二酚化合物与2‑醛基苯硼酸形成的自组装及其作为荧光探针的应用

摘要

二酚化合物与2‑醛基苯硼酸形成的自组装及其作为荧光探针的应用，本发明涉及两种二酚化合物与2‑醛基苯硼酸分别形成的自组装用于作为荧光探针，二酚化合物在磷酸缓冲液中加入2‑醛基苯硼酸形成自组装体系，可用于对自由基次氯酸和过氧亚硝基的定量检测，该类探针的优点是自身荧光较弱，只有与待测物作用后有显著的荧光增强，本发明荧光探针相比于其它检测自由基荧光萃灭型探针，该类组装体探针具有更高的信噪比，具有快速、灵敏、简便、高效的特点。

说明书

技术领域

本发明涉及生物分析技术领域，特别涉及一种二酚化合物与2-醛基苯硼酸形成的自组装及其作为荧光探针的应用。

背景技术

次氯酸(HClO)作为人体内重要的活性氧物质(ROX)之一(Journal of Biochemical and Biophysical Methods,2005,65(2):45-80.)，在生命体的生命活动中发挥极其重要的作用。作为一种弱酸(pKa＝7.6),可以通过髓过氧化物酶使双氧水和氯离子作用产生，主要分布于巨噬细胞的酸性细胞器溶酶体中，对于侵入性细菌和其他病原体的免疫防御起到了关键性的作用，正常情况下适当含量的次氯酸对人体是有益的。次氯酸作为组织内巨噬细胞的产物，可诱导血管内皮细胞凋亡及组织因子表达，它与粥样动脉硬化以及一些炎症症状类疾病的发病机理有密切关系(Drug Resistance Updates,2004,7:97-110.)。另外，吞噬细胞中过量产生的次氯酸可以诱导慢性疾病的发生致组织损伤并引发一系列疾病的产生，如关节炎、动脉硬化症及一些癌症等(Journal of materials chemistry,2017,5:289-295；Analytical Chemistry,2016,88(24):12532–12538；Free Radical Biology and Medicine,2000,28(12):1717-1725；)。所以说，在医疗和科学中对次氯酸的检测研究引起了研究者广泛的兴趣，已成为目前生物化学研究的热点问题之一。

过氧亚硝基(ONOO^-)是一种短寿命的活性氮物质(RNS)，由一氧化氮和超氧阴离子自由基组成。ONOO^-是一把双刃剑，它对有机体生物功能的影响既有有益的一面，也有不利的一面。对生物体来说，适量的ONOO^-是有益的，它可以阻止细菌对有机体的入侵。但当其含量出现异常时，就可能导致一些病理条件下的组织损伤，可能导致炎症，缺血再灌注和神经变性疾病(Analyst,2012,137(16):3740-3749；Chemical>

到目前为止，已经有多种技术手段用来分析检测不同物质，如化学发光法，滴定法，分光光度法，色谱法和电化学方法等(Chemical Society Reviews,2014,43:4312-4324；Chemical Society Reviews,2010,39,127-137；)。虽然这其中有些方法可以提供便携的，高灵敏的快速检测手段，但是费用却很昂贵,而且耗时、复杂,不适合实时分析和现场检测。

荧光化学传感器作为一种灵敏度高、选择性好、检出限低的微量分析技术,可以对单(多)种对象进行实时、在线检测，克服了传统监测手段步骤繁琐、耗费时间长、不能实时在线分析的缺点。同时荧光检测方法具有实时、快速、简便、选择性和灵敏度高等优点，可以实时对待测物进行定性和定量检测。

发明内容

为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种二酚化合物与2-醛基苯硼酸形成的自组装及其作为荧光探针的应用，能够通过二酚化合物与2-醛基苯硼酸形成自组装，作为增强型荧光探针对自由基次氯酸和过氧亚硝基进行定量检测，具有快速、简便、高效的特点。

