microRNA‑1254及其种子基序和非种子序列在抑制肿瘤恶性增殖中的应用

摘要

本发明公开了microRNA‑1254、含其种子基序和/或非种子序列的小RNA序列及其药物组合物在制备用于治疗肿瘤的药物中的用途。经研究发现，microRNA‑1254可以抑制非小细胞肺癌细胞株NCI‑H1975和A549的细胞活力，并在肺癌A549裸鼠移植瘤模型中显著抑制裸鼠的肿瘤生长；在本发明中所发现的microRNA‑1254抗肿瘤具体作用机制是microRNA‑1254通过其种子基序与血红素氧化酶1mRNA的3’‑非翻译区结合、并通过其非种子序列与转录因子激活蛋白2αmRNA的3’‑UTR结合，从而抑制HO‑1和其转录因子TFAP2α的蛋白水平，最终达到抑制肿瘤生长的目的。

说明书

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及microRNA-1254(miR-1254)、含其种子基序和/或非种子序列的小RNA序列及其药物组合物在制备用于抑制和/或治疗肿瘤的药物中的用途。

背景技术

血红素加氧酶1(heme oxygenase-1，HO-1)是血红素代谢的限速酶，它催化游离血红素释放出胆绿素、CO和Fe²⁺，胆绿素在胆绿素还原酶作用下生成胆红素[Proc>

microRNAs是一类长约22nt，在机体内发挥着调节基因转录和翻译的内源性非编码单链RNA分子。这类小RNA分子不仅可以通过与靶基因mRNA配对来诱导蛋白编码基因的转录后抑制，还可以以直接或间接的方式对基因的转录水平发挥激活或抑制作用，从而参与调控细胞的多种生理过程，包括增殖、分化、凋亡和代谢[Cell.2004；116(2):281-97]。HO-1作为一个在肿瘤发生发展中发挥了重要作用的基因，有很多miRNA可以调控其表达。JoanD.Beckman等人研究发现，在HEK293细胞中，miR-377与miR-217均能通过其种子区序列直接与HO-1的3’UTR结合，从而联合抑制HO-1蛋白的表达[Journal of Biological Chemistry2011；286:3194-3202]。本发明的发明人研究也发现，miR-1304能够通过其种子区序列靶向HO-1的3’UTR，继而通过下调HO-1的表达抑制非小细胞肺癌(NSCLC)细胞的生长[ActaPharmacol Sin.2017；38:110-119]。另外，miRNA还可以通过抑制HO-1进而增强癌细胞对化疗药物的敏感性。例如，在肾细胞癌中，miR-220c能够通过抑制HO-1的表达缓解癌细胞对索拉替尼和伊马替尼的耐药作用[Neoplasma 2014；61:680-689]。

此外，转录因子也是调控HO-1水平的另一个重要因素。目前，关于HO-1转录水平的调控元件有核因子-E2相关因子2(Nrf2)[Antioxid Redox Signal 2008；10:1767-1812.AmJ Respir Cell MolBiol 2007；36:166-174]、激活蛋白1(AP-1)[J BiolChem 1992；267:21894-21900]、上游激活因子(USF)[Nucleic Acids Res 1993；21:1103-1109]、核转录因子κB和转录因子激活蛋白2(transcriptional factor AP-2α，TFAP2α)[BiochimBiophysActa 1999；1447:231-235]等。作为HO-1转录的重要调控因子，TFAP2α参与调控了各种肿瘤的发生发展。有报道发现，在黑色素瘤、前列腺癌、卵巢癌、神经胶质瘤和结直肠腺癌中，TFAP2α在核质内分布比例的改变是与肿瘤的恶化和患者致死率的提高密切相关的。而且，TFAP2α的表达量在乳腺癌中与雌激素受体以及人表皮生长因子受体II的表达量呈明显的相关性[Int J BiochemCellBiol.2013；45(8):1647-56]。这也进一步提示，调控TFAP2α的水平也是肿瘤治疗的潜在策略之一。

发明内容

本发明人研究发现了microRNA-1254的种子基序对HO-1的抑制作用以及其非种子序列对TFAP2α的抑制作用，揭示了microRNA-1254、含其种子基序和/或非种子序列的小RNA序列及其药物组合物在制备用于抑制肿瘤增殖的药物中的用途。

具体地，本发明经过实验验证，发现microRNA-1254可以抑制非小细胞肺癌(non-small celllung cancer，NSCLC)细胞株NCI-H1975和A549的细胞活力，并在肺癌A549裸鼠移植瘤模型中显著抑制裸鼠的肿瘤生长；同时发现该过程的具体作用机制是microRNA-1254通过其种子基序“GCCUGGA(SEQ ID NO:1)”与HO-1mRNA的3’-UTR结合、并通过其非种子序列“UGGAGCCU(SEQ ID NO:2)”与TFAP2αmRNA的3’-UTR结合，从而抑制HO-1和TFAP2α的蛋白水平，最终达到抑制肿瘤生长的目的。

