乙肝肝脏疾病T淋巴细胞免疫状态应用性评估模型的构建方法

摘要

本发明提供了一种乙肝肝脏疾病T淋巴细胞免疫状态应用性评估模型的构建方法，其包括：(1)对患者外周血进行T细胞活化因子和抑制性/衰竭分子通过流式细胞仪进行检测，获得每个检测标本上述各个T细胞因子的水平；(2)收集各个病例的人口统计学、病毒学、肝功能、肝硬度数值资料，将临床指标与T细胞免疫评价指标进行相关性分析，找出有密切相关性的临床指标；(3)利用不同的临床指标建立多个评分ROC曲线模型，比较不同模型ROC曲线下面积、灵敏度及特异性，选出最优ROC曲线；(4)根据最佳ROC曲线，获得不同的免疫临床评分方程，进一步优化出最佳的免疫临床评分方程，用以评估T细胞整体免疫状态。

说明书

技术领域

本发明属于生物医学领域，具体涉及一种乙肝肝脏疾病T淋巴细胞免疫状态应用性评估模型及其构建方法。

技术背景

T淋巴细胞(T lymphocyte)简称T细胞，是由来源于骨髓的淋巴干细胞，在胸腺中分化、发育成熟后，通过淋巴和血液循环而分布到全身的免疫器官和组织中发挥免疫功能，其生物学功能包括：直接杀伤靶细胞、辅助或抑制B细胞产生抗体、对特异性抗原和促有丝分裂原起应答反应、产生细胞因子；因此，T细胞是身体中为抵御疾病感染、肿瘤而形成的英勇斗士。T细胞产生的免疫应答是细胞免疫，细胞免疫的效应形式主要有两种：与靶细胞特异性结合，破坏靶细胞膜，直接杀伤靶细胞；另一种是释放淋巴因子，使细胞免疫效应扩大和增强，在许多情况下，免疫细胞因子的水平决定了T细胞免疫功能。

按细胞表面分化抗原(CD)的不同，T细胞可分为两大类：CD4+T细胞和CD8+T细胞，两者均通过分泌或表达细胞因子而发挥T细胞功能，所分泌或表达的细胞因子大致有两类：(1)T细胞活化性因子(炎症因子)，主要有白介素2(IL-2)、γ-干扰素(IFN-γ)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)；(2)T细胞共抑制性分子，主要有：程序性死亡分子(PD-1)、CTLA-4、LAG3、TIM3、2B4。

肝脏是人体最大的免疫器官，肝脏疾病，如乙型肝炎的核心理论认为，T细胞免疫动力学决定乙肝病毒(HBV)感染的转归-被清除还是诱发免疫耐受致肝细胞受损：当足量HBV特异性T细胞募集进入受感染的肝细胞，可启动特异性细胞毒作用和分泌细胞因子，诱发强大的T细胞功能，主动攻击体内病毒并最终彻底清除。相反，若特异性T细胞功能不全，例如分泌T细胞活化因子不足，但表达大量的T细胞抑制性因子，有助于病毒的存活与复制。类似的，T细胞在肝脏肿瘤中广泛分布和充分浸润，肿瘤特异性的T细胞及其活化性细胞因子能在体内“游走巡查”，找到肿瘤进行攻击，一定程度上能控制疾病进展；然而，但T细胞功能不全，主要表现为其分泌的有效T细胞因子不足而表达大量的T细胞衰竭因子，最终导致病情恶化。因此，T细胞功能状态对疾病的预后具有重要意义。

尽管经历30多年疫苗接种和20多年抗病毒药物临床使用，目前全球仍有2.4亿慢性乙肝病毒感染；中国超过0.9亿，含现症感染0.2亿和携带者0.7亿。目前治疗有干扰素与核苷类似物(NAs)，虽然能降低患者血清病毒量和改善症状，长期疗效不理想：干扰素治疗达到乙肝病毒E抗原(HBeAg)血清转换效率低、依赖自身免疫、有限人群使用、副作用大、禁忌症多和价格贵；NAs容易产生耐药、无论治疗长短，停药后都有复发，需要长期或终身用药；仍有较高肝硬化肝癌发生风险。

尽管全球癌症的总体死亡有明显下降，肝癌的发生和死亡却逐年上升；平均生存时间低于1年，5年生存率低于5％。乙肝感染者发生肝癌机率是非乙肝病毒感染者的100倍，目前肝癌的治疗局限于手术(切除和肝移植)和局部疗法(主要有射频、微波、冷冻、无水酒精注射、肝动脉化疗栓塞等)，但80％患者诊断时已失去根治手术机会，最新药物Sorafenib只可延长生存期2-3月。