为了达到上述目的，本发明采取的技术方案为：

二酚化合物与2-醛基苯硼酸形成的自组装，自组装结构式如式(1)和式(2)所示：

所述荧光探针用于对自由基次氯酸和过氧亚硝基进行定量的检测，且该类探针加入待测物次氯酸和过氧亚硝基后有显著的荧光增强。

所述二酚化合物包括(2',3'-二羟基苯基)苯并噻唑(3)和R-1,1'-联-2-萘酚(4)两种，其结构式分别如下：

所述二酚化合物和2-醛基苯硼酸在磷酸缓冲液中形成硼酸酯组成自组装体系，作为荧光探针。

所述磷酸缓冲液为10mM，pH＝7.8-8.2。

所述二酚化合物(2',3'-二羟基苯基)苯并噻唑与2-醛基苯硼酸组成自组装体系作为荧光探针，对次氯酸定量检测的浓度范围是0-120μM，对过氧亚硝基的定量检测浓度范围0-45μM。

所述二酚化合物R-1,1'-联-2-萘酚与2-醛基苯硼酸组成自组装体系作为荧光探针，对次氯酸定量检测的浓度范围是0-290μM，对过氧亚硝基的定量检测浓度范围20-140μM。

本发明与现有技术相比的有益效果为：

本发明采用两种二酚化合物与2-醛基苯硼酸分别形成的自组装，用于作为荧光探针对次氯酸和过氧亚硝基进行定量检测。该类探针的优点是自身荧光较弱，只有与待测物作用后有显著的荧光增强。相比于其它检测自由基荧光萃灭型探针，该类组装体探针具有更高的信噪比，该组装体系可以实时、快速检测次氯酸和过氧亚硝基，对于次氯酸和过氧亚硝基具有很好的灵敏性和选择性响应，可应用于体外对次氯酸和过氧亚硝基的检测，为疾病诊断提供有效的分析方法。

本发明所研究的两种二酚化合物结构简单，二酚化合物的羟基基团很容易与2-醛基苯硼酸进行自组装，且两种二酚化合物本身在磷酸缓冲液中对于次氯酸和过氧亚硝基没有响应，但当与2-醛基苯硼酸形成自组装体系后，其自组装体系可以作为增强型的荧光探针选择性地检测自由基次氯酸和过氧亚硝基，而对于其它自由基没有任何响应。

作为增强型荧光探针，二酚化合物(2',3'-二羟基苯基)苯并噻唑与2-醛基苯硼酸自组装体系可以对一定浓度范围内的次氯酸(0-120μM)和过氧亚硝基(0-45μM)进行定量的检测，R-1,1'-联-2-萘酚与2-醛基苯硼酸自主装体系可以对一定浓度范围内的次氯酸(0-290μM)和过氧亚硝基(20-140μM)进行定量的检测。

附图说明

图1是在磷酸缓冲液(10mM,pH＝8.0)中加入浓度为5μM二酚化合物(3)和100μM 2-醛基苯硼酸组成自组装体系，再分别加入浓度0，5，10，15，20，25，30，35，40，45，50，55，60，65，70，75，80，85，90，95，100，105，110，115，120μM次氯酸后荧光强度的变化图。

图2是在磷酸缓冲液(10mM,pH＝8.0)中加入浓度为5μM二酚化合物(3)和100μM 2-醛基苯硼酸组成自组装体系，再分别加入浓度0，5，10，15，20，25，30，35，40，45μM过氧亚硝基后荧光强度的变化图。

图3是在磷酸缓冲液(10mM,pH＝8.0)中加入浓度为5μM二酚化合物(3)和100μM 2-醛基苯硼酸组成自组装体系，再分别加入浓度0-120μM次氯酸后其在发射波长493nm处荧光强度随不同次氯酸浓度线性关系图。

图4是在磷酸缓冲液(10mM,pH＝8.0)中加入浓度为5μM二酚化合物(3)和100μM 2-醛基苯硼酸组成自组装体系，再分别加入浓度0-45μM过氧亚硝基后其在发射波长493nm处荧光强度随不同过氧亚硝基浓度线性关系图。

