，可以产生协同抗真菌作用，并能够逆转耐药白色念珠菌对氟康唑的耐药性，为新药的开发及老药新用提供了研究方向。对氟康唑耐药的白色念珠菌，联合用药可使其最低抑菌浓度明显降低，8μg/mL的盐酸去氢骆驼蓬碱与0.25μg/mL(对耐药白色念珠菌CA3)或0.5μg/mL(对耐药白色念珠菌CA4)的氟康唑合用可以杀灭80％以上的真菌，浓度再增大，效果更强。

2.盐酸去氢骆驼蓬碱的药理作用广泛，其对氟康唑抗真菌的增效作用，可扩大其应用范围，并且降低氟康唑的最低有效抑菌浓度，降低抗真菌药物氟康唑的用药量，从而降低药物的不良反应的发生，克服临床上真菌耐药问题。

3.本发明表明，氟康唑可明显增强盐酸去氢骆驼蓬碱抗白色念珠菌作用，并且降低了盐酸去氢骆驼蓬碱的最低有效浓度，减少了盐酸去氢骆驼蓬碱抗真菌药物的用药量，从而降低了盐酸去氢骆驼蓬碱较强的毒副作用。

4.真菌耐药机制及其复杂，尚有许多机制仍不是很清楚，如能将盐酸去氢骆驼蓬碱对氟康唑的抗真菌增敏机制研究透彻，必定能为克服真菌耐药问题提供新的思路。

附图说明

构成本发明的一部分说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1：盐酸去氢骆驼蓬碱与氟康唑联用对抗耐药白色念珠菌CA3作用结果；

图2：盐酸去氢骆驼蓬碱与氟康唑联用对抗耐药白色念珠菌CA4作用结果；

其中：X轴代表氟康唑的浓度，Y轴代表盐酸去氢骆驼蓬碱的浓度，Z轴代表的是各个药物组合下的ΔE值，高于或低于平面(ΔE＝0)的值分别表示协同或拮抗作用，平面周围的值表示无关作用，图右侧的色彩编码条中，越靠近上端说明协同作用越强。

图3：盐酸去氢骆驼蓬碱与氟康唑联用对抗耐药白色念珠菌菌丝作用结果；

其中：对照组(无药物，A-C)，氟康唑组(1μg/mL，D-F)，盐酸去氢骆驼蓬碱组(32μg/mL，G-I)，药物联用组(氟康唑1μg/mL+盐酸去氢骆驼蓬碱32μg/mL，J-L)。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。

正如背景技术所介绍的，长期大剂量使用氟康唑可导致白色念珠菌的耐药性不断增高，另外，长期大剂量使用盐酸去氢骆驼蓬碱对机体也会产生较大毒性，限制了盐酸去氢骆驼蓬碱的应用，为了解决如上的技术问题，本发明提出了一种盐酸去氢骆驼蓬碱联合氟康唑在制备抗耐药白色念珠菌产品中的应用。

抗菌药物联合在体外或动物体内可表现为“无关”、“相加”、“协同”和“拮抗”四种作用，对于不同类的药物联用，由于药物的作用机制和作用方式不同，很有可能会增加毒性或因诱导灭活酶的产生或竞争同一靶位而出现拮抗作用；而且，同一类药物不一定都具有相同的作用，如头孢菌素类，一代头孢主要抗革兰氏阳性菌，三、四代头孢菌素主要抗革兰氏阴性菌，并且只有部分的三代头孢品种与四代头孢才具有抗铜绿假单胞菌的作用，因此，对于抗菌药物的联用而言，其联合使用后的抗菌效果具有极大的不可预测性。