因此，本发明的目的在于提供了microRNA-1254、含其种子基序和/或非种子序列的小RNA序列及其药物组合物在治疗肿瘤方面的用途。其作用机制包括但不限于microRNA-1254对HO-1和TFAP2α的抑制作用。

一个方面，本发明提供了含有SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2的小RNA序列在制备用于治疗肿瘤的药物中的用途。

另一个方面，本发明提供了microRNA-1254在制备用于治疗肿瘤的药物中的用途。

再一个方面，本发明提供了含有SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2的小RNA序列在制备用于抑制肿瘤增殖的药物中的用途。

又一个方面，本发明提供了microRNA-1254在制备用于抑制肿瘤增殖的药物中的用途。

还一个方面，本发明提供了microRNA-1254或含有SEQ ID NO:1的小RNA序列在制备用于靶向HO-1抑制肿瘤增殖的药物中的用途。

又一个方面，本发明提供了microRNA-1254或含有SEQ ID NO:2的小RNA序列在制备靶向TFAP2α的抑制肿瘤增殖的药物中的用途。

本文中，所述的小RNA是指长度在22-25nt的非编码RNA，包括但不限定于microRNA，siRNA，small RNA，piRNA等。

本发明的上述用途中，所述肿瘤可以是HO-1高表达的肿瘤，特别是黑色素瘤、神经胶质瘤、胰腺癌、前列腺癌和肺癌等；和/或，所述肿瘤可以是TFAP2α活性异常的各种类型的肿瘤，特别是黑色素瘤、乳腺癌、神经胶质瘤、结直肠腺癌、前列腺癌和卵巢癌等。

本发明的又一个目的是提供一种用于治疗肿瘤的药物组合物，其包含：(a)治疗有效量的化疗药物；和(b)治疗有效量的小RNA序列，其中，所述小RNA序列包括microRNA-1254，其核苷酸序列如下：5’-AGCCUGGAAGCUGGAGCCUGCAGU-3’(SEQ ID NO:3)；和/或，其他的含有SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2的小RNA序列。

本发明中，所述肿瘤指的是机体在各种致癌因素作用下，局部组织的某一个细胞在基因水平上失去对其生长的正常调控，导致其克隆性异常增生而形成的异常病变。

本发明中，所述化疗药物，指的是对病原微生物、寄生虫、某些自身免疫性疾病、恶性肿瘤所致疾病的治疗药物。化疗药物可杀灭肿瘤细胞，这些药物能作用在肿瘤细胞生长繁殖的不同环节上，抑制或杀死肿瘤细胞。众所周知，化疗药物治疗是目前治疗肿瘤的主要手段之一。本发明中，所述化疗药物可为本领域中通常施用的任何化疗药物。优选地，所述治疗有效量的化疗药物可以是指临床上已有的肺癌化疗药物，例如：环磷酰胺(CTX)、异环磷酰胺(IFO)、阿霉素(ADM)、长春新碱(VCR)、长春花碱(VBL)、依托泊甙(VP16)、威猛(Vumon)、卡铂(CBP)和甲氨蝶呤(MTX)等。

本发明中，优选地，所述药物组合物可以进一步包含药用载体。所述药用载体可为本领域中通常使用的。

本发明中，术语“有效量”可指为实现预期的效果所需的剂量和时段的有效的量。此有效量可能因某些因子而产生不同的变化，如疾病的种类或治疗时疾病的病症、被施用的特定标的器官的构造、病人个体大小、或疾病或症状的严重性。本领域具有通常知识者不需要过度实验即可凭经验决定特定化合物的有效量。

本发明人首先使用多个在线数据库(TargetScan、miRanda、PITA)预测能够结合在HO-1基因的3’-UTR的microRNAs(miRNAs)，发现microRNA-1254可以结合到HO-1基因的3’-UTR，并且与3’-UTR发生序列匹配结合的是其种子基序“GCCUGGA”。经实验证明，miR-1254可引起HO-1mRNA 3’-UTR荧光素酶报告系统的荧光素酶活性降低；突变结合位点的序列后，miR-1254对HO-1mRNA3’-UTR荧光素酶报告系统的荧光素酶活性降低作用逆转。在培养的非小细胞肺癌A549细胞中，miR-1254可引起HO-1蛋白水平表达下降。上述结果说明miR-1254可以通过其种子基序“GCCUGGA(SEQ ID NO:1)”与HO-1的3’-UTR的特定位点结合，显著下调HO-1表达。

本发明人随后还发现miR-1254可以通过其非种子序列“UGGAGCCU(SEQ ID NO:2)”结合到HO-1基因的转录因子TFAP2α的3’-UTR。经实验证明，miR-1254可引起TFAP2αmRNA3’-UTR荧光素酶报告系统的荧光素酶活性降低；突变结合位点的序列后，miR-1254对TFAP2αmRNA 3’-UTR荧光素酶报告系统的荧光素酶活性降低作用逆转。在培养的A549细胞中，miR-1254可引起TFAP2α蛋白水平表达下降。上述结果说明miR-1254可以通过其非种子序列“UGGAGCCU(SEQ ID NO:2)”与TFAP2α的3’-UTR的特定位点结合，显著下调TFAP2α表达。