图5是在磷酸缓冲液(10mM,pH＝8.0)中加入浓度为5μM二酚化合物(3)和100μM 2-醛基苯硼酸组成自组装体系，再分别加入浓度50μM OH^·,¹O₂,ClO^-,H₂O₂,NO^·,NO₂^-,NO₃^-,O₂^·-,ONOO^-荧光强度的变化图。

图6是在磷酸缓冲液(10mM,pH＝8.0)中加入浓度为5μM二酚化合物(3)和100μM 2-醛基苯硼酸组成自组装体系，再分别加入浓度50μM各种自由基(分别为OH^·,¹O₂,ClO^-,H₂O₂,NO^·,NO₂^-,NO₃^-,O₂^·-,ONOO^-)其在发射波长493nm处荧光强度图。

图7是在磷酸缓冲液(10mM,pH＝8.0)中加入浓度为5μM二酚化合物(3)和100μM 2-醛基苯硼酸组成自组装体系，再分别加入浓度50μM OH^·,¹O₂,ClO^-,H₂O₂,NO^·,NO₂^-,NO₃^-,O₂^·-,ONOO^-荧光强度与自组装体系自身的荧光强度变化比率柱状图。

图8是在磷酸缓冲液(10mM,pH＝8.0)中加入浓度为5μM二酚化合物(4)和100μM 2-醛基苯硼酸组成自组装体系，再分别加入浓度0，10，20，30，40，50，60，70，80，90，110，130，150，170，190，210，230，250，270，290μM次氯酸后荧光强度的变化图。

图9是在磷酸缓冲液(10mM,pH＝8.0)中加入浓度为5μM二酚化合物(4)和100μM 2-醛基苯硼酸组成自组装体系，再分别加入浓度0，10，20，30，40，50，60，70，80，90，100，110，120，130，140，150，160，170μM过氧亚硝基后荧光强度的变化图。

图10是在磷酸缓冲液(10mM,pH＝8.0)中加入浓度为5μM二酚化合物(4)和100μM 2-醛基苯硼酸组成自组装体系，再分别加入浓度0-290μM次氯酸后其在发射波长499nm处荧光强度随不同次氯酸浓度线性关系图。

图11是在磷酸缓冲液(10mM,pH＝8.0)中加入浓度为5μM二酚化合物(4)和100μM 2-醛基苯硼酸组成自组装体系，再分别加入浓度20-140μM过氧亚硝基后其在发射波长499nm处荧光强度随不同过氧亚硝基浓度线性关系图。

图12是在磷酸缓冲液(10mM,pH＝8.0)中加入浓度为5μM二酚化合物(4)和100μM 2-醛基苯硼酸组成自组装体系，再分别加入浓度100μM OH^·,¹O₂,ClO^-,H₂O₂,NO^·,NO₂^-,NO₃^-,O₂^·-,ONOO^-荧光强度的变化图。

图13是在磷酸缓冲液(10mM,pH＝8.0)中加入浓度为5μM二酚化合物(4)和100μM 2-醛基苯硼酸组成自组装体系，再分别加入浓度100μM各种自由基(分别为OH^·,¹O₂,ClO^-,H₂O₂,NO^·,NO₂^-,NO₃^-,O₂^·-,ONOO^-)其在发射波长499nm处荧光强度图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步详细说明。

将二酚化合物(2',3'-二羟基苯基)苯并噻唑(3)和R-1,1'-联-2-萘酚(4)分别溶解到无水乙腈溶液中配成5mM母液；将2-醛基苯硼酸固体溶解到无水乙腈中配成10mM溶液；配制各种自由基浓度10mM。

实施例一：二酚化合物(3)与2-醛基苯硼酸自组装对次氯酸和过氧亚硝基响应分析。

取3μL二酚化合物(3)母液加入3mL磷酸缓冲液(10mM,pH＝8.0)中，加入30μL 2-醛基苯硼酸后形成自组装体系,检测荧光强度变化；再分别加入浓度5，10，15，20，25，30，35，40，45，50，55，60，65，70，75，80，85，90，95，100，105，110，115，120μM次氯酸，检测荧光强度变化，随着次氯酸浓度的增加荧光强度明显增强，参见图1。二酚化合物(3)与2-醛基苯硼酸自组装可以作为荧光探针用于次氯酸的检测。