为克服白色念珠菌对氟康唑的耐药性，本发明人经过大量的试验研究发现了盐酸去氢骆驼蓬碱和氟康唑联合给药在抗耐药白色念珠菌中的意外改进的效果，当盐酸去氢骆驼蓬碱单用时，其最低抑菌浓度为64或128μg/mL，当小于该值时，对白色念珠菌的作用很弱，当只有在高于64或128μg/mL浓度下才会对白色念珠菌产生抑菌作用；而将盐酸去氢骆驼蓬碱与氟康唑联用时，呈现出强烈协同抗耐药白色念珠菌的作用，并能够逆转耐药白色念珠菌对氟康唑的耐药性，并且联合应用时，盐酸去氢骆驼蓬碱的浓度较低，降低了单用较高剂量盐酸去氢骆驼蓬碱时产生的毒副作用。

两种药物联用的浓度会影响两者的相互作用，为了使得盐酸去氢骆驼蓬碱与氟康唑联合应用时具有一定的协同增效作用，在本发明优选的实施例中，所述盐酸去氢骆驼蓬碱与氟康唑联合应用时的有效浓度配比为：氟康唑：盐酸去氢骆驼蓬碱＝1:32或1:16。

其中，所述应用时盐酸去氢骆驼蓬碱的最低抑菌浓度为：8μg/mL；所述应用时氟康唑的最低抑菌浓度为：0.25μg/mL或0.5μg/mL。

在本发明优选的实施例中，联合应用时，所选药物浓度为：大于等于8μg/mL盐酸去氢骆驼蓬碱与大于等于0.25μg/mL或0.5μg/mL氟康唑。

进一步优选的，联合应用时，盐酸去氢骆驼蓬碱与氟康唑的浓度分别为：8～128μg/mL、0.25～64μg/mL。

在本发明其中的一个优选实施例中，还提供了一种抗真菌药物组合物，该药物组合物是以盐酸去氢骆驼蓬碱和氟康唑为主要活性成分。

其中，所述盐酸去氢骆驼蓬碱与氟康唑联合应用时的有效浓度配比为：氟康唑：盐酸去氢骆驼蓬碱＝1:32或1:16；所述应用时盐酸去氢骆驼蓬碱的最低浓度为：8μg/mL；所述应用时氟康唑的最低浓度为：0.25μg/mL或0.5μg/mL。

在本发明又一个优选实施例中，还提供一种抗真菌的制剂，由盐酸去氢骆驼蓬碱和氟康唑以及药学上可接受的辅料组成。在本发明提供的制剂中，药学上可接受的辅料为药物制剂中的常规辅料(比如：崩解剂、润滑剂、黏合剂等；优选为甘油、丁二醇等中的一种或多种)，为本领域技术人员认为可行的常规辅料均在本发明的保护范围之内，本发明在此不做限定。

本发明发现，盐酸去氢骆驼蓬碱在体外可与抗真菌药物氟康唑发挥协同抗真菌作用。

本发明采用耐药白色念珠菌细胞进行研究，利用棋盘肉汤微量稀释法，分别评价不同联合用药组合的联合抗真菌作用。具体内容如下：

A：盐酸去氢骆驼蓬碱与氟康唑联合抗耐药白色念珠菌作用：采用棋盘肉汤微量稀释法测定联合用药时最低有效浓度，以FICI法选择最佳药物组合浓度及评价药物联合用药的作用。此外，为更直观地表现联合用药对耐药白色念珠菌作用的程度，将联合药敏测定数据用生长百分数差值模型(ΔE)进行了进一步分析。

B：盐酸去氢骆驼蓬碱被发现有广泛的药理作用，如有抗细菌、抗疟原虫、抗真菌、抗氧化、抗肿瘤等，能在抗耐药真菌感染方面发挥作用意义重大。本研究表明，盐酸去氢骆驼蓬碱联合应用氟康唑可产生协同抗耐药白色念珠菌作用，可扩大其应用范围，具有良好的应用前景。

