橡胶树胚性愈伤组织的低温保存培养基及其低温保存方法

摘要

本发明提供了一种橡胶树胚性愈伤组织的低温保存培养基及其低温方法，属于组织培养技术领域。所述低温保存培养基通过添加外源抗氧化剂L‑谷氨酰胺、抗氧化型维生素VC以及外源激素水杨酸；激发内源抗氧化酶谷胱甘肽还原酶GR作用以维持细胞内高比例的GSH/GSSG以及GR参与植物体内清除ROS关键途径抗坏血酸谷胱甘肽循环AsA‑GSH，辅以其他抗氧化酶，协同有效清除低温保存下的胚性愈伤组织内多余的ROS，以提高胚性愈伤组织抗低温胁迫能力。经低温保存培养基保存的胚性愈伤组织的愈伤组织存活率与对照25±2℃暗培养条件下的胚性愈伤组织相比无显著差异，且FDA荧光检测表明经低温保存的胚性愈伤组织细胞活力维持更强。

说明书

技术领域

本发明属于组织培养技术领域，具体涉及橡胶树胚性愈伤组织的低温保存培养基及其低温保存方法和恢复生长方法。

背景技术

巴西橡胶树(Hevea brasiliensis Müll.Arg.)隶属于大戟科(Euphorbiaceae)橡胶树属(Hevea)，是多年生异花授粉乔木。橡胶树是天然橡胶的主要来源，而我国天然橡胶自给率仅为18％。我国橡胶树研究者要齐心协力，为橡胶树抗性、高产的相关基因功能研究提供技术体系，以期尽早获得一批具有重要应用价值和自主知识产权的基因。同时，通过基因工程技术培育高产、材优、多抗的重大转基因橡胶树新品种，提高我国橡胶树转基因研究和产业化水平，为我国橡胶产业的可持续健康发展提供强有力的科技支撑。

建立高效、稳定的橡胶树再生体系是提高橡胶树组培苗生产效率以及建立高效、稳定的橡胶树遗传转化体系的基础。我国橡胶树再生体系从已有的报道来看，以花药为外植体诱导愈伤组织，愈伤组织以体细胞胚状体发生途径形成再生植株的体系，是当前我国橡胶树生产组培苗和建立遗传转化体系研究的主要技术手段。目前，我国的橡胶树花药再生植株体系已建立，但总的来说植株再生率低是影响我国橡胶树无性系组培苗生产、利用遗传转化技术进行橡胶树功能基因研究和利用基因工程技术改良橡胶树品种的瓶颈。究其主要原因是以花药为外植体进行愈伤组织诱导，后期体细胞胚发生所必需的胚性愈伤组织的诱导率低、繁殖数量较少以及组织细胞随着继代次数的增多而丧失胚性，大大限制了再生植株的培育。由于日常橡胶树组培再生和遗传转化工作的繁琐和耗时，诱导得到的胚性愈伤组织往往不能同时兼顾继代增殖、分化培养和侵染转化等工作，使得宝贵的胚性愈伤组织会因为人为原因不能及时继代而造成褐化死亡或因为继代多次造成胚性丧失，以至生产和研究材料匮乏，严重影响无性系组培苗生产和遗传转化技术研究。寻求橡胶树胚性愈伤组织的中短期保存方法，进行中短期保存，以便根据实际情况的需要，快速复苏胚性愈伤组织以用于后续研发。

植物愈伤组织目前主要采用离体保存技术有常温继代保存、缓慢生长保存和超低温保存。在植物组织和细胞长期保存过程中，如采取常温继代保存，则组织材料一般需要4～6周继代一次，人力和物力消耗大。超低温保存理论上具有长期性和稳定性的优点，但由于超低温保存程序比较复杂，冻存和解冻程序操作不当，都会使细胞受伤害，失去恢复生长和再生的能力，植株再生率也是制约包括橡胶树在内的大多数植物超低温保存的瓶颈；此外，保存过程需使用昂贵的程控降温仪、超低温冰箱等高端仪器设备，使得超低温保存方法在保存橡胶树胚性愈伤组织中使用不够普及，操作困难，技术有待进一步的摸索和完善。缓慢生长保存即通过调节和改变某种或某几种培养条件，限制保存材料的生长，使细胞生长降至最小限度但不死亡，从而延长继代间隔时间，减少操作和节省劳力的保存方法，该保存方法最大优点能使中短期保存材料维持缓慢而不断地生长，后期恢复生长容易，但是大多数热带和亚热带植物缺乏对低温的适应能力，当环境温度低于10℃时细胞就会受到伤害，严重影响植物组织细胞的正常生长、发育甚至造成死亡。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种橡胶树胚性愈伤组织的低温保存培养基及其低温保存方法，胚性愈伤组织低温保存状态良好。