取3μL二酚化合物(3)母液加入3mL磷酸缓冲液(10mM,pH＝8.0)中，加入30μL 2-醛基苯硼酸后形成自组装体系,检测荧光强度变化；再分别加入浓度5，10，15，20，25，30，35，40，45μM的过氧亚硝基，检测荧光强度变化，随着过氧亚硝基浓度的增加荧光强度明显增强，参见图2。二酚化合物(3)与2-醛基苯硼酸自组装可以作为荧光探针用于过氧亚硝基的检测。

实施例二：二酚化合物(3)与2-醛基苯硼酸自组装对次氯酸定量检测。

取3μL二酚化合物(3)母液加入3mL磷酸缓冲液(10mM,pH＝8.0)中，加入30μL 2-醛基苯硼酸后形成自组装体系，再分别加入不同浓度的次氯酸(0，5，10，15，20，25，30，35，40，45，50，55，60，65，70，75，80，85，90，95，100，105，110，115，120μM)，检测在不同次氯酸浓度下在发射波长493nm处荧光强度，得到线性关系图，参见图3。次氯酸的浓度为横轴(单位为μΜ)，493nm处荧光强度为纵轴。其中荧光强度(y)与次氯酸浓度(x)满足一元线性方程：y＝292.062+23.003×x，相关指数R²＝0.989。二酚化合物(3)与2-醛基苯硼酸自组装可用于对次氯酸定量检测的应用。

实施例三：二酚化合物(3)与2-醛基苯硼酸自组装对过氧亚硝基定量检测。

取3μL二酚化合物(3)母液加入3mL磷酸缓冲液(10mM,pH＝8.0)中，加入30μL 2-醛基苯硼酸后形成自组装体系，再分别加入不同浓度的过氧亚硝基(0，5，10，15，20，25，30，35，40，45μM)，检测在不同过氧亚硝基浓度下在发射波长493nm处荧光强度，得到线性关系图，参见图4。过氧亚硝基的浓度为横轴(单位为μΜ)，493nm处荧光强度为纵轴。在浓度0-15μΜ范围内荧光强度(y)与次氯酸浓度(x)满足一元线性方程：y＝213.4+7.457×x，相关指数R²＝0.996。在浓度15-45μΜ范围内荧光强度(y)与次氯酸浓度(x)满足一元线性方程：y＝-48.45+23.875×x，相关指数R²＝0.993。二酚化合物(3)与2-醛基苯硼酸自组装在一定的浓度范围内可用于对过氧亚硝基定量检测的应用。

实施例四：二酚化合物(3)与2-醛基苯硼酸自组装对次氯酸和过氧亚硝基选择性检测应用。

取3μL二酚化合物(3)母液加入3mL磷酸缓冲液(10mM,pH＝8.0)中，加入30μL 2-醛基苯硼酸后形成自组装体系，再分别加入浓度50μM各种自由基(OH^·,¹O₂,ClO^-,H₂O₂,NO^·,NO₂^-,NO₃^-,O₂^·-,ONOO^-)，检测荧光强度变化，加入次氯酸和过氧亚硝基后荧光强度明显增强，参见图5。黑色柱对应加入不同自由基其在发射波长493nm处荧光强度值，参见图6。

取3μL二酚化合物(3)母液加入3mL磷酸缓冲液(10mM,pH＝8.0)中，加入30μL 2-醛基苯硼酸后形成自组装体系，检测荧光强度变化，确定发射波长493nm处荧光强度值F₀；再分别加入浓度50μM各种自由基(OH^·,¹O₂,ClO^-,H₂O₂,NO^·,NO₂^-,NO₃^-,O₂^·-,ONOO^-)，检测荧光强度变化，确定发射波长493nm处荧光强度值F，通过计算(F-F₀)/F₀得出比值变化柱状图，参见图7，明显看出次氯酸和过氧亚硝基荧光比值变化很大。二酚化合物(3)与2-醛基苯硼酸自组装可用于对次氯酸和过氧亚硝基选择性检测应用。