因此，迫切需要全方位深入探讨乙肝肝病的发病进展机制，免疫功能的评估至关重要，尤其以T细胞功能免疫评估为突破点，可为新的治疗策略提供有力的支撑。

随着生命组学的发展，免疫系统的相关技术不断进步，从70年代开始的免疫球蛋白、补体等测定，能粗略和间接地估计机体的免疫状态，已经逐步被淋巴细胞亚群、细胞因子的检测替代，代表性的检测手段包括：1)基于DNA检测的生物学方法，如PCR、RNA印迹、原位杂交等技术，这类方法能够对单一免疫细胞因子进行检测，并研究其调控通路，不宜作为临床复杂病例的判别；2)生物活性检测方法，如ELISA、ELISPOT等，这类方法只对单一细胞或者单一免疫细胞分泌因子进行检测，而非对某一群免疫细胞的平均细胞因子水平进行检测，同样，也不利于作为临床复杂病例的判别；3)流式细胞技术和液态芯片检测：目前较为精准的检测技术，可对多个细胞因子进行检测，临床医生根据不同细胞因子水平对患者的免疫状态进行预估；然而，带有较强的主观性、相当昂贵、操作繁琐，无法广泛应用。

发明内容

本发明的目的是针对以上要解决的技术问题，提供一种简单、方便的乙肝肝脏疾病T淋巴细胞免疫状态应用性评估模型的构建方法。

为了实现以上发明目的，本发明提供了一种乙肝肝脏疾病T淋巴细胞免疫状态应用性评估模型的构建方法，其包括：

(1)对乙肝患者外周血进行T细胞活化因子和抑制性/衰竭分子通过流式细胞仪进行检测，获得每个检测标本上述各个T细胞因子的水平；

(2)收集各个病例的人口统计学、病毒学、肝功能、肝硬度数值资料，将临床指标与T细胞免疫评价指标进行相关性分析，找出有密切相关性的临床指标；

(3)利用不同的临床指标建立多个评分ROC曲线模型，比较不同模型ROC曲线下面积、灵敏度及特异性，选出最优ROC曲线；

(4)根据最佳ROC曲线，获得不同的免疫临床评分方程，进一步优化出最佳的免疫临床评分方程，用以评估T细胞整体免疫状态。

优选地，检测T细胞因子的水平的方法为采用通用的抗体标记单个细胞的流式细胞检测技术。

优选地，本发明的方法以CD4+、CD8+T亚群三种抗病毒因子IL-2、IFN-γ、TNF-α及五种共抑制分子PD1、TIM3、CTLA4、LAG3、2B4作为整体性T细胞免疫评价指标。

优选地，所述最佳的免疫临床评分方程为

＝-1.577+0.181Age+0.088BMI-0.373Fibroscan value+1.363Sex-0.250Log HBV DNA-0.188qHBsAg+(1.026Genotype C+1.084Genotype N-0.408Genotype O)cutoff:0.334。

优选地，根据以下临床指标赋值表的分数，代入上述方程，即可获得评价总体T细胞功能的水平。

与现有技术相比，本发明具有以下优势：

1、以CD4+、CD8+T亚群三种抗病毒因子IL-2、IFN-γ、TNF-α及五种共抑制分子PD1、TIM3、CTLA4、LAG3、2B4作为整体性T细胞免疫评价指标，通过抗体标记单细胞流式细胞检测技术获得研究队列中的各个病例所有的代表性T细胞活化因子和衰竭分子；利用简单易获得的临床病毒学指标建立了评估T细胞免疫状态的临床评分模型，避免了繁琐、昂贵的实验室检测；

2、本发明构建的模型具有较好的敏感度与特异度，可以为肝病如乙肝抗病毒治疗的启动、密切监测病情提供理论参考；

3、应用性队列结果提示本发明的免疫临床评分Immuno-Clinic Score(ICS)模型可作为抗病毒疗效早期评价指标；

4、建立了以临床常用指标为基础的应用型T细胞免疫临床评分模型，简便、实用，具有较好的敏感度、特异度及准确性，并在纵向治疗的患者中进行了验证，提示本ICS模型可以为临床诊疗提供参考。

附图说明

图1示出了临床病毒学肝功能指标与T细胞因子和衰竭因子的相关性。

图2示出了模型的ROC曲线。

图3示出了慢性乙肝抗病毒治疗不同观察点患者ICS分值及ICS-high患者比例的变化。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图，对本发明的技术方案作进一步的说明，但本发明不限于以下实施例。如未特别指出，本发明所涉及的检测技术，如流式细胞术，为本领域已知的技术。