本发明的目的还在于提供一种经低温保存的橡胶树胚性愈伤组织的恢复生长方法，使胚性愈伤组织恢复较强的活力。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种橡胶树胚性愈伤组织的低温保存培养基，以改良MS为基本培养基，包括以下含量组分：L-谷氨酰胺250～350mg/L、维生素C 0.3～0.8mg/L、水杨酸18～23mg/L、水解酪蛋白280～320mg/L、椰子汁体积浓度8％～12％、蔗糖65～75g/L、活性炭质量浓度0.08％～0.12％和植物凝胶2.0～2.5g/L；

所述改良MS培养基以水为溶剂，包括硝酸铵1100mg/L、硝酸钾1267mg/L、二水氯化钙800mg/L、七水硫酸镁247mg/L、磷酸二氢钾226mg/L、碘化钾0.83mg/L、硼酸9mg/L、四水硫酸锰22.3mg/L、七水硫酸锌8.6mg/L、二水钼酸钠0.25mg/L、五水硫酸铜0.025mg/L、六水氯化钴0.025mg/L、乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L、七水硫酸亚铁27.8mg/L、肌醇100mg/L、甘氨酸1mg/L、盐酸硫胺素VB₁5.0mg/L、盐酸吡哆醇VB₆1.0mg/L、烟酸1mg/L和生物素VH>

优选的，以改良MS为基本培养基，包括以下含量组分：L-谷氨酰胺300mg/L、维生素C 0.5mg/L、水杨酸20mg/L、水解酪蛋白300mg/L、体积浓度为10％椰子汁、蔗糖70g/L、活性炭质量浓度为0.1％和植物凝胶2.3g/L。

优选的，所述低温保存培养基的pH值为5.8。

本发明提供了一种橡胶树胚性愈伤组织的低温保存方法，包括以下步骤：将胚性愈伤组织接种到所述低温保存培养基上，在3～8℃条件下保存。

优选的，所述保存的温度为4～6℃。

本发明提供了一种低温保存的橡胶树胚性愈伤组织恢复生长方法，包括以下步骤：将低温保存的胚性愈伤组织和子叶形体细胞胚状体组织同步接种在活化培养基上共同培养。

优选的，所述活化培养基为以改良MS为基本培养基，包括以下含量组分：L-谷氨酰胺250～350mg/L、维生素C 0.3～0.8mg/L、水解酪蛋白280～320mg/L、椰子汁体积浓度8％～12％、蔗糖65～75g/L、活性炭质量浓度0.08％～0.12％和植物凝胶2.0～2.5g/L；

所述改良MS培养基以水为溶剂，包括硝酸铵1100mg/L、硝酸钾1267mg/L、二水氯化钙800mg/L、七水硫酸镁247mg/L、磷酸二氢钾226mg/L、碘化钾0.83mg/L、硼酸9mg/L、四水硫酸锰22.3mg/L、七水硫酸锌8.6mg/L、二水钼酸钠0.25mg/L、五水硫酸铜0.025mg/L、六水氯化钴0.025mg/L、乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L、七水硫酸亚铁27.8mg/L、肌醇100mg/L、甘氨酸1mg/L、盐酸硫胺素VB₁5.0mg/L、盐酸吡哆醇VB₆1.0mg/L、烟酸1mg/L和生物素VH>

所述活化培养基的pH值为5.6～6.0。

优选的，所述胚性愈伤组织和子叶形体细胞胚状体组织体积比为1：0.8～1.2。

优选的，所述子叶形体细胞胚状体为生长发育正常且单片子叶宽为5～7mm的体细胞胚状体。

优选的，所述共同培养的条件独立为：白天温度为23～27℃，晚上温度为21～25℃；环境湿度为78～82％。

本发明提供了一种橡胶树胚性愈伤组织的低温保存培养基。正常生长条件下，植物细胞中的活性氧ROS的产生维持在较低的水平和动态平衡，但在环境胁迫如低温条件下可引起ROS的增加。本发明通过利用植物体内存在抗氧化系统及时清除过量的活性氧，以维持体内正常的代谢。本发明主要通过外源添加外源性抗氧化剂谷氨酰胺和抗氧化型维生素VC，激发内源谷胱甘肽还原酶(GR)的作用，催化氧化型谷胱甘肽GSSG生成还原型谷胱甘肽GSH，维持细胞内高的GSH/GSSG，同时GR参与植物体内清除ROS关键途径抗坏血酸－谷胱甘肽循环途径，再辅以其他抗氧化酶类，共同协调有效清除活性氧自由基，GR还对抗氧化物抗坏血酸VC的再生有重要作用，从而提高低温保存下的胚性愈伤组织的抗氧化功效，增强细胞活力。另外，在低温条件下，通过外源添加水杨酸(SA)，除了能促进内源GSH、可溶性蛋白等含量的增加，提高胚性愈伤组织中抗氧化酶系统功能增强，还能适当抑制愈伤组织的生长，从而提高胚性愈伤组织抗低温胁迫能力，保持一定的细胞活性。

