以聚离子多糖作为大分子交联剂的温度‑pH敏感嵌段纳米水凝胶的制备方法

摘要

本发明涉及用于生物医药领域的纳米水凝胶的制备技术领域，具体涉及一种利用聚离子多糖为大分子交联剂的温度‑pH双刺激响应嵌段纳米凝胶的制备方法，纳米凝胶的直径在常温下为50‑200nm，其相转变温度为37 oC，pH响应区间为6.8‑8.7。

说明书

技术领域

本发明涉及用于生物医药领域的纳米水凝胶的制备技术领域，具体涉及一种利用聚离子多糖为大分子交联剂的温度-pH双刺激响应的嵌段纳米水凝胶的制备方法。

背景技术

水凝胶是一种介于液体和固体之间的能显著溶胀但不溶解于水的一类物质，通过物理作用(范德华力、氢键作用力和疏水作用等)或化学键力连接而成，是最接近于人体各种组织细胞的形态。大体积的水凝胶通常对外部环境的刺激感应慢，阻碍了其更好的应用。智能纳米水凝胶又称刺激响应性纳米水凝胶，是粒径在1-1000nm，能稳定分散在水中，具有刺激响应速度快、比表面大、表面功能基团多的水凝胶粒子，在药物输送与可控释放、医学诊断、生物敏感器、催化剂载体、水处理和油气开发等领域显示出了诱人的应用前景。温度和pH是生物和化学系统中十分重要的两种环境条件，在响应型凝胶中，最典型也是研究应用最广的为温度和pH敏感水凝胶。侧链含有氨基或醚脂基的聚丙烯酰胺类高分子是具有温度敏感性的一类聚合物，其中的聚N-异丙基丙烯酰胺(PNIPA)的最低临界溶解温度为32℃左右，接近人体生理温度。而含有易水解或质子化的酸、碱基团(如羧基、酰胺基、磷酸基或氨基等)的聚合物具有pH响应特性。利用纳米水凝胶的体积随温度和pH变化的性质可以方便地调节和控制凝胶内药物的扩散和释放速率。

目前已有一些关于温度和pH敏感的纳米水凝胶专利，如公开号CN1718616A的中国专利公开了一种以温敏性多糖类为核和pH敏感性丙烯酸类为壳的纳米水凝胶，其不仅对温度和pH的变化能快速响应，还具有一定的强度，适用于某些蛋白质、酶以及其他活性生物大分子的分离、纯化和药物控释。在已发表的专利和文献中，主要采用的交联剂是两端含有碳碳双键(CH₂＝CH-)的链状有机类小分子化合物，如N，N’-亚甲基双丙烯酰胺(BIS)。但是，化学交联纳米水凝胶虽然具有高度亲水性和胶体稳定性，但是在体内不易降解。为了改善纳米水凝胶的降解性问题，公开号CN101638485A的中国专利公开了一种可降解PNIPAM/CMCS微凝胶的合成方法，可应用于药物释放体系、蛋白分离和纯化等生物医学领域。公开号为CN103145914A的中国专利则利用有机交联剂BIS和无机纳米粘土为共交联剂制备出高强度、可对pH和温度快速响应的纳米复合水凝胶，但是纳米粘土表面带负电荷，而侧面带有正电荷微粒，会因粘土的聚集严重而影响微凝胶的合成。