鉴于目前免疫功能检测手段的不足，本发明的发明思路是：通过对肝病患者T细胞多种共抑制分子及活化因子进行检测，经统计分析，重新评价各自然病程时期患者的T细胞整体免疫状态，并转化建立了能够评估T细胞整体免疫状态的临床应用评分模型。本发明旨在利用此简便、实用性模型，个体化评价患者T细胞整体免疫状态，为临床病情评估、免疫治疗及抗病毒治疗等提供参考，推动肝部的诊疗朝精准化更进一步。

本发明的方法如下：

(一)发明方法：

1、研究队列：纳入829例肝病患者(乙型肝炎300例、肝癌300例、其他肝病229例)，诊断标准参照2016年美国肝病研究指南。

验证队列：600例肝病患者

纵向队列：纳入了526例进行抗乙肝病毒治疗的患者。

2、对以上研究队列中所有患者外周血进行T细胞活化因子和抑制性/衰竭分子通过流式细胞仪进行检测，获得每个检测标本上述各个T细胞因子的水平。检测方法采用通用的抗体标记单个细胞的流式细胞检测技术。

3、收集研究队列中各个病例的人口统计学、病毒学、肝功能、肝硬度数值等资料，将临床指标与T细胞免疫评价指标进行相关性分析，找出有密切相关性的临床指标。

4、利用不同的临床指标建立多个评分ROC曲线模型，比较不同模型ROC曲线下面积(AUC)、灵敏度及特异性，选出最优ROC模型。

5、根据最佳ROC曲线，获得不同的免疫临床评分方程，进一步优化出最佳的ICS方程，用以评估T细胞整体免疫状态。

6、模型应用：评价纵向抗病毒病例T细胞免疫状态变化。

在本发明的方法中，所涉及到的统计学分析及思路如下。

本发明的方法中，相关的计量资料以均数±标准差或四分位数间距表示。连续性变量组间比较采用Mann-Whitney或Kruskal-Wallis检验。分类变量采用χ2检验。变量间的相关性分析使用Spearman相关性分析。

本发明的方法的统计分析思路为：

第一步：比较不同疾病状态中T细胞因子的水平差异。第二步；采用Spearman相关性分析找出与免疫指标有相关性的临床指标，以免疫聚类结果为基础，使用R语言R3.3.2MASS package线性判别分析建立临床评分模型。第三步：采用Stepwise选出效果最佳模型，并使用受试者工作特征曲线(ROC)评估模型效果，以约登指数制定区分免疫高低的cutoff值，并评价模型的敏感度、特异度。第四步：计算抗病毒治疗病例不同时间点的免疫评分数值，并探索与抗病毒疗效之间的关系。

所有的数据分析均使用R语言3.2.2。p<0.05具有统计学意义。

(二)发明相关曲线及模型：

1.ROC曲线：利用T细胞免疫指标和临床指标的相关性，建立并优化灵敏度和特异性较强的AUC曲线。

2.免疫临床评分模型(Immuno-Clinic Score(ICS))

＝-1.577+0.181Age+0.088BMI-0.373Fibroscan value+1.363Sex-0.250Log HBV DNA-0.188qHBsAg+(1.026Genotype C+1.084Genotype N-0.408Genotype O)cutoff:0.334临床指标赋值表:根据以下赋值表的分数，代入上述方程，即可获得评价总体T细胞功能的水平。

如以下表1和表2所示，为不同疾病状态的慢性乙型肝炎患者T细胞因子频数分布比较。其中，表1为CD8+T细胞分泌的活化性细胞因子和表达的衰竭分子水平及其在各个病例组中的差异；表2为CD8+T细胞分泌的活化性细胞因子和表达的衰竭分子水平及其在各个病例组中的差异。虚线框浅灰色：均数差值>0；加粗黑线框浅灰色：均数差值<0；P<0.05。IA表示免疫活动期，IC表示病原携带期，IT表示免疫耐受期，GZ为灰色地带区。

表1：CD4+T细胞分泌的活化性细胞因子和表达的衰竭分子水平及其在各个病例组中的差异

表2：CD8+T细胞分泌的活化性细胞因子和表达的衰竭分子水平及其在各个病例组中的差异

图1表明了临床病毒学肝功能指标与T细胞因子和衰竭因子的相关性。其中，深色为具有显著的相关性，同时颜色越深相关性越强；无色表示无显著的相关性。

图2为最佳评分模型(+Sex)AUC的ROC曲线，其灵敏度、特异度分别为0.801(95％CI 0.703-0.900)、0.727及9，722；区分ICS-high与ICS-low的cut-off值为0.442。

