基于碳点及磁性Fe3O4@PPY的荧光适体传感器检测腺苷的方法

摘要

本发明公开了一种基于碳点及磁性Fe3O4@PPY的荧光适体传感器检测腺苷的方法，该方法依次包含Fe3O4@PPY纳米粒制备、适体‑碳点荧光复合物(Apt‑CDs)的形成、腺苷的检测。本发明利用Fe3O4@PPY纳米粒的荧光猝灭作用，在无目标物存在时，适体‑碳点复合物吸附于Fe3O4@PPY纳米粒表面，发生荧光猝灭；加入目标物腺苷时，与适体结合形成特有的球链状结构，Apt‑CDs从Fe3O4@PPY纳米粒表面脱落，恢复荧光，完成对腺苷的检测。本发明方法操作简便、价格低廉、普适性强、响应灵敏、选择性好，可实现血清中腺苷的高效、灵敏和快速检测，对临床相关疾病的诊疗有重要意义。

说明书

技术领域

本发明属于分析检测技术领域，具体涉及基于碳点及磁性Fe₃O₄@PPY的荧光适体传感器用于检测腺苷的方法。

背景技术

荧光检测技术灵敏度高、设计简单、价格低廉、有良好的稳定性及重复利用性、可实现高通量检测因而应用广泛。目前，不同的荧光探针如荧光染料、量子点、碳点等被广泛应用于荧光传感器的构建中。作为一种新型的荧光材料，碳点较好的耐光性，理想的生物相容性，低毒性和较好的水溶性而引起广泛的关注。

适体是通过指数富集配体系统进化技术从人工构建的随机单链寡核苷酸文库里筛选出来的寡核苷酸片段，它不仅具有类似抗体对目标分子如蛋白质、氨基酸、药物或无机离子等的高特异性和高亲和力的优点，而且具有分子量小、结构简单、易合成和可进行连接性修饰，反应速度快、可反复使用和长期保存等优点。近年来，适体传感器的研究十分活跃。因此，将适体与碳点相结合，为制备高灵敏度高选择性的荧光传感器提供有利的条件。

荧光猝灭材料的引入可以进一步提高传感器的选择性和灵敏度，优化耗时并复杂的分析过程。聚吡咯因具有多样的结构，独特的掺杂机制、优异的物理化学性能、良好的稳定性和原料的价廉易得等优点，而成为聚合物研究的热点。进来有研究表明，聚吡咯可以用作为荧光猝灭材料。

在off-on的荧光传感系统中，荧光探针与荧光猝灭材料的分离在增加灵敏度方面显得尤为重要，但这方面还未有报道。

腺苷是磷酸腺苷的代谢物，也是生命活动的重要参与者，参与了很多的病理和生理过程，具有抗心律失常的功能。在中枢神经系统中，可对抵抗缺血性与疾病性神经伤害发挥重要作用。因此腺苷的检测对于疾病的诊断和治疗具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于碳点与磁性Fe₃O₄@PPY构建的荧光适体传感器用于血清中腺苷的灵敏检测的方法，该方法利用Fe₃O₄@PPY纳米粒的荧光猝灭作用，在无目标物存在时，适体-碳点复合物吸附于Fe₃O₄@PPY纳米粒表面，发生荧光猝灭；加入目标物腺苷时，与适体结合形成特有的球链状结构，Apt-CDs从Fe₃O₄@PPY纳米粒表面脱落，恢复荧光，完成对腺苷的检测。该方法操作简便、价格低廉、普适性强、响应灵敏、选择性好，可实现血清中腺苷的高效、灵敏和快速检测，对临床相关疾病的诊疗有重要意义。本发明的目的是通过以下方式实现的：

一种基于碳点及磁性Fe₃O₄@PPY的荧光适体传感器检测腺苷的方法，其特征在于该方法包括以下步骤：

a)Fe₃O₄@PPY纳米粒制备：在Fe₃O₄纳米粒中加入吡咯，随后加入引发剂过硫酸铵，得Fe₃O₄@PPY纳米粒；

b)适体-碳点荧光复合物(Apt-CDs)的形成：将碳点溶液加EDC活化，随后加入腺苷适体，反应得到Apt-CDs，优选经过碳化二亚胺法完成Apt-CDs的制备；

c)腺苷的检测：在步骤b)得到的Apt-CDs中加入步骤a)得到的Fe₃O₄@PPY纳米粒，荧光猝灭，测定其荧光强度，记为F₀；加入不同浓度目标物腺苷，与适体结合，Apt-CDs从Fe₃O₄@PPY纳米粒上脱落，荧光恢复，测定其荧光强度，记为F₁；以(F₁-F₀)/F₀的荧光恢复比值与腺苷的浓度进行线性拟合，外标法绘制标准曲线，再重复c)步骤进行样品浓度的测定。