本发明提供的一种橡胶树胚性愈伤组织的低温保存方法，采用上述方案提供的低温保存培养基进行培养25d，低温保存的胚性愈伤组织中谷胱甘肽还原酶显著增加4～5倍，加强抗氧化能力，并且其他抗氧化酶无显著降低，整个抗氧化系统没有受到破坏，维持动态平衡，共同协调有效清除活性氧，胚性愈伤组织低温保存状态良好。经低温保存的胚性愈伤组织的愈伤组织存活率与对照25±2℃暗培养条件下的胚性愈伤组织的愈伤组织存活率无显著差异，但显著高于以正常愈伤组织培养基增殖的胚性愈伤组织在低温保存下的存活率；经FDA荧光法检测低温保存胚性愈伤组织的细胞活力，其荧光强度比对照25±2℃暗培养的胚性愈伤组织的荧光强度还略强，组织块荧光分布也更均匀，这说明经低温保存的胚性愈伤组织细胞活力维持更强。

本发明提供了一种低温保存的橡胶树胚性愈伤组织恢复生长方法。由于橡胶树子叶形体细胞胚状体中含有丰富的内源激素如水杨酸、茉莉酸、玉米素Zt和iPR等活性物质，故利用正常子叶形体细胞胚组织作为低温保存胚性愈伤组织恢复生长的看护细胞组织，向培养细胞或组织提供了促进低温保存胚性愈伤组织生长的物质，同时提供一种适宜密度效应，并且能吸收细胞或组织培养过程中产生的有毒物质，从而加快低温保存胚性愈伤组织的恢复生长和增殖速度。实验表明，经分化培养基上诱导培养40d后统计，低温保存过的胚性愈伤组织比对照(25±2℃培养)胚性愈伤组织更鲜黄，但两者间的体细胞胚诱导率无显著差异，均为80％，继续培养至60d后再统计，低温保存过的胚性愈伤组织体细胞胚生成数(个/每克鲜重)与最后形成的正常子叶形胚状体与对照胚性愈伤组织的无显著差异，甚至比对照胚性愈伤组织的略高，说明低温保存对胚性愈伤组织后期的体细胞胚诱导和正常子叶形体细胞胚形成无抑制作用，反而略有促进。同时将低温保存的胚性愈伤组织分化诱导出的子叶形体细胞胚状体进行胚萌发培养形成再生植株，与对照(25±2℃培养)胚性愈伤组织形成的再生植株数量相比，低温保存过的显著增加了47.2％。说明低温保存过的胚性愈伤组织植株再生率更高，可能正常的25±2℃培养条件下，胚性愈伤组织的继代如以25d一个周期的话，愈伤组织的胚性维持成效显著降低，直接影响到后期正常植株的再生效率，可能以15～20d继代一次为宜，这将加剧继代工作量。

附图说明

图1为实施例1中橡胶树雄花、雄蕊及其单粒花药的形态图；其中图1-A为橡胶树雄花的光学照片；图1-B为橡胶树剥去花萼的雄蕊的光学照片；图1-C为剥出的单粒花药的形态图；图1-D为单核靠边期的花粉粒的形态学结构；

图2为实施例1中花药类胚性愈伤组织的诱导和甄选；图2-A为诱导20d的单粒花药脱分化愈伤组织；图2-B为诱导45d质地坚脆、表面具乳黄色球形颗粒的胚性愈伤组织；

图3为实施例2中所用胚性愈伤组织以及低温保存25d的生长对比情况；图3-A为所用胚性愈伤组织的形态；图3-B为对照25±2℃培养的胚性愈伤组织与低温保存的胚性愈伤组织的生长对比；

图4为实施例3中低温保存25d的胚性愈伤组织存活率(％)；

图5为实施例4中FDA荧光法检测低温保存胚性愈伤组织的细胞活性；图5-A为25±2℃暗培养的胚性愈伤组织的荧光强度；图5-B为低温保存胚性愈伤组织的荧光强度；

图6为实施例5中低温保存25d的胚性愈伤组织SOD酶活性；

图7为实施例5中低温保存25d的胚性愈伤组织POD酶活性；

图8为实施例5中低温保存25d的胚性愈伤组织CAT酶活性；

图9为实施例5中低温保存25d抗坏血酸过氧化物酶APX酶活性；

图10为实施例5中低温保存25d谷胱甘肽还原酶GR酶活性；

图11为实施例6中低温保存胚性愈伤组织在25±2℃恢复和增殖生长情况；图11-A为低温保存的胚性愈伤组织形态；图11-B为25±2℃暗培养条件下生长的对照胚性愈伤组织的形态；图11-C为低温保存过的胚性愈伤形态；