本发明人随后在细胞水平评价了miR-1254的抗肿瘤活性，采用人非小细胞肺癌细胞株NCI-H1975和A549，转染miR-1254模拟物，观察miR-1254对细胞增殖的作用，结果发现microRNA-1254可以抑制NCI-H1975和A549的细胞活力。在动物水平的活性评价中，利用慢病毒建立稳定高表达miR-1254的A549细胞株，将稳定高表达miR-1254的细胞株和阴性对照组细胞株分别在裸鼠上进行皮下注射，发现miR-1254对非小细胞肺癌皮下移植瘤具有抑制生长的作用。

本发明中，所述TargetScan数据库为http://www.targetscan.org/，miRanda数据库为http://www.microrna.org/，PITA数据库为http://davinci.crg.es/。这些数据库是目前应用最广泛且在科研领域、药物开发领域认可程度最高的数据库。本发明使用这些数据库可以保证预测的准确性与可靠性。

本发明中所使用的人非小细胞肺癌细胞株NCI-H1975和A549是在科研以及药物开发领域常用的细胞系。

附图说明

图1为显示miR-1254通过结合于HO-1的3’-UTR下调HO-1蛋白表达的图。其中：

(A)为HO-1 3’-UTR与miR-1254种子序列区的结合位点序列(见竖线处)，HO-13’-UTR突变系列和miR-1254系列突变序列示意图：HO-1 3’UTR序列：5’…CCCAACGAAAAGCACATCCAGGCA…3’，其中，下划线为HO-1>CTTGAATA…3，其中，下划线为HO-1>CGGACCTAGCUGGAGCCUGCAGU…3’(SEQ>GAUCAAGACCUGCAGU…3’(SEQ>UCAUGAU…3’(SEQ>

(B)显示了荧光素酶报告基因实验的结果。该实验显示miR-1254抑制HO-1 3’UTR活性，但不能抑制HO-1 3’UTR突变体(3’-UTR MUT)的活性。归一化萤光素酶活性：以阴性对照(NC，核苷酸序列：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT-3’(SEQ ID NO:8))为1，对各组的萤光素酶活性进行归一化处理，从而得到归一化萤光素酶活性水平。*：表示与NC+HO-1 3’UTR组相比的统计学差异，***p<0.001。^#：表示与miR-1254+HO-13’UTR组相比的统计学差异，^###p<0.001。

(C)显示了荧光素酶报告基因实验的结果。该实验显示miR-1254种子序列的突变体(miR-1254 5mt)不能抑制HO-1 3’-UTR活性，但其非种子序列的突变体(miR-1254mmt和miR-1254 3mt)依旧可以发挥抑制作用。归一化萤光素酶活性：以阴性对照(NC，核苷酸序列：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT-3’(SEQ ID NO:8))为1，对各组的萤光素酶活性进行归一化处理，从而得到归一化萤光素酶活性水平。*：表示与NC组相比的统计学差异，***p<0.001。^#：表示与miR-1254组相比的统计学差异，^###p<0.001。

(D)为A549细胞中转染miR-1254和miR-1254 5mt后检测HO-1表达的蛋白印迹图。β肌动蛋白(β-actin)作为上样量对照。NC是指阴性对照。归一化HO-1蛋白表达水平：使用ImageQuant Solutions软件对HO-1与内参基因β-actin的条带进行灰度检测，然后依据β-actin的灰度值，以NC为1，对HO-1的蛋白表达水平进行归一化处理，从而得到归一化HO-1蛋白表达水平。*：表示与NC组相比的统计学差异，**p<0.01，***p<0.001。^#：表示与miR-1254组相比的统计学差异，^##p<0.01。

图2为显示miR-1254通过结合于TFAP2α的3’-UTR下调TFAP2α蛋白表达的图。其中：

(A)为TFAP2α3’-UTR与miR-1254非种子序列区的结合位点序列(见竖线处)，TFAP2α3’-UTR突变系列和miR-1254系列突变序列示意图：TFAP2α3’UTR序列：5’…CTCTTAGGCTCCACATGAGGGCAC…3’，其中，下划线为TFAP2α3’-UTR与miR-1254非种子区互补配对序列。TFAP2α3’UTR>GAATCTTGCATGAGGGCAC…3’，其中，下划线为TFAP2α3’-UTR序列中与miR-1254非种子区互补配对序列的突变序列。将miR-1254中与TFAP2α3’-UTR完全配对的序列进行突变后，其序列如下：miR-1254mut：5’-AGCCUGGAAGCCAAGAUUCGCAGU-3’(SEQ>