总之，本发明包含盐酸去氢骆驼蓬碱与氟康唑联合应用产生协同抗耐药白色念珠菌的作用。上述发现为临床联合用药作为治疗耐药真菌感染的方案提供了思路。

盐酸去氢骆驼蓬碱除了单用具有抗白色念珠菌浮游细胞的活性外，发明人在研究中还偶然发现它能与氟康唑联用产生明显的协同抗真菌作用。盐酸去氢骆驼蓬碱与氟康唑联合应用在体外具有协同抗耐药白色念珠菌作用，且效果明显。低剂量的盐酸去氢骆驼蓬碱(8μg/mL)可使氟康唑对耐药白色念珠菌的MIC值从512μg/mL以上降至0.25μg/mL(对CA3)或0.5μg/mL(对CA4)。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。

实施例1盐酸去氢骆驼蓬碱与氟康唑联合抗真菌作用测定

1.材料

1.1药品与试剂

氟康唑(Fluconazole，FLC)，大连美仑生物技术有限公司；

盐酸去氢骆驼蓬碱(Ambroxol hydrochloride，HAR)，大连美仑生物技术有限公司；

科玛嘉念珠菌显色培养基，郑州博赛生物工程有限公司；

TTC-沙保罗培养基，青岛高科技园海博生物技术有限公司；

酵母膏，北京奥博星生物技术有限责任公司；

蛋白胨，北京奥博星生物技术有限责任公司；

葡萄糖，国药集团化学试剂有限公司；

琼脂粉，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；

PBS磷酸盐缓冲剂，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；

氢氧化钠，国营山东单县有机化工厂，批号940420；

磷酸二氢钾，上海新宝精细化工厂，批号200602132。

RPMI 1640原料药粉，美国GIBCO公司；

3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；

甲萘醌(Menadione)，美国Sigma公司；

XTT(二甲氧唑黄)，南京旋光科技有限公司；

乳酸林格氏液(复方氯化钠溶液)，山东鲁抗辰欣药业有限公司；

丙酮，上海振兴化工一厂，批号200209510；

XTT-甲萘醌溶液的配制：取XTT粉末0.0500g，溶解于100mL已高压灭菌的林格氏液配成0.5mg/mL的溶液，用0.22μm滤膜滤过灭；加入10μL的10mmol/L的甲萘醌丙酮溶液(取甲萘醌0.0860g溶解于5mL丙酮)，使其终浓度为1μmol/L，摇匀，4℃避光保存。

药物溶液：氟康唑用无菌蒸馏水溶解，配成2560μg/mL的储备液，过滤分装；盐酸去氢骆驼蓬碱用无菌蒸馏水溶解，配成4096μg/mL的储备液，过滤分装。所有药液于-20℃冰箱保存，备用。

PBS缓冲液：称取12gPBS磷酸盐缓冲剂至1L容量瓶，加入蒸馏水搅拌使其完全溶解，再加蒸馏水至刻度线，分装到试剂瓶后在121℃下高压灭菌30min，冷却后放4℃冰箱保存。

酵母浸膏－蛋白胨－葡萄糖琼脂培养基：葡萄糖10g，蛋白胨10g，酵母膏5g，琼脂粉10g，加水溶解在500mL锥形瓶中，充分搅拌均匀后121℃灭菌30min，冷却后4℃冰箱保存备用。

RPMI 1640液体培养液：取RPMI 1640(含L-谷氨酰胺，不含碳酸氢钠)粉末2.08g，加入10％葡萄糖溶液40ml(含糖终浓度2％)及MOPS粉6.906g，加蒸馏水至约为200mL，混合均匀后在22℃用1mol/L的NaOH溶液调pH约为7.0±0.1，临用前用0.22μm混合纤维膜过滤灭菌。

1.2仪器

1.3实验菌株

质控菌株：白色念珠菌ATCC10231，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心；

实验菌株：济南市儿童医院临床分离的白色念珠菌；

菌株鉴定：实验用菌株在科玛嘉念珠菌显色培养基35℃下培养48小时，菌落呈绿色或翠绿色的所有菌株再经山东省疾病预防控制中心微生物研究室以标准微生物学方法鉴定为白色念珠菌。