图12为实施例7中低温保存25d的胚性愈伤组织的分化诱导和植株再生；图12-A、图12-B为对照25±2℃培养的胚性愈伤组织体细胞胚分化；图12-C对照25±2℃培养的胚性愈伤组织再生植株；图12-D、图12-E为低温4℃保存的胚性愈伤组织体细胞胚分化；图12-F为低温4℃保存的胚性愈伤组织再生植株。

具体实施方式

本发明提供了一种橡胶树胚性愈伤组织的低温保存培养基，以改良MS培养基为基本培养基，包括以下含量组分：L-谷氨酰胺250～350mg/L、维生素C 0.3～0.8mg/L、水杨酸18～23mg/L、水解酪蛋白280～320mg/L、椰子汁体积浓度8％～12％、蔗糖65～75g/L、质量浓度0.08％～0.12％活性炭和植物凝胶2.0～2.5g/L；

所述改良MS培养基以水为溶剂，包括硝酸铵1100mg/L、硝酸钾1267mg/L、二水氯化钙800mg/L、七水硫酸镁247mg/L、磷酸二氢钾226mg/L、碘化钾0.83mg/L、硼酸9mg/L、四水硫酸锰22.3mg/L、七水硫酸锌8.6mg/L、二水钼酸钠0.25mg/L、五水硫酸铜0.025mg/L、六水氯化钴0.025mg/L、乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L、七水硫酸亚铁27.8mg/L、肌醇100mg/L、甘氨酸1mg/L、盐酸硫胺素VB₁5.0mg/L、盐酸吡哆醇VB₆1.0mg/L、烟酸1mg/L和生物素VH>

所述低温保存培养基的pH值为5.6～6.0。

本发明中，所述L-谷氨酰胺(Gln)在改良MS培养基的质量浓度优选为300mg/L。外源L-谷氨酰胺的加入，有助于提高机体中内源还原型谷胱甘肽GHS水平，维持细胞内高的GSH/GSSG比例以抵抗氧化能力，激发胚性愈伤组织低温保存期间的优势抗氧化酶谷胱甘肽还原酶(GR)，参与抗坏血酸－谷胱甘肽循环途径，有效清除活性氧。本发明对L-谷氨酰胺的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的L-谷氨酰胺的来源即可。本发明实施例中，所述L-谷氨酰胺购自sigma公司。

本发明中，所述维生素C在改良MS培养基的质量浓度优选为0.5mg/L。维生素C提高抗坏血酸－谷胱甘肽循环途径效率，有效清除活性氧。本发明对维生素C的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的维生素C的来源即可。本发明实施例中，所述维生素C购自天津市科密欧化学试剂有限公司。

本发明中，所述水杨酸(SA)在改良MS培养基的质量浓度优选为20mg/L。水杨酸是激活植物过敏反应(HR)和系统获得性抗性(SAR)的内源信号分子。在低温环境下，外源SA可以降低胚性愈伤组织中膜脂过氧化物丙二醛含量、增加可溶性蛋白和还原型谷胱甘肽GSH等抗氧化物质的含量等，通过增强抗氧化酶系统来提高多种植物的抗低温胁迫的能力。本发明对水杨酸的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的水杨酸的来源即可。本发明实施例中，所述水杨酸购自sigma公司。

本发明中，所述水解酪蛋白在改良MS培养基的质量浓度优选为300mg/L。水解酪蛋白为维持胚性愈伤组织的胚性，保证后期细胞的正常生长和分裂，促进体细胞胚状体的诱导分化。本发明对水解酪蛋白的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的水解酪蛋白的来源即可。本发明实施例中，所述水解酪蛋白购自sigma公司。

本发明中，所述椰子汁在改良MS培养基的体积浓度优选为10％。所述椰子汁优选为香水椰子汁，所述香水椰子汁优选10～12个月成熟果期，经过椰肉榨汁得到。所述椰子汁含有丰富的蛋白质以及其他养育早期胚胎的营养成份，利于促进体细胞胚状体的分化。本发明对椰子汁的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的椰子汁的来源即可。本发明实施例中，所述椰子汁购自百果园公司。

本发明中，所述蔗糖在改良MS培养基的质量浓度优选为70g/L。蔗糖作为碳源物质为植物细胞提供能量来源，同时能调节培养基内的渗透压。本发明对蔗糖的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的蔗糖的来源即可。本发明实施例中，所述蔗糖购自天津科密欧化学试剂有限公司。

本发明中，所述活性炭在改良MS培养基的质量浓度优选为0.1％。活性炭的作用是添加到低温保存培养基中，能及时吸附新切片的子叶形体细胞胚状体组织所分泌的乳汁或其他物质、吸附低温条件下组织缓慢分泌的酚、醌类等毒性物质，从而有效地防止细胞老化、褐变。除了吸附组织本身释放的抑制性物质外,活性炭对在高压灭菌时培养基成分降解产生的抑制性物质也产生吸附作用，维持清新微环境。本发明对活性炭的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的活性炭的来源即可。本发明实施例中，所述活性炭购自天津科密欧化学试剂有限公司。