(B)显示了荧光素酶报告基因实验结果。该实验显示miR-1254抑制TFAP2α3’-UTR活性，但不能抑制TFAP2α3’-UTR突变体(3’-UTR MUT)的活性。归一化萤光素酶活性：以阴性对照(NC，核苷酸序列：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT-3’(SEQ ID NO:8))为1，对各组的萤光素酶活性进行归一化处理，从而得到归一化萤光素酶活性水平。*：表示与NC+TFAP2α3’UTR组相比的统计学差异，***p<0.001。^#：表示与miR-1254+TFAP2α3’UTR组相比的统计学差异，^###p<0.001。

(C)显示了荧光素酶报告基因实验结果。该实验显示miR-1254非种子序列的突变体(miR-1254mut和miR-1254mmt)不能抑制TFAP2α3’-UTR活性，另一个非种子序列的突变体(miR-1254 3mt)抑制TFAP2α3’-UTR活性减弱，但miR-1254种子序列的突变体(miR-12545mt)依旧可以发挥显著的抑制作用。归一化萤光素酶活性：以阴性对照(NC，核苷酸序列：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT-3’(SEQ ID NO:8))为1，对各组的萤光素酶活性进行归一化处理，从而得到归一化萤光素酶活性水平。*：表示与NC组相比的统计学差异，**p<0.01，***p<0.001。^#：表示与miR-1254组相比的统计学差异，^#p<0.05，^###p<0.001。

(D)为A549细胞中分别转染miR-1254、miR-1254 5mt、miR-1254mmt、miR-12543mt后检测TFAP2α表达的蛋白印迹图。α微管蛋白(α-tubulin)作为上样量对照。NC是指阴性对照。归一化TFAP2α蛋白表达水平：使用ImageQuant Solutions软件对TFAP2α与内参基因α-tubulin的条带进行灰度检测，然后依据α-tubulin的灰度值，以NC为1，对TFAP2α的蛋白表达水平进行归一化处理，从而得到归一化TFAP2α蛋白表达水平。*：表示与NC组相比的统计学差异，**p<0.01，***p<0.001。^#：表示与miR-1254组相比的统计学差异，^##p<0.01，^###p<0.001。

图3为显示miR-1254抑制肿瘤细胞增殖的图。其中：

(A)为显示A549细胞转染25nM浓度的miR-1254后，72小时后利用台盼蓝染色法检测细胞活力的结果的图。*：表示与NC组相比的统计学差异，***p<0.001。

(B)为显示A549细胞转染25nM浓度的miR-1254后，在不同时间点利用噻唑兰(Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT)染色法检测细胞活力的结果的图。*：表示与NC组相比的统计学差异，***p<0.001。

(C)为显示细胞转染25nM浓度的miR-1254后，72小时后利用台盼蓝染色法检测细胞活力的结果的图。*：表示与NC组相比的统计学差异，***p<0.001。

(D)为显示H1975细胞转染25nM浓度的miR-1254后，在不同时间点利用MTT染色法检测细胞活力的结果的图。*：表示与NC组相比的统计学差异，***p<0.001。

图4为显示miR-1254体内抑制肿瘤细胞增殖的图。其中：

(A)显示利用慢病毒建立稳定高表达miR-1254的肺癌细胞系A549，皮下注射到裸鼠体侧皮下，图中显示35天后肿瘤的生长情况。

(B)显示和空载体过表达细胞系对照相比，miR-1254过表达细胞系皮下注射35天后对肿瘤重量的影响。*：表示与空载体慢病毒组相比的统计学差异，*p<0.05。

(C)显示和空载体过表达细胞系对照相比，miR-1254过表达细胞系皮下注射35天期间对肿瘤体积的影响。*：表示与空载体慢病毒组相比的统计学差异，*p<0.05。

具体实施方式

在下文中，将结合附图，通过示例性提出的实施例来更加详细地描述本发明，然而，本发明的范围并不限于实施例。

除特别指定外，本发明中所使用的方法均为本领域中的常规方法。

制备实施例

microRNA-1254及其突变体模拟物的制备

miR-1254(序列为5’-AGCCUGGAAGCUGGAGCCUGCAGU-3’(SEQ ID NO:3))；miR-12545mt(序列为5’-ACGGACCTAGCUGGAGCCUGCAGU-3’(SEQ ID NO:4))；miR-1254mmt(序列为5’-AGCCUGGAGAUCAAGACCUGCAGU-3’(SEQ ID NO:5))；miR-1254 3mt(序列为5’-AGCCUGGAAGCUGGAGCUCAUGAU-3’(SEQ ID NO:6))；miR-1254mut：(序列为5’-AGCCUGGAAGCCAAGAUUCGCAGU-3’(SEQ ID NO:7))是委托上海吉玛公司合成。

实验实施例

实施例1在HEK293细胞中，利用荧光素酶报告系统，检测miR-1254对HO-13’-UTR及其突变体的作用。

本发明在人胚胎肾293(HEK293)细胞(中科院上海生命科学院生化与细胞研究所细胞库)中共转miR-1254和含有HO-1mRNA 3’UTR或其突变体的荧光素酶报告基因质粒，通过检测报告基因荧光素酶的活性来表征miR-1254对HO-1mRNA 3’UTR的结合能力，并初步探讨它们发生相互作用的序列位点。