菌液制备：-20℃下保存的白色念珠菌室温下解冻，接种到TTC-沙保罗琼脂培养基上，35℃培养24h，取发育良好的单一菌落再次接种，35℃培养24h，以保证菌株处于生长期。选取若干单个较大菌落，PBS配制成菌悬液，经涡旋器振荡均匀后以中国细菌浊度标准管比浊，调整样品管与标准管浊度一致，此时白色念珠菌的菌浓度约为1×10⁶CFU/mL，系列稀释即得到工作菌液，并以活菌计数进行浓度验证。

2.内容与方法

2.1盐酸去氢骆驼蓬碱与氟康唑联合抗耐药白色念珠菌体外作用测定

2.1.1盐酸去氢骆驼蓬碱与氟康唑联合抗耐药白色念珠菌作用测定

根据CLSI M27-A3方案的棋盘法，以RPMI-1640液体培养基稀释药液使其成为4倍工作浓度，筛选盐酸去氢骆驼蓬碱与氟康唑联合应用的浓度范围，即盐酸去氢骆驼蓬碱终浓度为128～2μg/mL，氟康唑的终浓度为64～0.125μg/mL。按浓度从低到高的顺序分别吸取氟康唑药液50μL，分别加入96孔平板的第2～11列，按浓度从低到高的顺序吸取盐酸去氢骆驼蓬碱药液50μL，分别加入各96孔平板的第G～A行，除第12列外各孔再分别加100μL菌液，其余不足200μL的孔用RPMI-1640培养液补足。其中H1为生长对照，只含菌液不含药物，第12列为空白对照，只含RPMI-1640液体培养基。根据CLSI M27-A3方案的要求，将加药的96孔平板置35℃恒温培养箱中培养24h后，分别用XTT负载2h后以酶标仪测定OD并记录结果。所有实验重复三次。

2.1.2评价方法与结果判定

2.1.2.1 Loewe additivity理论

Loewe additivity(LA)理论的基本思想认为药物不可能和它本身发生相互作用，因此将药物单用或联用产生相同药效的浓度(等效位点)进行比较。其分析方法分数抑菌浓度指数法(fractional inhibitory concentration index，FICI)，表述如下：

ΣFIC＝FIC_A+FIC_B＝C_A/MIC_A+C_B/MIC_B

MIC_A和MIC_B分别是药物A和B单用时的最小抑菌浓度，C_A与C_B为两药联用时达到相同药效时各自的浓度。FICI>4为拮抗作用，FICI在0.5与4之间为相加或无关作用，FICI≤0.5定义为协同作用。

2.1.2.2 Bliss independence理论

Bliss independence(BI)理论是以ΔE(药物各浓度下真菌生长百分率的理论值与实验值之差)为数据分析模型。ΔE模型表述如下：

ΔE＝E_A×E_B-E_comb

其中，E_A为A药单用时真菌的生长率，E_B为B药单用时真菌的生长率，E_comb为A药和B药联用时真菌的生长率。结果分析时，通过ΣSYN与ΣANT，即96孔板中所有正值ΔE和负值ΔE的加和为指标来判断两种药物的相互作用。当ΔE的绝对值<100％时，表示为弱协同或弱拮抗作用；当ΔE的绝对值介于100％与200％之间时，表示为中等协同或拮抗作用，当ΔE的绝对值大于200％时，表示为为强协同或拮抗作用。

2.2盐酸去氢骆驼蓬碱与氟康唑联合抗耐药白色念珠菌菌丝作用测定

将本试验所用临床分离的菌株CA3在YPD琼脂培养基上已经至少传代过两次，使用无菌的RPMI1640液体培养基将耐药白色念珠菌CA3菌液配成1×10⁵CFU/mL(使用中国细菌浊度标准管)，按以下分组向96孔板的不同的孔中加入药物和上述菌液：