较之传统的化学交联体系，离子交联体系具有无毒、可逆、易反应(几分钟)和易移除的优点，成为目前研究的一个热点方向。Armes和McCormick两个研究组将合成的高分子聚电解质用作离子交联剂，在单一水溶液中获得了具有环境响应性的离子交联纳米胶束或囊泡，该方法在制备过程中无毒性，并避免了副产物的产生，制备的纳米水凝胶具有环境敏感性，在盐存在情况下可以可逆解离。[Li,Y.；Lokitz,B.S.；McCormick,C.L.,Thermally responsive vesicles and their structural"locking"through polyelectrolyte complex formation.Angew.Chem.-Int.Edit.,2006,45:5792-5795；(b)Lokitz,B.S.；Convertine,A.J.；Ezell,R.G.；Heidenreich,A.；Li,Y.T.；McCormick,C.L.,Responsive nanoassemblies via interpolyelectrolyte complexation of amphiphilic block copolymer micelles.Macromolecules,2006,39:8594-8602]。天然聚离子多糖，具有无毒、良好的生物相容性和生物可降解性，可以作为大分子交联剂来制备离子交联的纳米水凝胶。其中壳聚糖(Chitosan)又称脱乙酰甲壳素，分子中带有游离氨基，在酸性溶液中易成盐，呈阳离子性质，是壳聚糖的许多生物学特性及加工特性的基础；海藻酸钠是从褐藻类的海带或马尾藻中提取的，由β-D-甘露糖醛酸(M单元)和α-L-古洛糖醛酸(G单元)单元通过1，4-糖苷键而成的天然聚阴离子多糖的钠盐，由于海藻酸盐的生物相容性、低毒性和相对低廉的价格,被广泛地应用于药物释放体系和组织工程领域；卡拉胶(Carrageen)，又名角叉菜胶、鹿角藻胶、爱尔兰苔菜胶，是由半乳糖及脱水半乳糖所组成的多糖类硫酸酯的钙、钾、钠、铵盐，是另一种天然聚阴离子多糖。

发明内容

针对现有技术中存在的不足，本发明的目的在于利用具有pH敏感的高分子单体与温度敏感的高分子单体在有机溶剂中进行嵌段聚合反应，然后采用聚离子多糖为大分子交联剂在温度和离子诱导下形成规整的温度-pH敏感纳米水凝胶粒子(直径为50-200nm)，相转变温度为37℃，pH响应区间为6.8-8.7。

本申请的发明构思如下：

首先经可逆加成断裂链转移技术(reversible addition fragmentation chain transfer polymerization,RAFT)合成温度-pH双重敏感嵌段聚合物，其中温敏链段为聚N，N-二乙基丙烯酰胺、聚N-乙烯基己内酰胺(PVCL)、聚N-异丙基丙烯酰胺等；pH敏感链段为聚甲基丙烯酸二甲氨基乙酯(PDMAEMA)、聚甲基丙烯酸二乙氨基乙酯(PDEAEMA)、聚丙烯酸等。

所述的温度-pH双重敏感纳米水凝胶是利用温度-pH敏感嵌段聚合物与聚阴离子大分子交联剂的静电相互作用而制得。

所述大分子交联剂为含有羧基/磺酸基/氨基等的天然聚多糖。

所述大分子交联剂在温度和离子诱导下，制备壳交联和核交联的纳米水凝胶。

具体是，利用RAFT方法先合成pH敏感高分子，再添加温敏性单体，制备温度-pH敏感嵌段聚合物，然后在酸性条件下，1)在50℃条件下，加入聚离子大分子交联剂，形成以温敏性部分为核，交联的pH敏感部分为壳的纳米凝胶。2)或者在常温，加入聚离子大分子交联剂，在离子诱导下形成以交联的pH敏感部分为核，温敏性部分为壳的纳米水凝胶。

更具体的，本发明通过以下技术方案来实现：

一种以聚离子多糖作为大分子交联剂的温度-pH敏感嵌段纳米水凝胶的制备方法，其步骤如下：

先由温敏单体和pH敏感单体在有机溶剂中进行嵌段聚合反应，然后向所得嵌段聚合物中加入聚离子多糖大分子交联剂，在温度或离子诱导下最终形成核壳结构的，平均粒径为50-200nm，相转变温度为37℃，pH响应区间为6.8-8.7的纳米水凝胶；

所述温敏单体为含氨基或醚酯的烯烃衍生物，优选为N-异丙基丙烯酰胺(NIPA)；

所述pH敏感单体为含有羧基、磺酸基和/或磷酸基等阴离子基团或含有可质子化的阳离子基团的单体，优选为甲基丙烯酸二甲氨基乙酯(DMAEMA)或甲基丙烯酸二乙氨基乙酯(DEAEMA)；