1、实验材料和方法

1)HO-1 3’UTR报告基因质粒的构建：提取HEK293细胞全基因组DNA为PCR模板，用高保真DNA聚合酶I(High-Fidelity DNA Polymerase I(NEB，美国))进行扩增，反应体系及具体操作按照试剂说明书进行。扩增并回收所需片段(HO-13`UTR)，将扩增产物与荧光素酶报告基因载体(psiCHECK^TM-2，Promega，美国)分别进行XhoI和NotI双酶切，回收产物进行连接、转化，挑选单克隆并摇菌扩增之后送去测序，最终选择接入片段正确的质粒进行后续实验。

2)HO-1 3’UTR MUT报告基因质粒的构建：采用突变试剂盒(KODPlus-MutagenesisKit(Toyobo,日本))，将序列“TCCAGGC”突变成“CTTGAAT”。

3)报告基因质粒及miRNA转染细胞实验：A、提前一天将待转染细胞铺于6孔板中，待细胞密度生长至50％-60％时进行转染；B、将待转染miRNA/质粒DNA溶于100μL无血清培养基Opti-MEM(Thermo Fisher Scientific，美国)中；C、将脂质体(Lipofectamine 2000(Thermo Fisher Scientific，美国))以每孔4μL的剂量溶于100μL无血清培养基Opti-MEM中，室温下孵育5分钟；D、迅速将以上两种混合物混匀，并于室温避光孵育20分钟；E、将6孔板中待转染细胞培养液吸出，每孔加入1.3mL预热的Opti－MEM；F、将混合物以每孔200μL的剂量加入6孔板中，随后放回37℃恒温培养箱培养4-6个小时；G、移去上清液，更换加入10％胎牛血清(FBS)的完全培养基进行培养。

4)荧光素酶报告基因检测实验：荧光素酶报告基因检测采用双荧光素酶报告基因检测试剂盒(Dual-Luciferase Reporter Assay System(Promega，美国))。按照说明书配制荧光素酶活性检测底物(Luciferase Assay Substrate(LAS))和底物(Stop&GloSubstrate(SGS))。在实验之前，需按照说明书新鲜配制1×裂解液(Passive LysisBuffer，PLB)。检测步骤：A、用真空泵吸取6孔板中的细胞培养基，PBS润洗一次；B、6孔板每孔加入100μL 1×PLB裂解细胞，用细胞刮将细胞完全收集并置于冰上；C、将收集的样本13000rpm 4℃离心10分钟；D、每份样本取10μL加入96孔全白板(Corning，美国)中；E、每孔加入100μL LAS，读取荧光数值(萤火虫荧光素酶)；F、每孔加入100μL SGS，读取荧光数值(海肾荧光素酶)；G、数据处理：上述测得的两种荧光素酶中目的信号与内参信号的比值为最终结果。

2、实验结果：

结果如图1B所示，在HEK293细胞中共转25nM的miR-1254和100ng的含有HO-1 3`UTR的荧光素酶报告基因载体psiCHECK^TM-2，48小时后检测荧光素酶的活性，发现：miR1254显著的抑制荧光素酶的活性，这表示miR-1254可以和HO-1>TM-2没有抑制其荧光素酶活性的作用，这表示miR-1254有可能是与HO-1>

实施例2在HEK293细胞中，利用荧光素酶报告系统，检测miR-1254及其突变体模拟物对HO-1 3’-UTR的作用。

本发明在人胚胎肾293(HEK293)细胞中共转HO-1mRNA3’UTR的荧光素酶报告基因质粒和miR-1254或其突变体的模拟物，通过检测报告基因荧光素酶的活性来验证miR-1254与对HO-1mRNA 3`UTR发生相互作用的序列位点。

1、实验材料和方法

1)报告基因质粒及miRNA转染细胞实验：详见实施例1。

2)荧光素酶报告基因检测实验：详见实施例1。

2、实验结果：

结果如图1C所示，miR-1254可以显著抑制HO-1 3’UTR的荧光素酶报告基因活性。在HEK293细胞中共转25nM的miR-1254种子序列突变模拟物(miR-1254 5mt)和HO-1 3’UTR的荧光素酶报告基因质粒后，HO-1 3’UTR的荧光素酶报告基因活性完全回复；但共转其他序列的突变体模拟物(miR-1254mmt或miR-1254 3mt)，HO-1 3’UTR的荧光素酶报告基因活性仍然被抑制。这个结果说明miR-1254是通过其种子序列“GCCUGGA(SEQ ID NO:1)”与HO-13’UTR结合的。

实施例3在A549细胞中，利用蛋白质免疫印迹(WesternBlot)技术，检测miR-1254对HO-1蛋白的作用。

本发明在人非小细胞肺癌A549细胞(中科院上海生命科学院生化与细胞研究所细胞库)中转入miR-1254或其种子序列突变体模拟物，通过WesternBlot技术检测HO-1的蛋白水平来验证miR-1254对HO-1的作用。

