一种脂肪SVF细胞临床级高效制备和冻存的方法及其用途

摘要

本发明公开了一种脂肪SVF细胞临床级高效制备和冻存的方法及其用途，该制备方法包含：步骤S1：在无菌条件下式采集脂肪样本，保存在保存液中，加入洗涤液对脂肪样本进行预处理；步骤S2：将预处理的脂肪样本离心，脂肪组织呈黄色，取出脂肪组织并加入等体积已预热的消化液，密封，在恒温条件下使脂肪组织和消化液混合均匀，消化至无大块组织块或虽有大块组织块但聚集大量脂质，离心；步骤S3：待步骤2离心结束，去除上层脂质，加入洗涤液将沉淀重悬混匀，过滤，再次添加洗涤液，离心，去除上清液，得到脂肪SVF细胞。本发明制备方法采用的洗涤液和消化液使得制备的脂肪SVF细胞的细胞数、细胞活率及纯度大幅度上升，保证提取的SVF细胞在临床治疗中的效果。

说明书

技术领域

本发明涉及一种脂肪SVF细胞的制备方法，具体涉及脂肪SVF细胞临床级高效制备和冻存的方法及其用途。

背景技术

成体干细胞是近来发现的一群存在于人体各组织器官内的具有多项分化潜能的干细胞。研究发现，人源脂肪来源的间充质干细胞（human Adipose-derived Stem cells，hASCs）作为种子细胞有诸多优点：（1）易于取材（只需通过负压真空抽脂）；（2）具有多方向的分化潜能；（3）脂肪间充质干细胞免疫原性低；（4）具有免疫抑制的调节作用。

脂肪SVF（Stromal Vascular Fraction，血管基质部分）细胞是从脂肪组织中分离富集出来的基质细胞群，去除了成熟的脂肪细胞，其中包含多种细胞成分，包括脂肪干细胞、内皮细胞、周细胞、成纤维细胞和少量未去除的成熟脂肪细胞。脂肪SVF细胞中的间充质干细胞在临床多个领域都有巨大的应用潜力。

在国内外多年研究中，脂肪SVF细胞已被证实具有结缔组织修复，免疫调节，表皮修复等生理功能。现有技术通常将脂肪组织经胶原酶消化、过滤、离心除去成熟脂肪细胞后得到脂肪SVF细胞。

但是，就目前技术而言，对于脂肪SVF细胞临床级应用的提取和制备还存在以下的不足：

1、传统胶原酶Ⅰ消化单一，胶原酶使用量多，SVF细胞纯度不高；

2、制备最后得到的SVF细胞数得率、细胞纯度及细胞活率不高，不适用于临床，保证不了临床治疗的效果。

发明内容

本发明的目的是提供一种脂肪SVF细胞临床级高效制备和冻存的方法及其用途，该制备方法能够解决现有技术胶原酶使用量大，以及细胞活率低，提取的SVF纯度不高等问题，能够减少胶原酶的使用量并提高细胞活率及SVF纯度，以保证在临床治疗时的应用效果。

为了达到上述目的，本发明提供了一种脂肪SVF细胞临床级高效制备方法，该制备方法包含：

步骤S1：在无菌条件下式采集脂肪样本，保存在保存液中，加入洗涤液对脂肪样本进行预处理；

步骤S2：将预处理的脂肪样本离心，脂肪组织呈黄色，取出脂肪组织并加入等体积已预热的消化液，密封，在恒温条件下使脂肪组织和消化液混合均匀，消化至无大块组织块或虽有大块组织块但聚集大量脂质，离心；

步骤S3：待步骤2离心结束，去除上层脂质，加入洗涤液将沉淀重悬混匀，过滤，再次添加洗涤液，离心，去除上清液，得到脂肪SVF细胞。

在步骤S1中，所述的洗涤液包含：生理盐水和人血白蛋白。

在步骤S2中，所述的消化液包含：人血白蛋白、0.9%生理盐水、氯化镁和混合胶原酶，所述的混合胶原酶的质量：人血白蛋白的体积：0.9%生理盐水的体积为1mg：1mL：15mL。