本发明中，所述植物凝胶在改良MS培养基的质量浓度优选为2.3g/L。植物凝胶用以固定培养基的作用，还会适度增加培养基的胁迫力，促进体细胞胚状体的分化。本发明对植物凝胶的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的植物凝胶的来源即可。本发明实施例中，所述植物凝胶购自sigma公司。

本发明中，所述低温保存培养基的pH值优选为5.8。

本发明中，所述改良MS培养基的来源没有特特限制，采用本领域技术人员所熟知的来源即可。

本发明所述橡胶树胚性愈伤组织的低温保存培养基的制备方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的培养基制备方法即可。胚性愈伤组织的形态特征优选为质地坚脆、表面具乳黄色球形颗粒。

本发明提供的一种橡胶树胚性愈伤组织的低温保存方法，包括以下步骤：将胚性愈伤组织接种到上述技术方案所述的低温保存培养基上，在3～8℃条件下保存。

本发明中，所述橡胶树胚性愈伤组织的种类没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的橡胶树胚性愈伤组织的种类即可。本发明实施例中，所述橡胶树胚性愈伤组织的种类为热研7-33-97胚性愈伤组织。所述橡胶树胚性愈伤组织的诱导方法也没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的胚性愈伤组织的诱导方案即可。

本发明中，所述接种的方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的接种方案即可。所述接种质量优选为2％～5％，更优选为3％～4％。

本发明中，所述保存的温度优选为4～6℃，更优选为5℃。

本发明中，所述保存的时间优选为15d～60d。

本发明提供了一种低温保存的橡胶树胚性愈伤组织恢复生长方法，包括以下步骤：将低温保存的胚性愈伤组织和子叶形体细胞胚状体组织同步接种在活化培养基上共同培养。

本发明中，所述活化培养基优选为以改良MS为基本培养基，包括以下含量组分：L-谷氨酰胺250～350mg/L、维生素C 0.3～0.8mg/L、水解酪蛋白280～320mg/L、椰子汁体积浓度8％～12％、蔗糖65～75g/L、质量浓度0.08％～0.12％活性炭和植物凝胶2.0～2.5g/L；更优选为L-谷氨酰胺300mg/L、维生素C 0.5mg/L、水解酪蛋白300mg/L、椰子汁体积浓度10％、蔗糖70g/L、质量浓度0.1％活性炭和植物凝胶2.3g/L。

本发明中，所述改良MS培养基以水为溶剂，包括硝酸铵1100mg/L、硝酸钾1267mg/L、二水氯化钙800mg/L、七水硫酸镁247mg/L、磷酸二氢钾226mg/L、碘化钾0.83mg/L、硼酸9mg/L、四水硫酸锰22.3mg/L、七水硫酸锌8.6mg/L、二水钼酸钠0.25mg/L、五水硫酸铜0.025mg/L、六水氯化钴0.025mg/L、乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L、七水硫酸亚铁27.8mg/L、肌醇100mg/L、甘氨酸1mg/L、盐酸硫胺素VB₁5.0mg/L、盐酸吡哆醇VB₆1.0mg/L、烟酸1mg/L和生物素VH>

所述活化培养基的pH值优选为5.6～6.0，更优选为5.8。

本发明中，所述活化培养基的制备方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的培养基的制备方法即可。

本发明中，所述接种的方法没有特殊限制采用本领域技术人员熟知的接种方法即可。所述胚性愈伤组织和子叶形体细胞胚状体组织接种时优选相邻1～2mm间距接种。所述胚性愈伤组织和子叶形体细胞胚状体接种体积比优选为1：0.8～1.2，更优选为1:1。所述子叶形胚状体组织的体积优选为6～9mm²。更优选为7～8mm²。胚性愈伤组织质量优选为0.08～0.15g，更优选为0.1g。所述子叶形体细胞胚状体为生长发育正常且单片子叶宽优选为5～7mm的体细胞胚状体。所述子叶形体细胞胚状体优选切割成子叶形细胞胚状体块再接种。所述切割的子叶形细胞胚状体块大小优选为6～9mm²。

本发明中，所述共同培养的条件独立优选为：培养白天温度优选为23～27℃，更优选为25℃；晚上温度优选为21～25℃，更优选为23℃；环境湿度优选为78～82％，更优选为80％。所述共同培养优选为暗培养。所述暗培养的方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的暗培养方法即可。

下面结合实施例对本发明提供的一种橡胶树胚性愈伤组织的低温保存培养基及其低温方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