1、实验材料和方法

1)miRNA转染细胞实验方法：详见实施例1。

2)蛋白质免疫印迹(WesternBlot)检测方法：

A、所用试剂：HO-1抗体(Enzo Life Sciences，美国)；β-actin(Cell SignalingTechnology，美国)；显影液(Immobilon ECL，Millipore，美国)；溴酚蓝指示剂的1×SDS裂解液；5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液(25mM Tris，250mM pH8.3甘氨酸，0.1％SDS)；10×转膜缓冲液(39mM甘氨酸，48mMTris，0.037％SDS，20％甲醇)；1×TBST(含0.5％Tween-20的TBS)；蛋白marker(Thermo，美国)。

B、实验步骤：(A)制备蛋白样品：将6孔板中细胞培养液用真空泵吸出，PBS缓冲液润洗两次之后加入200μL左右1×SDS裂解液收取细胞，95℃加热15分钟将蛋白变性；(B)SDS-PAGE电泳：按蛋白大小配制不同浓度的SDS-PAGE胶，将1×电泳缓冲液加入电泳槽，设置电压为60V，30分钟后将电压调至120V，直至所需蛋白完全分开终止电泳；(C)湿转法转膜：将1×转膜缓冲液加入转膜槽，220mA，2小时，将蛋白转移到PVDF膜上；(D)封闭：配制5％的脱脂牛奶，将转膜完成后的PVDF膜置于其中室温封闭2小时；(E)一抗孵育：将一抗原液按合适比例用一抗稀释液稀释，4℃旋转孵育过夜；(F)洗膜：1×TBST洗膜两次，每次15分钟；(G)二抗孵育：将二抗按合适比例稀释于5％脱脂牛奶中，室温孵育1小时；(H)洗膜：1×TBST洗膜两次，每次15分钟；(I)ECL显影：将显影液A和B按1:1进行配置，将条带浸于混合液中，室温避光孵育2分钟后将条带放入显影仪中进行显影。

2、实验结果：

结果如图1D所示，miR-1254可以显著抑制A549细胞中HO-1的蛋白含量，而转入miR-1254种子序列的突变体(miR-1254 5mt)后HO-1的蛋白水平有显著性回复。这个实验结果再次说明，miR-1254可以通过其种子序列“GCCUGGA”抑制细胞内HO-1的蛋白含量。

实施例4在HEK293细胞中，利用荧光素酶报告系统，检测miR-1254对TFAP2α3’-UTR及其突变体的作用。

本发明在人胚胎肾293(HEK293)细胞中共转miR-1254和含有TFAP2αmRNA3’UTR或其突变体的荧光素酶报告基因质粒，通过检测报告基因荧光素酶的活性来表征miR-1254对TFAP2αmRNA3’UTR的结合能力，并初步探讨它们发生相互作用的序列位点。

1、实验材料和方法

1)TFAP2α3’UTR报告基因质粒的构建：提取HEK293细胞全基因组DNA为PCR模板，用高保真DNA聚合酶I(High-Fidelity DNA Polymerase I(NEB，美国))进行扩增，反应体系及具体操作按照试剂说明书进行。扩增并回收所需片段(TFAP2α3`UTR)，将扩增产物与荧光素酶报告基因载体(psiCHECK^TM-2，Promega，美国)分别进行XhoI和NotI双酶切，回收产物进行连接、转化，挑选单克隆并摇菌扩增之后送去测序，最终选择接入片段正确的质粒进行后续实验。

2)TFAP2α3’UTR MUT报告基因质粒的构建：采用突变试剂盒(KODPlus-Mutagenesis Kit(Toyobo,日本))，将序列“AGGCTCCA”突变成序列“GAATCTTG”。

3)报告基因质粒及miRNA转染细胞实验：详见实施例1。

4)荧光素酶报告基因检测实验：详见实施例1。

2、实验结果：

结果如图2B所示，在HEK293细胞中共转25nM的miR-1254和100ng的含有TFAP2α3`UTR的荧光素酶报告基因载体psiCHECK^TM-2。48小时后检测荧光素酶的活性，发现：miR1254显著的抑制荧光素酶的活性，这表示miR-1254可以和TFAP2α3’UTR结合，抑制荧光素酶的翻译从而导致其活性降低；但是miR-1254对含有TFAP2α3’UTR>TM-2没有抑制其荧光素酶活性的作用，这表示miR-1254有可能是与TFAP2α3’UTR上的“AGGCTCCA”结合。

实施例5在HEK293细胞中，利用荧光素酶报告系统，检测miR-1254及其突变体模拟物对TFAP2α3’-UTR的作用。

本发明在人胚胎肾293(HEK293)细胞中共转TFAP2αmRNA 3’UTR的荧光素酶报告基因质粒和miR-1254或其突变体的模拟物，通过检测报告基因荧光素酶的活性来验证miR-1254与对TFAP2αmRNA 3’UTR发生相互作用的序列位点。