在步骤S1中，所述的保存液包含：氯化钠、青霉素和链霉素。

在所述的保存液中，所述的氯化钠采用0.9%生理盐水；所述的青霉素的浓度为100μg/mL；所述的链霉素的浓度为100μg/mL。

在步骤S1的洗涤液中，所述的人血白蛋白的质量分数为20%，所述的生理盐水和人血白蛋白的体积比为100:1。

在步骤S2的消化液中，所述的人血白蛋白为质量分数为20%的人血白蛋白，所述的氯化钠采用0.9%生理盐水；所述的氯化镁采用氯化镁水溶液，所述的人血白蛋白与氯化镁水溶液的体积比为1：29μL，所述的氯化镁水溶液的浓度为200mg/mL。

在步骤S2中，所述的消化液预热的温度为37℃。

本发明还提供了一种用脂肪SVF细胞制备的药物，该药物包含：脂肪SVF细胞，该脂肪SVF细胞通过如所述的脂肪SVF细胞临床级高效制备方法制备；该药物作为治疗骨关节炎的药物。

本发明还提供了一种用脂肪SVF细胞制备的药物制剂，该制剂包含：脂肪SVF细胞、生理盐水和白蛋白；所述的脂肪SVF细胞通过如所述的脂肪SVF细胞临床级高效制备方法制备；该药物制剂为治疗骨关节炎的药物制剂。

本发明还提供了一种脂肪SVF细胞的冻存方法，所述的冻存方法包含：

步骤S1’：用临床级DMSO和血清替代物混合配成冻存液；

步骤S2’：在脂肪SVF细胞中加入冻存液，充分混匀，加入到冻存管中密封；

步骤S3’：将冻存管进行程序降温，转移至-196℃液氮罐中保存。

其中，所述的脂肪SVF细胞通过如所述的脂肪SVF细胞临床级高效制备方法制备。

在步骤S1’中，所述的临床级DMSO和血清替代物的体积比为1：9。

在步骤S2’中，在冻存液中，所述的脂肪SVF细胞的浓度为1×10⁶/mL>6/mL。

在步骤S3’中，所述的程序降温的降温速度为0.1~99.9℃/min，温度从4℃降温至-80℃。

本发明的脂肪SVF细胞临床级高效制备和冻存的方法及其用途，解决现有技术胶原酶使用量大，以及细胞活率低，提取的SVF纯度不高等问题，具有以下优点：

（1）本发明的制备方法使用的消化液中含有氯化镁和白蛋白，氯化镁的使用提高了胶原酶的消化能力，同时也节省了胶原酶的使用体积，同时白蛋白使用防止细胞过度消化；

（2）本发明的消化液各组分的比例的控制能够使得制备脂肪SVF细胞中使用的胶原酶的较少，提高了制备的脂肪SVF细胞的纯度；

（3）本发明的洗涤液与常规的单一生理盐水或者PBS不同，本发明加入了人血白蛋白，人血白蛋白的使用在离心时候保护了细胞，又能防止细胞的过度消化；

（4）本发明制备的细胞经冻存复苏后，其细胞增值活性强。

附图说明

图1为本发明采用CCK8法测试的对比例1和实施例1制备的脂肪SVF细胞的活性结果图。

图2为本发明的方法冻存的细胞复苏后细胞显微图。

图3为对比例2的方法冻存的细胞复苏后活性测试结果图。

图4为本发明实施例1流式细胞检测的DAPI-SSC散点图。

图5为本发明实施例1流式细胞检测的SSC-FSC散点图。

图6为本发明实施例1流式细胞检测的分析图。

图7为对比例1流式细胞检测的DAPI-SSC散点图。

图8为对比例1流式细胞检测的SSC-FSC散点图。

图9为对比例1流式细胞检测的分析图。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明的技术方案做进一步的说明。

一种脂肪SVF细胞临床级高效制备的方法，该制备方法包含：

步骤S1：在无菌条件下式采集脂肪样本，加入洗涤液对脂肪样本进行预处理；

步骤S2：将预处理的脂肪样本离心，脂肪组织呈黄色，取出脂肪组织并加入等体积已预热的消化液，密封，在恒温条件下使脂肪组织和消化液混合均匀，消化至无大块组织块或虽有大块组织块但聚集大量脂质，离心；

步骤S3：待步骤2离心结束，去除上层脂质，加入洗涤液将沉淀重悬混匀，过滤，再次添加洗涤液，离心，去除上清液，得到脂肪SVF细胞。

在步骤S1中，洗涤液包含：0.9%生理盐水和人血白蛋白。该洗涤液与常规的单一生理盐水或者PBS不同，本发明加入了人血白蛋白，人血白蛋白的使用在离心时候保护了细胞，又能防止细胞的过度消化。