材料为巴西橡胶树(Hevea brasiliensis Müll.Arg.)品种热研7-33-97，橡胶花序采自中国热带农业科学院实验农场。用0.1％的淡肥皂水浸没花序(图1-A)10min，流水冲洗干净。用灭菌小剪刀剪取纵径约2.81～3.20mm，横径约1.37～1.43mm，纵横比2.15～2.18，未开、健康的橡胶树雄花(图1-B)，花粉粒发育时期多数为单核靠边期(图1-D)。用灭菌纱布包好，70～75％酒精表面消毒40s，0.1％HgCl₂浸泡消毒12min，再用无菌水冲洗6次，然后在解剖镜下剥出单粒花药接种到花药愈伤组织诱导培养基上，每皿30粒花药。

表1橡胶树热研7-33-97品种花粉发育时期与花蕾的外部形态对应关系

注：同列数据后不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

2)单粒花药初代培养

在解剖镜下将单粒花药剥离花丝，接种到花药愈伤组织初代诱导培养基上，暗培养，温度白天25±2℃，晚上23±2℃，湿度80％。初代诱导培养基以改良MS为基本培养基，添加2,4-D 1.0mg/L、6-BA 0.2mg/L、椰汁5％、蔗糖70g/L和植物凝胶2.2g/L，pH5.8。培养20d后转接至胚性愈伤组织诱导培养基上。改良MS基本培养为:KH₂PO₄340mg/L、CaCl₂·2H₂O800mg/L，硼酸9mg/L，其他与MS基本培养基成份一样。

3)胚性愈伤组织诱导培养

花药在初代愈伤组织诱导培养基上生长20d后，将诱导出的花药脱分化愈伤组织及时转接至胚性愈伤组织诱导培养基上,暗培养，温度白天25±2℃，晚上23±2℃，湿度80％。胚性愈伤组织诱导培养基以改良MS为基本培养基，添加2,4-D 1.0mg/L、6-BA 0.2mg/L、Zt(玉米素)0.5mg/L、TDZ(噻二唑苯基脲)0.05mg/L、椰汁5％、蔗糖70g/L和植物凝胶2.2g/L，pH5.8；所述改良MS培养基以水为溶剂，包括硝酸铵1650mg/L、硝酸钾1900mg/L、二水氯化钙800mg/L、七水硫酸镁370mg/L、磷酸二氢钾340mg/L、碘化钾0.83mg/L、硼酸9mg/L、四水硫酸锰22.3mg/L、七水硫酸锌8.6mg/L、二水钼酸钠0.25mg/L、五水硫酸铜0.025mg/L、六水氯化钴0.025mg/L、乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L、七水硫酸亚铁27.8mg/L、肌醇100mg/L、甘氨酸1mg/L、盐酸硫胺素VB15.0mg/L、盐酸吡哆醇VB61.0mg/L、烟酸1mg/L和生物素VH0.05mg/L。培养20～30d后，愈伤组织陆续有类胚性愈伤组织的细胞形态发生(图2-A)借助解剖镜可用解剖针和镊子挑出质地紧脆、表面具乳黄色球形颗粒的胚性愈伤组织(图2-B)。

4)胚性愈伤组织增殖培养

借助解剖镜，从正在分化的胚性愈伤组织中挑出尚未分化的质地紧实、表面具有球形颗粒的胚性愈伤组织，以及生长发育正常的子叶形体细胞胚状体(单片子叶约2～3mm宽)一个，一起接种到增殖培养基上，以正常子叶形体细胞胚状体看护哺育，使胚性愈伤组织有效快速增殖；所述增殖培养基是以改良MS培养基为基本培养基，包括以下含量组分：水解酪蛋白300mg/L、体积浓度为10％椰汁、蔗糖70g/L、质量浓度为0.1％活性炭和植物凝胶2.3g/L；改良MS培养基为所述改良MS培养基以水为溶剂，包括硝酸铵1100mg/L、硝酸钾1267mg/L、二水氯化钙800mg/L、七水硫酸镁247mg/L、磷酸二氢钾226mg/L，碘化钾0.83mg/L，硼酸9mg/L，四水硫酸锰22.3mg/L、七水硫酸锌8.6mg/L、二水钼酸钠0.25mg/L、五水硫酸铜0.025mg/L、六水氯化钴0.025mg/L、乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L、七水硫酸亚铁27.8mg/L、肌醇100mg/L、甘氨酸1mg/L、盐酸硫胺素VB₁5.0mg/L、盐酸吡哆醇VB₆1.0mg/L、烟酸1mg/L和生物素VH>