1号孔：200μL菌液；

2号孔：100μL菌液+50μL 4μg/mL氟康唑+50μLRPMI1640液体培养基；

3号孔：100μL菌液+50μL128μg/mL盐酸去氢骆驼蓬碱+50μLRPMI1640液体培养基；

4号孔：100μL菌液+50μL128μg/mL盐酸去氢骆驼蓬碱+50μL 4μg/mL氟康唑。

将无菌96孔板放至恒温震荡培养箱(75rpm，35℃)中恒温培养4h后，用无菌PBS洗去盖玻片上未粘附的细胞，放至荧光显微镜下观察各组孔菌丝生长状况。所有试验重复三次。

2.1.3结果

2.1.3.1盐酸去氢骆驼蓬碱与氟康唑联合的最低有效抑菌浓度

各孔中真菌生长百分数的计算方法为：

真菌生长百分数＝(各孔OD值-空白对照孔OD值)/生长对照孔OD值

按上述公式计算平板中各孔真菌生长百分数，取能够抑制真菌生长80％的最低联用药物浓度为判读终点。

盐酸去氢骆驼蓬碱与氟康唑联合抗真菌作用时，对耐药白色念珠菌呈现强协同作用，但对白色念珠菌的敏感株和非白色念珠菌来说无协同作用。现把耐药株CA3和CA4在加药96孔板中的生长百分数实验结果列表如下(表1-3)所示。

表1.用棋盘表示盐酸去氢骆驼蓬碱与氟康唑的联合用药抗耐药白色念珠菌CA3生长百分率(以FICI法换算的药物最佳作用组合用斜体标出)。

表2.用棋盘表示盐酸去氢骆驼蓬碱与氟康唑的联合用药抗耐药白色念珠菌CA4生长百分率(以FICI法换算的药物最佳作用组合用斜体标出)。

2.1.3.2 FICI模型和ΔE模型评价盐酸去氢骆驼蓬碱与氟康唑联用的协同作用

FICI模型的评价指标为FICI值，FICI≤0.5则定义为协同作用。由表3可以看出，各组合的FICI值均小于0.5，表现为较强的协同作用。

ΔE模型的评价指标为ΣSYN与ΣANT，由表3可以看出，各组∑SYN和∑ANT的总和均远远大于200％，表现为强烈的协同作用，盐酸去氢骆驼蓬碱与氟康唑联用对抗CA3和CA4的三维图如图1和图2。从图中可以直观的看出不同药物组合均具有强烈的协同作用。图片与上述数值分析具有一致性。

表3.以FICI模型和ΔE模型评盐酸盐酸去氢骆驼蓬碱和氟康唑联合用药抗真菌作用

注解：MIC：最低抑菌浓度；MIC_A：药物单用时氟康唑的最低抑菌浓度；C_A：药物联用时氟康唑的最低抑菌浓度；MIC_B：药物单用时盐酸去氢骆驼蓬碱的最低抑菌浓度；C_B：药物联用时盐酸去氢骆驼蓬碱的最低抑菌浓度；FICI：分数抑菌浓度指数；ΣSYN：96孔板中所有正值ΔE之和；ΣANT：96孔板中所有负值ΔE之和。

2.1.3.3盐酸去氢骆驼蓬碱与氟康唑联用对菌丝的作用

本试验用荧光显微镜观察药物单用和联用后耐药白色念珠菌菌丝的生长状况。显微镜下可以清楚地观察到各组孔中的菌丝。如图3所示，对照组、氟康唑单用组和盐酸去氢骆驼蓬碱单用组均显示有大量菌丝的存在，但是在药物联用组中发现：与其他三组相比，细胞数量明显减少，且基本无菌丝生成。由此我们可以断定：氟康唑与盐酸去氢骆驼蓬碱联用可抑制耐药白色念珠菌菌丝的生长，从而导致白色念珠菌的耐药性和毒力都明显降低。

上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。