1、实验材料和方法

1)报告基因质粒及miRNA转染细胞实验：详见实施例1。

2)荧光素酶报告基因检测实验：详见实施例1。

2、实验结果：

结果如图2C所示，miR-1254可以显著抑制TFAP2α3’UTR的荧光素酶报告基因活性。在HEK293细胞中共转25nM的miR-1254非种子序列突变模拟物(miR-1254mmt，或miR-12543mt，或miR-1254mut)和TFAP2α3’UTR的荧光素酶报告基因质粒后，miR-1254mut(与TFAP2α3`UTR结合序列的突变)和miR-1254mmt(突变了5个与TFAP2α3’UTR结合的碱基)可以完全恢复TFAP2α3’UTR的荧光素酶报告基因活性；miR-1254 3mt(突变了2个与TFAP2α3`UTR结合的碱基)可以部分恢复TFAP2α3’UTR的荧光素酶报告基因活性。但共转其种子序列的突变体模拟物(miR-1254 5mt)，TFAP2α3’UTR的荧光素酶报告基因活性仍然被抑制。这个结果说明miR-1254是通过其非种子序列“UGGAGCCU(SEQ ID NO:2)”与TFAP2α3’UTR结合的。

实施例6在A549细胞中，利用蛋白质免疫印迹(WesternBlot)技术，检测miR-1254对TFAP2α蛋白的作用。

本发明在人非小细胞肺癌A549细胞中转入miR-1254或其种子序列突变体模拟物，通过WesternBlot技术检测TFAP2α的蛋白水平来验证miR-1254对TFAP2α的作用。

1、实验材料和方法

1)miRNA转染细胞实验：详见实施例1。

2)蛋白质免疫印迹(WesternBlot)检测实验：

A、所用试剂：TFAP2α抗体购自中国湖北ABclonal Biotechnology；α-tubulin购自美国Cell Signaling Technology；其他详见实施例1。

B、实验步骤：详见实施例1。

2、实验结果：

结果如图2D所示，miR-1254可以显著抑制A549细胞中TFAP2α的蛋白含量，转入miR-1254非种子序列突变模拟物(miR-1254mmt)可以完全恢复TFAP2α的蛋白水平，miR-1254 3mt可以部分恢复TFAP2α的蛋白水平。但转入miR-1254种子序列的突变体(miR-12545mt)后TFAP2α依旧被显著性抑制，这个实验结果再次说明，miR-1254可以通过其非种子序列“UGGAGCCU(SEQ ID NO:2)”抑制细胞内TFAP2α的蛋白含量。

实施例7分别在人非小细胞肺癌细胞A549和NCI-H1975中检测miR-1254对细胞增殖的影响。

所用细胞模型为人非小细胞肺癌细胞A549和NCI-H1975(中科院上海生命科学院生化与细胞研究所细胞库)。检测miR-1254对细胞增殖的影响。

1、实验材料和方法

1)台盼蓝染色检测细胞数量

A、所用试剂：台盼蓝染色(Trypan blue)试剂盒。

B、实验步骤：(A)A549以3×10⁵个细胞/孔、NCI-H1975以2.5×10⁵个细胞/孔的密度分别铺至6孔板中，培养24小时后待细胞密度长至50％-60％时进行转染；(B)miRNA转染细胞实验方法：详见实施例1。(C)转染完成后将细胞置于37℃恒温培养箱培养72小时后进行收样检测；(D)用真空泵吸去培养板中细胞培养基，每孔加入200μL胰酶进行消化，消化完成后，每孔加入600μL细胞培养基进行中和，将贴壁细胞完全吹打下来，收集到灭菌的1.5mLEP管中；(E)1000rpm离心3分钟；(F)小心移去EP管中上清液，每管加入1mL培养基进行重悬；(G)每个样本细胞计数仪拍照50张，计算活细胞数量。

2)噻唑兰(Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT)染色法检测细胞活力

A、所用试剂：MTT(5mg/mL)溶液(60mgMTT溶于12mLPBS,0.22μm滤膜过滤，4℃避光保存)；三联液(蒸馏水溶解50gSDS、25mL异丙醇、5mL 1M HCl，定容至500mL)。

B、实验步骤：(A)A549以3×10⁵个细胞/孔、NCI-H1975以2.5×10⁵个细胞/孔的密度分别铺至6孔板中，培养24小时后待细胞密度长至50％-60％时进行转染；(B)miRNA转染细胞实验方法：详见实施例1。(C)转染完成后将细胞置于37℃恒温培养箱培养24小时后进行消化重悬，计算细胞浓度；(D)将A549及NCI-H1975分别以1000个细胞/孔的密度接种至96孔板中，每孔100μL细胞培养基；(E)分别于第0-5天同一时间检测细胞活力：将培养板中的细胞培养液吸出，每孔加入100μL>