步骤“a)”中，Fe₃O₄与吡咯的质量比为1:0.5～1:2。

步骤“a)”中的引发剂过硫酸铵与吡咯的摩尔比为1:1。

步骤“b)”中加入腺苷适体后的反应时间为4～8h。

步骤“c)”中加入的Fe₃O₄@PPY纳米粒的质量浓度为0.25～1.25g/L。本发明中采用磁性Fe₃O₄@PPY，不仅可以进行更有效的荧光猝灭，而且可以方便的分离荧光探针与荧光猝灭材料。基于这种磁性分离，背景信号和散射干扰被明显的降低，在提高荧光传感器的响应回收率及灵敏度方面有着良好的应用前景。

所述的碳点溶液为2g的柠檬酸，200℃加热10-30min，获得的橙色溶液逐滴加入到100mL NaOH中。

步骤“c)”中加入腺苷适体后的反应时间为10～50min。

步骤“c)”中加入目标物腺苷的浓度范围为10～1000nM。

步骤“c)”中加入目标物腺苷的反应时间为10～50min。

步骤“c)”中加入目标物腺苷的反应温度为15～50℃。

本发明方法依次包含Fe₃O₄@PPY纳米粒制备、适体-碳点荧光复合物(Apt-CDs)的形成、腺苷的检测。本发明方法操作简便、价格低廉、普适性强、响应灵敏、抗干扰能力强、稳定性和重现性良好，可实现血清中腺苷的高效、灵敏和快速检测，对临床相关疾病的诊疗有重要意义。因此，本发明制备的基于碳点及磁性Fe₃O₄@PPY的荧光适体传感器特别适用于血清中腺苷的高灵敏度高选择性的检测。

与现有技术比较本发明的有益效果：

1.本发明得益于适体-碳点荧光复合物中适体的高选择性以及碳点的高荧光强度，完成对生物样本中腺苷的灵敏特异性检测。

2.采用磁性Fe₃O₄@PPY，制备简便快速，且猝灭效率高，为制备高灵敏度的传感器提供有利条件；利用Fe₃O₄@PPY的磁性，在检测过程中可方便的磁性分离，进一步提高灵敏度。

3.本传感器制备简便快速，绿色环保无毒，价格低廉，检测过程简便快速，普适性强，可完成对生物样本中腺苷的高通量检测。

附图说明

图1为基于碳点与磁性Fe₃O₄@PPY构建的荧光适体传感器检测腺苷的流程示意图。

图2A为荧光传感器原理图(a,Apt-CDs；b,Apt-CDs/Fe₃O₄@PPY；c,Apt-CDs/Fe₃O₄@PPY/Adenosine>3O₄@PPY，Apt-CDs通过π-π作用与疏水作用被吸附到Fe₃O₄@PPY的表面，发生荧光猝灭，见曲线b；目标物腺苷出现后，与适体形成特有的腺苷适体复合物，将Apt-CDs从Fe₃O₄@PPY表面竞争下来，荧光恢复，见曲线c。

图2B为时光分辨荧光衰减曲线图(a,Apt-CDs；b,Apt-CDs/Fe₃O₄@PPY)。加入Fe₃O₄@PPY后其荧光寿命曲线没有出现明显的变化，表明该猝灭过程是静态猝灭。

图3A为加入不同浓度腺苷(1.0×10^-8～1.0×10^-6mol·L^-1)后，传感体系的荧光强度变化；内插图为荧光恢复(F-F₀)/F₀比率与lg(C_腺苷)线性关系曲线。

图3B为选择性实验结果图。

图4A为有无磁性分离的检测操作示意图；

图4B为有无磁性分离，荧光恢复比率的比较。对比有无磁性分离测定的结果的灵敏度差异，发现在检测前后进行磁性分离，其恢复比率大大增加，表明灵敏度进一步提高。首先，在第一步磁性分离中，共存的游离CDs被分离，降低背景电流F₀。其次，加入目标物后，荧光恢复后的磁性分离，将荧光的供体与受体分开，减少Fe₃O₄@PPY对与目标物结合的Apt-CDs的激发/发射能量的吸收，同时降低散射光，增强F1，进一步增加灵敏度。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明做进一步解释说明：