实施例五：二酚化合物(4)与2-醛基苯硼酸自组装对次氯酸和过氧亚硝基响应分析。

取3μL二酚化合物(4)母液加入3mL磷酸缓冲液(10mM,pH＝8.0)中，加入30μL 2-醛基苯硼酸后形成自组装体系,检测荧光强度变化；再分别加入浓度10，20，30，40，50，60，70，80，90，110，130，150，170，190，210，230，250，270，290μM次氯酸，检测荧光强度变化，随着次氯酸浓度的增加荧光强度明显增强，参见图8。二酚化合物(4)与2-醛基苯硼酸自组装可以作为荧光探针用于次氯酸的检测。

取3μL二酚化合物(4)母液加入3mL磷酸缓冲液(10mM,pH＝8.0)中，加入30μL 2-醛基苯硼酸后形成自组装体系,检测荧光强度变化；再分别加入浓度10，20，30，40，50，60，70，80，90，100，110，120，130,140，150，160，170μM的过氧亚硝基，检测荧光强度变化，随着过氧亚硝基浓度的增加荧光强度明显增强，参见图9。二酚化合物(4)与2-醛基苯硼酸自组装可以作为荧光探针用于过氧亚硝基的检测。

实施例六：二酚化合物(4)与2-醛基苯硼酸自组装对次氯酸定量检测。

取3μL二酚化合物(4)母液加入3mL磷酸缓冲液(10mM,pH＝8.0)中，加入30μL 2-醛基苯硼酸后形成自组装体系，再分别加入不同浓度的次氯酸(0，10，20，30，40，50，60，70，80，90，110，130，150，170，190，210，230，250，270，290μM)，检测在不同次氯酸浓度下在发射波长499nm处荧光强度，得到线性关系图，参见图10。在浓度0-90μΜ范围内荧光强度(y)与次氯酸浓度(x)满足一元线性方程：y＝14.311+4.349×x，相关指数R²＝0.997。在浓度90-290μΜ范围内荧光强度(y)与次氯酸浓度(x)满足一元线性方程：y＝169.90+2.709×x，相关指数R²＝0.995。二酚化合物(4)与2-醛基苯硼酸自组装在一定浓度范围内可用于对次氯酸定量检测的应用。

实施例七：二酚化合物(4)与2-醛基苯硼酸自组装对过氧亚硝基定量检测。

取3μL二酚化合物(4)母液加入3mL磷酸缓冲液(10mM,pH＝8.0)中，加入30μL 2-醛基苯硼酸后形成自组装体系，再分别加入不同浓度的过氧亚硝基(20，30，40，50，60，70，80，90，100，110，120，130,140μM)，检测在不同过氧亚硝基浓度下在发射波长499nm处荧光强度，得到线性关系图，参见图11。过氧亚硝基的浓度为横轴(单位为μΜ)，499nm处荧光强度为纵轴。荧光强度(y)与过氧亚硝基浓度(x)满足一元线性方程：y＝-66.354+5.627×x，相关指数R²＝0.999。二酚化合物(4)与2-醛基苯硼酸自组装可用于对过氧亚硝基定量检测的应用。

实施例八：二酚化合物(4)与2-醛基苯硼酸自组装对次氯酸和过氧亚硝基选择性检测应用。

取3μL二酚化合物(4)母液加入3mL磷酸缓冲液(10mM,pH＝8.0)中，加入30μL 2-醛基苯硼酸后形成自组装体系，再分别加入浓度100μM各种自由基(OH^·,¹O₂,ClO^-,H₂O₂,NO^·,NO₂^-,NO₃^-,O₂^·-,ONOO^-)，检测荧光强度变化，加入次氯酸和过氧亚硝基后荧光强度明显增强，参见图12。黑色柱对应加入不同自由基其在发射波长499nm处荧光强度值，参见图13。二酚化合物(4)与2-醛基苯硼酸自组装可用于对次氯酸和过氧亚硝基选择性检测应用。