实施例2

将实施例1得到的增殖后的胚性愈伤组织(图3-A)，接种至低温保存培养基中，所述低温保存培养基为以改良MS为基本培养基，包括以下含量组分：L-谷氨酰胺250～350mg/L、维生素C 0.3～0.8mg/L、水杨酸18～23mg/L、水解酪蛋白280～320mg/L、椰子汁体积浓度8％～12％、蔗糖65～75g/L、质量浓度0.08％～0.12％活性炭和植物凝胶2.0～2.5g/L；所述改良MS培养基以水为溶剂，包括硝酸铵1100mg/L、硝酸钾1267mg/L、二水氯化钙800mg/L、七水硫酸镁247mg/L、磷酸二氢钾226mg/L、碘化钾0.83mg/L、硼酸9mg/L、四水硫酸锰22.3mg/L、七水硫酸锌8.6mg/L、二水钼酸钠0.25mg/L、五水硫酸铜0.025mg/L、六水氯化钴0.025mg/L、乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L、七水硫酸亚铁27.8mg/L、肌醇100mg/L、甘氨酸1mg/L、盐酸硫胺素VB₁5.0mg/L、盐酸吡哆醇VB₆1.0mg/L、烟酸1mg/L和生物素VH>

所述低温保存培养基的pH值为5.8。接种后密封，置于4℃条件下进行保存。

实施例3

采用目测法，愈伤组织成活率(％)＝(浅黄鲜活的愈伤组织数/接种愈伤组织总数)×100％，测定实施例2中低温(4℃)保存25d的胚性愈伤组织的存活率，以在低温保存培养基上接种的25℃条件下培养25d的胚性愈伤组织为对照组1，以在实施例1中所述增殖培养基上低温(4℃)保存25d的胚性愈伤组织为对照组2。结果如图4所示。

由图4可知，低温保存的胚性愈伤组织和25℃条件下正常培养的胚性愈伤组织(对照组1)存活率无显著差异，但比以常规愈伤组织培养基培养、同样低温条件下培养的胚性愈伤组织(对照组2)的存活率显著提高，这表明经本发明提供的低温保存方法保存的胚性愈伤组织能够很好的保持其存活率，不会对其造成损伤。

实施例4

将实施例2中4℃条件下保存25d的胚性愈伤组织与实施例1制备在25℃条件下暗培养的胚性愈伤组织(图3-B，其中25℃培养的胚性愈伤组织为对照组)为材料，荧光素双醋酸酯FDA染色法测定组织细胞活性，细胞活性的强弱通过细胞的荧光强度表示，结果如图5所示。

如图5所示，图5-A为25±2℃暗培养的胚性愈伤组织的荧光强度；图5-B为低温保存胚性愈伤组织的荧光强度。经FDA荧光法检测低温保存胚性愈伤组织的细胞活力，其荧光强度比对照25±2℃暗培养的胚性愈伤组织的荧光强度还略强，组织块荧光分布也更均匀，说明经低温保存的胚性愈伤组织细胞活力维持更强。

实施例5

将实施例2中4℃条件下保存25d的胚性愈伤组织与实施例1制备在25℃条件下暗培养的胚性愈伤组织(图3-B，其中25℃培养的胚性愈伤组织为对照组)为材料，SOD酶、POD酶、CAT酶、APX酶和GR酶的活性。

超氧化物歧化酶(SOD)酶活性的测定采用SOD试剂盒(南京建成生物工程研究所)进行测定。以每分钟反应液中黄嘌呤氧化抑制率达50％时所对应的蛋白量为一个活力单位(U)。蛋白质含量测定采用Bradford的方法，以牛血清蛋白为标准。

谷胱甘肽还原酶(GR)酶活性的测定采用GR试剂盒(南京建成生物工程研究所)进行测定。以每克组织蛋白每分钟使反应体系中底物NADPH的浓度改变1mM所需的酶量为一个活力单位(U)。蛋白质含量测定采用Bradford的方法，以牛血清蛋白为标准。

过氧化物酶(POD)酶活性的测定采用POD试剂盒(南京建成生物工程研究所)进行测定。以在37℃条件下，每毫克组织蛋白每分钟催化1μg底物的酶量为一个酶活力单位(U)。蛋白质含量测定采用Bradford的方法，以牛血清蛋白为标准。

过氧化氢酶(CAT)酶活性的测定采用CAT试剂盒(南京建成生物工程研究所)进行测定。以每克血红蛋白中过氧化氢酶(CAT)每秒钟分解吸光度为0.50～0.55的底物中的过氧化氢相对量为一个过氧化氢酶的活力单位(U)。蛋白质含量测定采用Bradford的方法，以牛血清蛋白为标准。

抗坏血酸过氧化物酶(APX)酶活性的测定采用APX试剂盒(南京建成生物工程研究所)进行测定。每毫克蛋白每分钟氧化1μmol AsA为一个酶活单位(U)。

结果如图6～10所示。由图6～10可知，胚性愈伤组织中的谷胱甘肽还原酶显著增加4～5倍，加强抗氧化能力，其他抗氧化酶无显著降低，整个抗氧化系统没有受到破坏，维持动态平衡，有效清除活性氧，胚性愈伤组织低温保存状态良好。