所述聚离子多糖大分子交联剂为含有羧基、磺酸基和/或氨基的天然聚多糖，优选为海藻酸钠、卡拉胶或壳聚糖；

进一步，所述卡拉胶为卡拉胶钠盐，优选K型。

所述嵌段聚合反应的方法，具体步骤依次是：

a、将pH敏感单体、引发剂、链转移剂加入到二氧六环溶剂中,所述pH敏感单体、引发剂、链转移剂三者的摩尔比为(50-250):0.25:(0.75-1.25)，优选为(100-150):0.25:1；

b、经抽真空除水除氧后，用油浴加热到70℃；

c、24小时后用冰水冷却终止反应；

d、在沉淀溶剂中纯化处理、干燥后，向所得产物中加入温敏单体和引发剂(两者摩尔比为3000-500:1，优选为1000:1)，溶于二氧六环溶剂中继续进行嵌段聚合，反应温度为70℃，时间24-48小时；

e、冰浴冷却后经沉淀溶剂纯化处理，再用透析袋除去小分子，最后冷冻干燥得嵌段聚合物。

所述引发剂为水溶性偶氮引发剂V-501；

所述链转移剂为4-氰基戊酸二硫代苯甲酸(CPADB)；

所述步骤d中温敏单体与步骤a中pH敏感单体的摩尔比为(0.1-10)：1,优选为(0.1-3)：1；

所述聚离子多糖大分子交联剂中糖单元与步骤a中pH敏感单体的摩尔比为1：(1-2)，优选为1：1；

所述步骤d和e中沉淀溶剂选自庚烷或正己烷；

其中优选情况为，当pH敏感单体为DMAEMA时，沉淀溶剂选庚烷；当pH敏感单体为DEAEMA时，沉淀溶剂选正己烷。所述加入聚离子多糖大分子交联剂最终得到纳米水凝胶的操作如下：

将嵌段聚合反应所得嵌段聚合物溶于水中得聚合物浓度为0.1wt％的水溶液，用氘代盐酸调节pH＝4.7-5.2，然后进行如下处理之一：

A、加热至50℃，加入聚离子多糖大分子交联剂，搅拌48h后得到稳定的以温敏链段为核，交联的pH敏感链段为壳的纳米水凝胶；

B、直接在常温下加入聚离子多糖大分子交联剂，搅拌15分钟后得到稳定的以交联的pH敏感链段为核，温敏链段为壳的纳米水凝胶。

与现有技术相比，本发明技术方案具有以下优点和有益效果：

1、本发明的温度-pH敏感纳米水凝胶具有核壳结构，大分子交联剂既可以交联壳，也可以交联核。在温度高于LCST时，可以获得壳交联的纳米水凝胶，其中温敏部分为核，pH敏感部分为壳，平均粒径约200nm；在常温条件下，在离子诱导下形成核交联的纳米凝胶，其中温敏部分为壳，pH敏感部分为核，平均粒径约50-60nm。

2、本发明制备的离子交联纳米水凝胶具有温度和pH敏感性(见图5，6)，并在盐的作用下可以解离(见图7)，其相转变温度接近人体的生理温度，在药物的控释、生物敏感器等生物医用领域有巨大的应用潜力；

3、相比常用的有机小分子交联剂，天然高分子作为交联剂具有无毒，生物相容性好以及成本低的优势。

附图说明

图1为实施例1制备的壳交联纳米水凝胶在323K的电镜图；从图中可以看出所得壳交联纳米水凝胶为粒径40-100nm左右的球状颗粒。

图2为实施例1制备的壳交联纳米水凝胶用激光粒度仪测定的粒径分布图；从图中可以看出所制备的壳交联纳米水凝胶流体力学粒径(R_h)范围在100到300nm之间。

图3为实施例3制备的核交联纳米水凝胶在298K(常温)的电镜图；从图中可以看出所制备的核交联纳米水凝胶为粒径40-50nm左右的近似球状颗粒。

图4为实施例3制备的核交联纳米水凝胶在298K(常温)用激光粒度仪测定的粒径分布图；从图中可以看出所制备的核交联纳米水凝胶流体力学粒径(R_h)范围在30到100nm之间。

图5为一维NMR氢谱测得的实施例2制备的壳交联凝胶(PDEAEMA-b-PNIPA)在25-50℃范围内的温敏行为；其中PNIPA侧链质子信号(化学位移3.8ppm处信号)的相变温度在37℃(面积降到一半处)，说明所制备的壳交联纳米凝胶的温度相转变接近人体的生理温度。