以下为ICS方程的优化：(A)四个评分模型的ROC曲线AUC分别为：0.744(95％CI 0.634-0.854)、0.755(95％CI 0.641-0.868)、0.801(95％CI 0.703-0.900)、0.802(95％CI 0.701-0.903)，其中ROC1，ROC2的AUC较小，且小于ROC3及ROC4(P<0.05)。ROC3与ROC4的灵敏度一致，均为72.7％，虽然ROC4的特异度更高，但两个模型特异度、AUC之间的差异无统计学差异[特异度：72.2％vs 77.8％，P＝0.65；AUC：0.801(95％CI 0.703-0.900),0.802(95％CI 0.701-0.903)，P＝0.755]，且在模型4中，ALT的系数为负数(-0.2134)，提示ALT越高，免疫评分越低，与实际意义不相符。

最终选择ICS模型ROC3(如下所示)作为最终评分公式：0.801(95％CI 0.703-0.900)，特异度72.2％，灵敏度72.7％。鉴别ICS-high与ICS-low的cutoff值0.442。

免疫临床评分(Immuno-Clinic score(ICS))方程：

＝-1.577+0.181Age+0.088BMI-0.373Fibroscan value+1.363Sex-0.250Log HBV DNA-0.188qHBsAg+(1.026Genotype C+1.084Genotype N-0.408Genotype O)cutoff:0.334

图3示出了慢性乙肝抗病毒治疗不同观察点患者ICS分值及ICS-high患者比例的变化(0w、4w、24w、48w)。其中，Immune_H表示T细胞功能活跃；Immune_L表示T细胞功能低下。由图3可见，本方法能够准确地提供细胞功能水平的数值。

应用实施例

实例一：对10例慢性乙肝患者进行常规临床生化检测，了解其T细胞免疫功能：

该10例病例的部分临床指标如下：

病例/指标AgeSexBMIGenotypeHBsAgFibrosisHBVDNA126M21.4B4653758.3237M18.3B457247345F35.2B472536417M30.8C213655526M21.4B36263644F19.4C46541733M24.2C2876359.3812M24.3C1874568.5935M23.2C261731029M22.7B28495

(2)利用以上本发明的评估模型，该10例病例的T细胞功能检测值如下：

病例12345678910ICS-0.1810.1-0.6561.3710.3220.721.0260.4721.5290.072

(3)根据ICS模型的cutoff值为0.334，ICS>＝0.334表示T细胞功能正常或活跃(Immune-High，H)；ICS<0.334表示T细胞功能低下(Immune-Low，L)，以此判断上述病例的T细胞功能状态如下：

实例二：一位慢性乙肝患者，男性，45岁，目前启动抗病毒治疗，按照常规诊疗指南，从开始用药(0周)到一年(72周)内需要进行病毒学和生化指标的序列观察，常规监控的时间节点是：0周、4周、12周、24周、48周。

(1)临床指标如下：

(2)根据本发明的T细胞功能评价模型，在不同时间点的ICS值，即T细胞免疫功能检测结果如下：

治疗时间点0w4w12w24w48w72wICS评分-0.3730.0650.3150.3150.3150.315

(3)根据ICS模型的cutoff值为0.334，ICS>＝0.334表示T细胞功能正常或活跃(Immune-High，H)；ICS<0.334表示T细胞功能低下(Immune-Low，L)，以此判断T细胞功能状态如下：

因此，从以上实例可以证实，本发明的T细胞应用性评估模型不仅可以判断单次的瞬时的T细胞整体的免疫功能状态；更进一步地，可以监控在非治疗或者治疗过程中T细胞整体免疫功能的变化趋势；由于本发明建基于先进的流式细胞技术和流式分选单个细胞的检测技术，数值真实可靠；再融合生化、病毒学指标，利用生物统计大数据的计算方法，进行模型的构建，方便、实用、准确。

值得注意的是，本发明的方法旨在构建用于检测和评估T淋巴细胞免疫状态的模型，直接目的仅仅在于获得中间结果，该中间结果与疾病的诊断或健康状况并无直接必然联系。对于乙肝疾病的治疗和诊断，需要综合评价众多参数，包括并不限于乙肝病毒表面抗原、表面抗体、e抗原、e抗体、核心抗体、前S1抗原水平等多项血清学应答以及生化学应答，而仅仅经由本发明所涉及的模型所获知的T淋巴细胞免疫状态并不能够直接检测和/或诊断乙肝疾病。