2、实验结果：

结果如图3A和C所示，在A549和NCI-H1975细胞中转染25nM的miR-1254，72小时后，和NC组相比显著抑制A549和NCI-H1975细胞的数量；同时连续5天检测miR-1254对A549和NCI-H1975细胞增殖的影响，发现miR-1254组细胞增殖速率明显降低(图3B和D)。

实施例8体内裸鼠实验检测miR-1254对肿瘤细胞增殖的影响。

利用慢病毒建立稳定高表达miR-1254的A549细胞株，将稳定高表达miR-1254的细胞株和阴性对照组细胞株分别在裸鼠上进行皮下注射，观察miR-1254对肺癌皮下移植瘤生长的作用。

1、实验材料和方法

1)慢病毒载体构建：A、利用双酶切体系将px330-C5U质粒(中国科学技术大学生命科学学院朱涛课题组馈赠)上能够稳定miR-1254表达的片段酶切电泳回收(酶切位点选用NheI、NotI)，将其克隆到慢病毒表达载体pCD513B-1中；B、实验前一天将工具细胞293T(中科院上海生命科学院生化与细胞研究所细胞库)接种于10cm培养皿中，保证细胞贴壁后融合度约30％；C、将待转染的质粒DNA(实验组慢病毒载体pCD513B-1-1254/对照组慢病毒载体空载pCD513B-1-nc：10.5μg，辅助质粒PSPAX2和PMD2G分别为7μg和3.5μg)溶于1.5mL无血清培养基Opti-MEM中；D、将63μL Lipofectamine 2000溶于1.5mL无血清培养基Opti-MEM中，室温下孵育5分钟；E、迅速将以上两种混合物混匀，并于室温避光孵育20分钟；F、将10cm培养皿中待转染细胞培养液吸出，加入7mL预热的加了10％FBS的DMEM培养基；G、将混合物加入10cm培养皿中，随后放回37℃恒温培养箱培养6-8个小时；H、移去上清液，更换37℃预热的培养基进行培养；I、72小时后收上清，并用直径0.45μm的滤膜进行过滤，病毒直接使用或-80℃冻存；J、提前一天将待感染的A549细胞接种至6孔板中，使之在转染时达到30％-50％的融合度；K、将收集的病毒分别以0.5mL、1mL、2mL的梯度加入不同孔中，每孔另加0.5mL完全培养基和聚凝胺(polybrene)，使之终浓度达到6-10μg/mL进行病毒感染，6-8小时后观察细胞状态，更换新鲜完全培养基；L、24小时后观察荧光，48小时后收样检测；M、在整个实验过程中注意观察细胞状态并每隔一段时间收集细胞样本并检测目的miRNA的表达水平，当目的miRNA表达稳定且病毒融合率达到90％以上时，即认为已经获得了稳转细胞株。

2)裸鼠实验：将1×10⁷个miR-1254稳定高表达的A549细胞及对照组细胞接种在裸鼠皮下，监测肿瘤生长体积，35天后按照动物福利组织的规定处死实验裸鼠，拍照，取肿瘤组织以及称重。

2、实验结果：

结果显示：与空载体慢病毒(lv-nc)对照组相比，miR-1254过表达慢病毒(lv-1254)实验组裸鼠肿瘤体积和重量显著降低。以上结果提示我们miR-1254能够抑制非小细胞肺癌裸鼠移植瘤的生长。

通过上述实施例的结果，可以显示miR-1254不仅可以抑制HO-1和其转录因子TFAP2α蛋白的表达，也可显著抑制肿瘤细胞增殖，这为肿瘤的靶向治疗提供了一种新的可能性。

以上实施例仅为本发明的示例性实施例，不用于限制本发明，本发明的保护范围由权利要求书限定。本领域技术人员可以在本发明的实质和保护范围内，对本发明做出各种修改或等同替换，这种修改或等同替换也应视为落在本发明的保护范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院上海药物研究所

<120> microRNA-1254及其种子基序和非种子序列在抑制肿瘤恶性增殖中的应用

<130> DI17-0967-XC37

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 7

<212> RNA

<213> Artificial

<220>

<223> microRNA-1254种子基序

<400> 1

gccugga 7

<210> 2

<211> 8

<212> RNA

<213> Artificial

<220>

<223> microRNA-1254非种子序列

<400> 2

uggagccu 8

<210> 3

<211> 24

<212> RNA

<213> Artificial

<220>

<223> microRNA-1254

<400> 3

agccuggaag cuggagccug cagu 24

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> miR-1254 5mt

<400> 4

acggacctag cuggagccug cagu 24

<210> 5

<211> 24

<212> RNA

<213> Artificial

<220>

<223> miR-1254 mmt

<400> 5

agccuggaga ucaagaccug cagu 24

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<211> 24

<212> RNA

<213> Artificial

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<223> miR-1254 3mt

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agccuggaag ccaagauucg cagu 24

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<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> NC

<400> 8

uucuccgaac gugucacgut t 21