图6为一维NMR氢谱测得的实施例2制备的壳交联凝胶(PDEAEMA-b-PNIPA)在3-11pH范围内的相变行为；其中PDEAEMA侧链质子信号(化学位移3.2ppm处信号)在酸性条件下处于溶胀状态，在pH 6.8-8.7范围内发生相变，在碱性条件下保持收缩状态。

图7为实施例2制备的壳交联凝胶(PDEAEMA-b-PNIPA)用激光粒度仪测定的粒径分布随NaCl浓度变化图；从图中可以看出，向所得纳米凝胶溶液中加入一定比例的NaCl,由于离子强度增强，凝胶粒径分布先略微变窄，继续加入NaCl到一定浓度时，凝胶发生解离，粒径变成15nm左右，说明所制备的壳交联纳米凝胶具有盐离解性。

具体实施方式

通过下述实施方式将有助于理解本发明，但并不限制本申请权利要求书请求保护的范围。

实施例1：

一种以聚离子多糖作为大分子交联剂的温度-pH敏感嵌段纳米水凝胶的制备方法：

将10.6g pH敏感单体DMAEMA、43.5mg水溶性偶氮引发剂V501、173.3mg链转移剂CPADB溶于16ml二氧六环，然后加入到50ml三口瓶中，经三次抽真空充氮气循环除去水和氧后，用油浴加热至70℃，反应24小时后冰水冷却终止反应。在庚烷中沉淀纯化处理二次后，真空干燥直到制备的PDMAEMA质量不变(产率76％)。然后将干燥好的1.04g PDMAEMA、2.41g温敏单体NIPA和6.3mg水溶性偶氮引发剂V501溶于14mL二氧六环，继续进行嵌段聚合，反应温度为70℃，反应时间为24小时。冰浴冷却后经庚烷沉淀，并在20kDa透析袋中透析除去小分子，然后进行冷冻干燥，得到PDMAEMA-b-PNIPA聚合物。最后，将PDMAEMA-b-PNIPA聚合物溶于水中得聚合物浓度为0.1wt％的水溶液，用20wt％氘代盐酸调节pH＝4.8,加热至50℃，加入海藻酸钠(海藻酸钠糖单元：原料pH敏感单体DMAEMA摩尔比＝1：2)，搅拌48h后得到稳定的以PNIPA为核，交联的PDMAEMA为壳的纳米凝胶，该纳米凝胶的电镜图见图1，粒径分布见图2。

实施例2：

一种以聚离子多糖作为大分子交联剂的温度-pH敏感嵌段纳米水凝胶的制备方法：

将12g pH敏感单体DEAEMA、43.5mg水溶性偶氮引发剂V501、173.3mg链转移剂CPADB溶于16ml二氧六环，然后加入到50ml三口瓶中，经三次抽真空充氮气循环除去水和氧后，用油浴加热至70℃，反应24小时后冰水冷却终止反应。在正己烷中沉淀纯化处理二次后，真空干燥直到制备的PDEAEMA质量不变(产率72％)。然后将干燥好的1.02g PDEAEMA、2.41g温敏单体NIPA和6.3mg水溶性偶氮引发剂V501溶于14mL二氧六环，继续进行嵌段聚合，反应温度为70℃，反应时间为48小时。冰浴冷却后经正己烷沉淀，并在20kDa透析袋中透析除去小分子，然后冷冻干燥，得到PDEAEMA-b-PNIPA聚合物。最后，将PDEAEMA-b-PNIPA聚合物溶于水中得聚合物浓度为0.1wt％的水溶液，用20wt％氘代HCl调节pH＝5.0,加热至50℃，加入海藻酸钠(海藻酸钠糖单元：原料pH敏感单体DEAEMA摩尔比＝1：2)，搅拌48h后得到稳定的以PNIPA为核，交联的PDEAEMA为壳的纳米凝胶。该纳米凝胶的粒径分布随NaCl浓度的变化见图7。该纳米水凝胶具有温度和pH敏感性，常温下在pH和盐的作用下可以可逆解离(见图5，6，7)。