药品和试剂：腺苷、鸟苷、尿苷、胞啶(adenosine,guanosine,uridine,cytidine,分析纯，阿拉丁试剂有限公司)，六水合氯化铁(FeCl₃·6H₂O,国药集团化学试剂有限公司)，四水合氯化亚铁(FeCl₂·4H₂O,温州市化学用料厂)，过硫酸铵(上海凌峰化学试剂有限公司)，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC,国药集团化学试剂有限公司)，腺苷适体(序列：5’-NH2-(CH2)6-AGA>2PO₄，分析纯，南京化学试剂有限公司)，磷酸氢二钠(Na₂HPO₄，分析纯，上海凌峰化学有限公司)，水合肼(H₂N-NH₂，上海实验试剂有限公司)，氮气(工业级，南京五十五所)，实验用水为二次蒸馏水。

实施例1

a)Fe₃O₄@PPY纳米粒制备：Fe₃O₄纳米粒20mg分散于12mL水中，加入30μL的吡咯，随后逐滴加入3mL的过硫酸铵(0.14mol>-1)，于0-5℃反应4h,水洗至pH为7，真空干燥24h，得Fe₃O₄@PPY纳米粒。

b)适体-碳点荧光复合物(Apt-CDs)的形成：2g的柠檬酸，200℃加热30min，获得的橙色溶液逐滴加入到100mL NaOH(10mg>-1)中，得到碳点溶液；取200μL碳点溶液，加入190μLEDC(20g>-1in>

c)腺苷的检测：取步骤b)得到的Apt-CDs20μL，加入步骤a)得到的Fe₃O₄@PPY纳米粒20μL(1mg>-1)，反应30min，随后分别加入水、不同浓度目标物腺苷(a-h:0,10,50,100,250,500,750,1000nM)各20μL，37℃反应30min，加水至100μL，测定其荧光强度；无目标物存在时记为F₀，加入腺苷后记为F₁；以(F₁-F₀)/F₀的荧光恢复比值与腺苷的浓度进行线性拟合，外标法绘制标准曲线，再进行样品浓度的测定。

c)腺苷的检测：取两份步骤b)得到的Apt-CDs20μL，分别加入步骤a)得到的Fe₃O₄@PPY纳米粒20μL(1mg>-1)，反应30min，其中一份加水20μL作为空白，另一份加入不同浓度目标物腺苷(10,50,100,250,500,750,1000nM)20μL，37℃反应30min，均加水至100μL，测定其荧光强度；无目标物存在时记为F₀，加入腺苷后记为F₁；以(F₁-F₀)/F₀的荧光恢复比值与腺苷的浓度进行线性拟合，外标法绘制标准曲线，再进行样品浓度的测定。

实施例2

a)Fe₃O₄@PPY纳米粒制备：Fe₃O₄纳米粒20mg分散于12mL水中，加入10μL的吡咯，随后逐滴加入3mL的过硫酸铵(0.047mol>-1)，于0-5℃反应4h,水洗至pH为7，真空干燥24h，得Fe₃O₄@PPY纳米粒。

b)适体-碳点荧光复合物(Apt-CDs)的形成：2g的柠檬酸200℃加热30min，获得的橙色溶液逐滴加入到100mL NaOH(10mg>-1)中，得到碳点溶液；取200μL碳点溶液，加入190μL EDC(20g>-1in>

c)腺苷的检测：取步骤b)得到的Apt-CDs20μL，加入步骤a)得到的Fe₃O₄@PPY纳米粒20μL(1.25mg>-1)，反应20min，随后分别加入水、不同浓度目标物腺苷(a-h:0,10,50,100,250,500,750,1000nM)20μL，25℃反应20min，加水至100μL，测定其荧光强度；无目标物存在时记为F₀，加入腺苷后记为F₁；以(F₁-F₀)/F₀的荧光恢复比值与腺苷的浓度进行线性拟合，外标法绘制标准曲线，再进行样品浓度的测定。

c)腺苷的检测：取两份步骤b)得到的Apt-CDs20μL，分别加入步骤a)得到的Fe₃O₄@PPY纳米粒20μL(1mg>-1)，反应20min，其中一份加水20μL作为空白，另一份加入不同浓度目标物腺苷(10,50,100,250,500,750,1000nM)20μL，25℃反应20min，均加水至100μL，测定其荧光强度；无目标物存在时记为F₀，加入腺苷后记为F₁；以(F₁-F₀)/F₀的荧光恢复比值与腺苷的浓度进行线性拟合，外标法绘制标准曲线，再进行样品浓度的测定。