在步骤S2中，消化液包含：人血白蛋白、0.9%生理盐水、氯化镁和混合胶原酶。其中，混合胶原酶的质量：人血白蛋白的体积：0.9%生理盐水的体积：氯化镁水溶液的体积为1mg：1mL：15mL：29μL。

在步骤S1中，保存液包含：氯化钠、青霉素和链霉素。在保存液中，氯化钠采用生理盐水；青霉素的浓度为100μg/mL；链霉素的浓度为100μg/mL。

在步骤S1的洗涤液中，人血白蛋白的质量分数为20%，0.9%生理盐水和人血白蛋白的体积比为100:1。

在步骤S2的消化液中，人血白蛋白为质量分数为20%的人血白蛋白，其在消化液中的总体积浓度（配成消化液后人血白蛋白所占的浓度）为5%，氯化钠采用0.9%生理盐水；氯化镁采用氯化镁水溶液，该氯化镁水溶液的浓度为200mg/mL。使用浓度为每100mL消化液体积添加氯化镁溶液145μL，氯化镁的使用在于提高胶原酶消化能力,如果不使用，将影响脂肪的消化。

本发明的消化液各组分的比例的控制能够使得制备脂肪SVF细胞中使用的混合胶原酶的较少，提高了制备的脂肪SVF细胞的纯度。

在步骤S2中，消化液预热的温度为37℃。

一种用脂肪SVF细胞制备的药物，该药物包含：脂肪SVF细胞。该药物作为治疗骨关节炎的药物。

一种用脂肪SVF细胞制备的药物制剂，该制剂包含：脂肪SVF细胞、生理盐水和白蛋白，该药物制剂作为治疗骨关节炎的药物制剂。生理盐水和白蛋白的质量比为98：2，脂肪SVF细胞的浓度为0.5*10⁷/mL>8/mL。

一种脂肪SVF细胞的冻存方法，该冻存方法包含：

步骤S1’：用临床级DMSO和血清替代物混合配成冻存液；

步骤S2’：在脂肪SVF细胞中加入冻存液，充分混匀，加入到冻存管中密封；

步骤S3’：将冻存管进行程序降温，转移至-196℃液氮罐中保存。

步骤S2’中的脂肪SVF细胞通过如所述的脂肪SVF细胞临床级高效制备方法制备。

在步骤S1’中，临床级DMSO和血清替代物的体积比为1：9。

在步骤S2’中，在冻存液中，脂肪SVF细胞的浓度为1×10⁶/mL>6/mL。

在步骤S3’中，程序降温的降温速度为0.1~99.9℃/min，温度从4℃降温至-80℃。

对比例1

采用现有技术制备的人脂肪SVF细胞。

利用脂肪抽吸技术抽取健康成年女性大腿或腹部皮下脂肪组织，去除纤维结缔组织成分，置于离心管内，用PBS缓冲液清洗2～3次，加入等体积1％ I型胶原酶，37℃环境振荡消化30min，300×g（离心力）离心10 min，加入完全培养基：DMEM（dulbecco's modifiedeagle medium）培养基+ 10％FBS +1％双抗，终止消化，使用200目筛网过滤后300×g离心10 min，所得沉淀即为SVF（现有技术源于Conventional vs. micro-fat harvesting: Howfat harvesting technique affects tissue-engineering approaches using adiposetissue-derived stem/stromal cells. J Plast Reconstr Aesthet Surg，2013，66(9)：1271—1278）。

实施例1：

（1）样本筛选

脂肪供体的病史采集及检测：包括供者的基本信息、既往病史、家族史等。

既往史和家族史要对遗传病（单基因和多基因疾病，包括心血管疾病和肿瘤等）相关信息进行详细采集。

检验筛选证明无人源特定病毒（包括HIV、HBV、HCV、HTLV、EBV、CMV等）的感染，无梅毒螺旋体感染，必要时需要收集供者的ABO血型、HLA-I类和II类分型资料，以备追溯性查询。