实施例3：

一种以聚离子多糖作为大分子交联剂的温度-pH敏感嵌段纳米水凝胶的制备方法：

将21.2g pH敏感单体DMAEMA、43.5mg水溶性偶氮引发剂V501、173.3mg链转移剂CPADB溶于16ml二氧六环，然后加入到50ml三口瓶中，经三次抽真空充氮气循环除去水和氧后，用油浴加热至70℃，反应24小时后冰水冷却终止反应。在庚烷中沉淀纯化处理二次后，真空干燥直到制备的PDMAEMA质量不变(产率78％)。然后将干燥好的1.04g PDMAEMA、4.82g温敏单体NIPA和6.3mg水溶性偶氮引发剂V501溶于14mL二氧六环，继续进行嵌段聚合，反应温度为70℃，反应时间为24小时。冰浴冷却后经庚烷沉淀，并在20kDa透析袋中透析除去小分子，然后进行冷冻干燥，得到PDMAEMA-b-PNIPA聚合物。最后，将PDMAEMA-b-PNIPA聚合物溶于水中得聚合物浓度为0.1wt％的水溶液，用20wt％氘代HCl调节pH＝5.2,常温下加入海藻酸钠(海藻酸钠糖单元：原料pH敏感单体DMAEMA摩尔比＝1：1)，搅拌15分钟后得到稳定的以交联的PDMAEMA为核，PNIPA为壳的纳米凝胶，该纳米凝胶的电镜图见图3，粒径分布见图4。

实施例4：

一种以聚离子多糖作为大分子交联剂的温度-pH敏感嵌段纳米水凝胶的制备方法：

将6g pH敏感单体DEAEMA、43.5mg水溶性偶氮引发剂V501、173.3mg链转移剂CPADB溶于16ml二氧六环，然后加入到50ml三口瓶中，经三次抽真空充氮气循环除去水和氧后，用油浴加热至70℃，反应24小时后冰水冷却终止反应。在正己烷中沉淀纯化处理二次后，真空干燥直到制备的PDEAEMA质量不变(产率71％)。然后将干燥好的1.02g PDEAEMA、12.1g温敏单体NIPA和6.3mg水溶性偶氮引发剂V501溶于14mL二氧六环，继续进行嵌段聚合，反应温度为70℃，反应时间为24小时。冰浴冷却后经正己烷沉淀，在20kDa透析袋中透析除去小分子，然后进行冷冻干燥，得到PDEAEMA-b-PNIPA聚合物。最后，将PDEAEMA-b-PNIPA聚合物溶于水中得聚合物浓度为0.1wt％的水溶液，用20wt％氘代HCl调节pH＝4.7,常温下，加入海藻酸钠(海藻酸钠糖单元：原料pH敏感单体DEAEMA摩尔比＝1：1)，搅拌15分钟后得到稳定的以交联的PDEAEMA为核，PNIPA为壳的纳米凝胶。

实施例5:

一种以聚离子多糖作为大分子交联剂的温度-pH敏感嵌段纳米水凝胶的制备方法：

将实施例2中制备的PDEAEMA-b-PNIPA聚合物溶于水中得聚合物浓度为0.1wt％的水溶液，用20wt％氘代HCl调节pH＝5.2，加热至50℃，加入卡拉胶钠盐(卡拉胶钠盐糖单元：原料pH敏感单体DEAEMA摩尔比＝1：2)，搅拌48h后得到稳定的以温敏性PNIPA为核，交联的PDEAEMA为壳的纳米凝胶。

本实施例所用卡拉胶钠盐为K型。

实施例6:

一种以聚离子多糖作为大分子交联剂的温度-pH敏感嵌段纳米水凝胶的制备方法：

将实施例2中制备的PDEAEMA-b-PNIPA聚合物溶于水中得聚合物浓度为0.1wt％的水溶液，用20wt％氘代HCl调节pH＝5.0，常温下，加入卡拉胶钠盐(卡拉胶钠盐糖单元：原料pH敏感单体DEAEMA摩尔比＝1：1)，搅拌15分钟后得到稳定的以交联的PDEAEMA为核，温敏性PNIPA为壳的纳米凝胶。

本实施例所用卡拉胶钠盐为K型。