实施例6

将低温保存25d的胚性愈伤组织取出，接种活化培养基上，并辅以子叶形体细胞胚状体(将大的子叶形体细胞胚状体切成5～7mm²，子叶形体细胞胚状体组织是由胚性愈伤组织接种至体细胞胚分化培养基上陆续分化得到的)一起哺育培养，在25℃条件下增殖培养25d，得到胚性愈伤组织。以25±2℃暗培养25d后增殖的胚性愈伤组织为对照组。拍照记录恢复和增殖生长情况，并统计恢复生长情况。

经恢复生长后，可进行正常25±2℃正常增殖生长，如图11所示，在增殖过程中，在25±2℃暗培养条件下生长的对照胚性愈伤组织中的，部分胚性愈伤组织会变褐色，且陆续有体细胞胚分化(图11-B)，而低温保存过的胚性愈伤依然保持着鲜黄的组织状态，未见明显的体细胞胚分化，维持着原胚性(图11-C)，说明经低温保存有助于提高胚性愈伤组织的细胞活力和生长同一性，有利于提高后期体细胞胚状体分化的同步性。两者间相对生长量无显著差异，增殖系数接近3。

实施例7

等胚性愈伤组织恢复增殖到一定数量，即可转接到体细胞胚分化培养基上诱导体细胞胚的分化；所述体细胞胚分化培养基为体细胞胚分化培养基以改良MS为基本培养，添加Kt 0.6mg/L、NAA0.15mg/L、6-BA0.05mg/L、亚精胺5mg/L、水解酪蛋白300mg/L、10％椰汁、活性炭0.12％、蔗糖70g/L和植物凝胶2.4g/L，培养基的pH值为5.8；所述改良MS培养基以水为溶剂，包括硝酸铵1100mg/L、硝酸钾1267mg/L、二水氯化钙800mg/L、七水硫酸镁247mg/L、磷酸二氢钾226mg/L、碘化钾0.83mg/L、硼酸9mg/L、四水硫酸锰22.3mg/L、七水硫酸锌8.6mg/L、二水钼酸钠0.25mg/L、五水硫酸铜0.025mg/L、六水氯化钴0.025mg/L、乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L、七水硫酸亚铁27.8mg/L、肌醇100mg/L、甘氨酸1mg/L、盐酸硫胺素VB₁5.0mg/L、盐酸吡哆醇VB₆1.0mg/L、烟酸1mg/L和生物素VH>

经分化培养基上诱导培养40d后统计胚性愈伤组织恢复生长情况和分化诱导。在分化培养基上诱导40～50d后，体细胞胚状体发育成子叶形体细胞胚，即可转接到胚萌发培养基上，继续培养30～40d，等再生植株的两对新叶长出，即可移栽沙床。所述增殖培养基优选以改良MS为基本培养基，包括以下含量组分：水解酪蛋白300mg/L、体积浓度为10％椰子汁、蔗糖70g/L、质量浓度为0.1％活性炭和植物凝胶2.3g/L；所述增殖培养基的pH值为5.8。

低温保存25d后的胚性愈伤组织恢复生长情况如表1所示，经分化培养基上诱导培养40d后统计，低温保存过的胚性愈伤组织比对照25±2℃胚性愈伤组织更鲜黄，但两者间的体细胞胚诱导率无显著差异，皆约在80％，继续培养至60d后再统计，低温保存过的胚性愈伤组织体细胞胚生成数(个/每克鲜重)与最后形成的正常子叶形胚状体与对照胚性愈伤组织的无显著差异，甚至比对照胚性愈伤组织的略高，说明低温保存对胚性愈伤组织后期的体细胞胚诱导和正常子叶形体细胞胚形成无抑制作用，反而略有促进。

表1低温保存25d后的胚性愈伤组织恢复生长情况

注：表中数据每处理重复4次，同列数值不同字母表示差异达5％显著水平，下同。增殖相对生长量在胚性愈伤组织转移至增殖培养基上培养25d测定，体细胞胚诱导率以及体细胞胚总数和正常子叶形细胞胚数分别在转至分化培养基上培养40和60d时测定。

同时如表1所示，对照胚性愈伤组织和低温保存过的胚性愈伤组织大多数能诱导出体细胞胚，但到后期真正能发育成子叶形体细胞胚的只约30％左右。与对照胚性愈伤组织形成的再生植株数量相比，低温保存过的显著增加了47.2％。如图12所示，低温保存过的胚性愈伤组织形成的再生植株也比对照胚性愈伤组织形成的植株更加矮壮、根系也更加发达，说明经过适度的低温保存，有利于提高胚性愈伤组织后期再生植株的生长质量。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。