实施例3

a)Fe₃O₄@PPY纳米粒制备：Fe₃O₄纳米粒20mg分散于12mL水中，加入20μL的吡咯，随后逐滴加入3mL的过硫酸铵(0.093mol>-1)，于0-5℃反应4h,水洗至pH为7，真空干燥24h，得Fe₃O₄@PPY纳米粒。

b)适体-碳点荧光复合物(Apt-CDs)的形成：2g的柠檬酸200℃加热30min，获得的橙色溶液逐滴加入到100mL NaOH(10mg>-1)中，得到碳点溶液；取200μL碳点溶液，加入190μL EDC(20g>-1in>

c)腺苷的检测：取步骤b)得到的Apt-CDs20μL，加入步骤a)得到的Fe₃O₄@PPY纳米粒20μL(0.5mg>-1)，反应40min，随后分别加入水、不同浓度目标物腺苷(a-h:0,10,50,100,250,500,750,1000nM)20μL，25℃反应40min，加水至100μL，测定其荧光强度；无目标物存在时记为F₀，加入腺苷后记为F₁；以(F₁-F₀)/F₀的荧光恢复比值与腺苷的浓度进行线性拟合，外标法绘制标准曲线，再进行样品浓度的测定。

c)腺苷的检测：取两份步骤b)得到的Apt-CDs20μL，分别加入步骤a)得到的Fe₃O₄@PPY纳米粒20μL(1mg>-1)，反应40min，其中一份加水20μL作为空白，另一份加入不同浓度目标物腺苷(10,50,100,250,500,750,1000nM)20μL，25℃反应40min，均加水至100μL，测定其荧光强度；无目标物存在时记为F₀，加入腺苷后记为F₁；以(F₁-F₀)/F₀的荧光恢复比值与腺苷的浓度进行线性拟合，外标法绘制标准曲线，再进行样品浓度的测定。

实施例4

a)Fe₃O₄@PPY纳米粒制备：Fe₃O₄纳米粒20mg分散于12mL水中，加入40μL的吡咯，随后逐滴加入3mL的过硫酸铵(0.187mol>-1)，于0-5℃反应4h,水洗至pH为7，真空干燥24h，得Fe₃O₄@PPY纳米粒。

b)适体-碳点荧光复合物(Apt-CDs)的形成：2g的柠檬酸200℃加热30min，获得的橙色溶液逐滴加入到100mL NaOH(10mg>-1)中，得到碳点溶液；取200μL碳点溶液，加入190μL EDC(20g>-1in>

c)腺苷的检测：取步骤b)得到的Apt-CDs20μL，加入步骤a)得到的Fe₃O₄@PPY纳米粒20μL(0.75mg>-1)，反应50min，随后分别加入水、不同浓度(a-h:0,10,50,100,250,500,750,1000nM)目标物腺苷各20μL，37℃反应50min，加水至100μL，测定其荧光强度；无目标物存在时记为F₀，加入腺苷后记为F₁；以(F₁-F₀)/F₀的荧光恢复比值与腺苷的浓度进行线性拟合，外标法得标准曲线(F₁-F₀)/F₀＝0.42lg[C(nM)]-0.41(R＝0.988)，再进行样品浓度的测定。

c)腺苷的检测：取两份步骤b)得到的Apt-CDs20μL，分别加入步骤a)得到的Fe₃O₄@PPY纳米粒20μL(1mg>-1)，反应50min，其中一份加水20μL作为空白，另一份加入不同浓度目标物腺苷(10,50,100,250,500,750,1000nM)20μL，37℃反应50min，均加水至100μL，测定其荧光强度；无目标物存在时记为F₀，加入腺苷后记为F₁；以(F₁-F₀)/F₀的荧光恢复比值与腺苷的浓度进行线性拟合，外标法得标准曲线(F₁-F₀)/F₀＝0.42lg[C(nM)]-0.41(R＝0.988)，再进行样品浓度的测定。

采用上述实施例4基于碳点与磁性Fe₃O₄@PPY构建的荧光适体传感器的方法得到测定的线性及检测限：取浓度范围分别为1.0×10^-8～1.0×10^-6mol·L^-1的腺苷溶液进行测试，所测得荧光恢复比率(F₁-F₀)/F₀与lg[C_腺苷(nM)]成较好的线性，计算可知检测限为3nmol·L^-1(S/N＝3)。

实际样品测定过程：从医院获得受试者血清，将500μL血清样品中加入500μL甲醇涡旋1min后，12000rpm离心10min，收集上清液(即去蛋白处理)，按照实施例4中步骤c测定样品中腺苷的浓度，并进行加样回收率实验，具体检测结果见表1。

表1血清中腺苷的含量测定(n＝3)