（2）脂肪SVF细胞临床级高效制备的方法

实验材料准备：

保存液的配制：由0.9%生理盐水+100ug/mL青霉素+100ug/mL链霉素组成。

洗涤液的配制：500ml生理盐水，加入5ml的20%的人血白蛋白，充分混匀。

消化液的配制：取20%的人血白蛋白25mL，加入到75mL 0.9%生理盐水中，加入200mg/mL的氯化镁溶液145μL，充分混匀，得到混合液。吸取10mL混合液，加入到已经分装好的5mg混合胶原酶中（Liberase TM Research Grade,货号05401127001，厂家Roche），充分混匀后，吸出，与上述混合液混合，用0.22μL孔径的过滤器过滤消化液至50mL每管。

人脂肪SVF细胞的具体制备方法如下：

步骤S1：脂肪样本的供体经上述所有检测合格后，在医疗场所的无菌条件下进行脂肪样本采集，脂肪可采集的部位可选择：四肢、上下腹部、侧腰、臀部，采集方式选择吸脂术，用无菌注射器抽取，去除部分肿胀液，打入一次性的备用无菌容器中，无菌容器内装有保存液，将容器置于2-8℃的装运箱内，24小时内送至实验室。取脂肪组织100mL于225mL的离心管中，加入洗涤液，使混合液的终体积为150mL/管，对脂肪样本进行预处理；

步骤S2：将预处理的混合液400g在18℃下离心7min，用25mL移液管吸取下层中的脂肪组织移入新的225mL离心管中，剩余的废液弃掉，每管约75mL脂肪组织，并加入等体积已预热37℃的消化液，用封口膜封严，贴好标签，剧烈摇晃混合后放入37℃恒温水浴槽中，每分钟取出离心管摇晃一次，使脂肪组织与消化液充分混匀，消化20~30min，消化过程中观察消化进度，至无大块组织块或虽有大块组织块但聚集大量脂质，即可终止消化，用无尘布擦干离管后放入离心机中，400g离心7min，18℃；

步骤S3：待步骤2离心结束，去除上层脂质，，剩余部分添加洗涤液至40ml，将沉淀重悬混匀，准备好新的50mL离心管和100um细胞滤网（细胞滤网，货号119056，厂家FALCON），将重悬液过滤后，添加洗涤液至50mL/管，取400g在18℃下离心7min，去除上清液，得到脂肪SVF细胞。

本发明制备中使用的消化液，其白蛋白防止了细胞过度消化，而氯化镁提高了胶原酶的消化能力，同时也节省了胶原酶的使用体积。本发明100mL脂肪只需要5mg相当于每20mL脂肪只需要1mg胶原酶。

（3）测试细胞数和计算细胞活率

取500uL上述制备的脂肪SVF细胞进行细胞计数，并计算细胞活率。

细胞活率的结果为：对比例1细胞活率为90%~92%，实施例1细胞活率为95%~99%。

（4）不同制备方法制备的脂肪SVF细胞的活性测试

采用CCK8（Cell Counting Kit）法检测细胞活性的具体步骤如下：

第一步：在96孔板中接种细胞悬液（100μL/孔），将培养板放在培养箱中预培养（37℃，5% CO₂）；

第二步：向每孔加入10 μL CCK溶液（注意不要在孔中生成气泡，它们会影响OD值的读数）；

第三步：将培养板在培养箱内孵育1~4小时。

第四步：用酶标仪测定在450nm处的吸光度，若暂时不测定OD值（吸光度），可以向每孔中加入10 μL 0.1M的HCl溶液或者1% w/v（weight/volume） SDS溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下，在24小时内测定，吸光度不会发生变化。

CCK8法测试结果如下：

如图1所示，为本发明采用CCK8法测试的对比例1和实施例1制备的脂肪SVF细胞的活性结果图，A为本发明制备的SVF细胞，B为对比例1制备的SVF细胞，在培养120h时，本发明制备的SVF细胞的OD值能够达到0.8，对比例1的OD值能够达到0.3，显然本发明制备的SVF细胞活性更高。

（5）SVF细胞纯度流式检测方法

检验内容：CD34

合格标准：细胞表面标志物CD34限值＞10%

样本类型： SVF终产品

检测依据：文献Cytotherapy. 2013 June ; 15(6): 641–648.

检测方法：流式检测法

如图4所示，为本发明实施例1流式细胞检测的DAPI-SSC散点图，DAPI为荧光染料4',6-二脒基-2-苯基吲哚，可染色活细胞的DNA，用于计算活率，A代表面积，图中横坐标表示荧光强度，纵坐标表示细胞内部复杂程度，SSC的值越大说明细胞内部的颗粒越多，图中83.0%表示细胞活率。

如图5所示，为本发明实施例1流式细胞检测的SSC-FSC散点图，图中FSC为细胞大小，SSC为细胞折射率，图中横坐标表示细胞相对大小，纵坐标表示细胞内部复杂程度，图中27.2%表示有核细胞所占比例。

如图6所示，为本发明实施例1流式细胞检测的分析图，横坐标表示荧光强度，纵坐标表示细胞数目，APC（allophycocyamin，异位藻蓝蛋白；或称荧光藻蓝蛋白，FluorescencePhycocyanin，FPC）是藻红蛋白的一种，APC标记小鼠抗人CD34抗体。图中56.8%表示制备后SVF中，表达CD34的细胞占有核细胞的比例，B表示标准品曲线，C表示样本检测曲线。

如图7所示，为对比例1流式细胞检测的DAPI-SSC散点图，图中99.4%表示细胞活率。

如图8所示，为对比例1流式细胞检测的SSC-FSC散点图，图中3.91%表示有核细胞所占比例。

如图9所示，为对比例1流式细胞检测的分析图，17.9%表示制备后SVF中，表达CD34的细胞占有核细胞的比例，B表示标准品曲线，C表示样本检测曲线。

对比例2

根据文献现有方法制作的冻存SVF细胞，文献来源于《脂肪源性血管基质成分对皮肤光老化的影响》中国病理生理杂志Chinese Journal of Pathophysiology 2016，32（5），892-899。

实施例2

（1）人脂肪SVF细胞的冻存方法

人脂肪SVF细胞的冻存方法，该冻存方法包含：

步骤S1’：用临床级DMSO（二甲基亚砜，货号WAK-DMSO-10，厂家Cryosure）和血清替代物（KnockOut™ Serum Replacement，KSR，货号10828-028，厂家Gibco）按照1:9的体积比例混合配成冻存液；

步骤S2’：含有人脂肪SVF细胞的离心管中按1：1的比例缓慢加入上述冻存液，吹打混匀细胞，充分混匀，把混匀的细胞悬液加入到2mL冻存管中，每管加1.5mL，加完后拧紧盖子，封口膜封好，标记样本编号、姓名、冻存时间，将标记好的冻存管放入冻存盒中；

步骤S3’：冻存盒的样本放置在程序降温仪中，进行程序降温，程序降温的速度范围为0.1-99.9℃/min，温度从4℃程序降温到-80℃后，直接转移到-196℃的液氮罐中保存。

（2）人脂肪SVF细胞的复苏

复苏细胞一般采用快速融化法，具体如下：

佩戴眼镜和手套，从液氮罐中取出冻存细胞，迅速放入38℃水浴中，并不时摇动，在1分钟内使其完全融化，然后在无菌下取出细胞。在1200r/min速度下离心5～10分钟，弃去上层液，加入适量培养液后接种于培养瓶中，接种浓度1×10⁵/mL，置于37℃温箱静置培养，4-7天常规换液，传代培养得到脂肪间充质干细胞。

采用CCK8（Cell Counting Kit）法检测细胞活性，检测步骤参照前述CCK8法。本发明的冻存方法和对比例2的冻存方法的细胞复苏后活性测试结果，具体如下：

如图2所示，为本发明的方法冻存的细胞复苏后活性测试结果图，如图3所示，为对比例2的方法冻存的细胞复苏后活性测试结果图，通过比较可以看到本发明的方法冻存的人脂肪SVF细胞复苏后的细胞增值活性更强。

实施例3

一种药物制剂，该制剂包含：脂肪SVF细胞、生理盐水和白蛋白；其中，生理盐水和白蛋白的质量比为98：2。

该人脂肪SVF细胞通过实施例1所述的人脂肪SVF细胞临床级高效制备方法制备。脂肪SVF细胞的浓度为0.5*10⁷/ mL>8/mL。

该药物作制剂为治疗骨关节炎的药物制剂，其使用剂量按照临床治疗使用剂量，使用剂量在单次1*10⁸/2mL>8/2mL。

综上所述，本发明的人脂肪SVF细胞临床级高效制备和冻存的方法及其用途，该制备方法采用的洗涤液和消化液使得制备的脂肪SVF细胞的细胞活率高，纯度也得到了提高。

尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。