无刺蜂蜂蜜多酚物质的提取及其在免疫调节中的应用

摘要

本发明提出一种无刺蜂蜂蜜多酚物质的提取方法，包括步骤：1)无刺蜂蜂蜜用醋酸水溶液溶解，经过搅拌和超声处理后，过滤，分离出无刺蜂蜂蜜水溶液；2)将大孔树脂倒入无刺蜂蜂蜜水溶液中，搅拌吸附0.5～2h；3)将吸附后的大孔树脂填入柱中，分别用醋酸水溶液、纯水淋洗，最后用乙醇溶液洗脱，4)洗脱液减压真空浓缩至成为固形物，复溶于纯水，并用乙酸乙酯萃取。本发明通过XAD‑2柱层析提取富集无刺蜂蜂蜜有效成分，进行了无刺蜂蜂蜜提取物的成分分析、应用研究，发现无刺蜂蜂蜜提取物具有丰富的黄酮、多酚类活性成分，具有显著的抗氧化、抗炎活性，对于预防和治疗炎症疾病药物、食品、保健品的开发和应用具有广泛的应用价值。

说明书

技术领域

本发明属于生物化学领域，具体涉及一种蜂蜜的提取方法和提取产物。

背景技术

无刺蜂(Stingless bees)是一类营群体生活并能酿蜜的昆虫，隶属于膜翅目(Hymenoptera)、蜜蜂总科(Apoidea)、蜜蜂科(Apidae)，蜜蜂亚科(Apinae)，麦蜂族(MeliPonini)，无刺蜂属(Trigona Jurine)，体呈黑色，体小灵活，是热带地区植物的主要传粉蜂种，主要分布于热带和亚热带地区，我国仅在云南、海南和台湾地区的田间森林有分布。无刺蜂蜂蜜是无刺蜂从植物蜜腺或其他部位采来的花蜜，经充分酿造，存储于巢房的甜蜜物质，与西方蜜蜂蜂蜜相比，具有水分含量高、酸度高、酶值低、粘度低等特点。蜂蜜早已被人们作为一种天然的甜味剂，由于其存在的活性成分，也被广泛应用于临床实践。已有报道证明蜂蜜具有多种生物活性，而对无刺蜂蜂蜜的活性成分的提取和分离研究进行的还比较少。

无刺蜂蜂蜜含有丰富的营养物质和生物活性成分，世界范围内，主要产自秘鲁、瓜地马拉、墨西哥、委内瑞拉等国家。Melipona spp，Scaptotrigona spp，Trigona spp等无刺蜂属蜂蜜已广泛应用于传统医学，具有显著的抗氧化、抗菌、抗突变、促进伤口愈合等生物活性功能。无刺蜂蜂蜜的化学成分复杂，尤其是其主要活性成分酚酸黄酮类物质，因蜂种、采集植物、地理环境、气候、季节的变化而导致无刺蜂蜂蜜成分、活性的差异。

我国已发现的无刺蜂蜂种有黄纹无刺蜂(Trigona ventralis Smith)、顶无刺蜂(T.terminate Smith)、暗翅无刺蜂(T.vidua Lepeletier)、蜜色无刺蜂(T.luteaBingham)、黑胸无刺蜂(T.pagdeni Sehwarz)、棕足无刺蜂(T.smithii Smith)、棕胸无刺蜂(T.thoracica Smith)、黑腿无刺蜂(T.vidua Smith)、黑腹无刺蜂(T.canifrons Smith)、黄跗无刺蜂(T.iridipennis Smith)，其中以黄纹无刺蜂分布最广、数量最多。但无有关我国无刺蜂蜂蜜成分和活性的研究报道。

发明内容

针对本领域的不足之处，本发明的目的是提供一种无刺蜂蜂蜜的提取方法。

本发明的另一目的是提出所述提取方法获得的提取物。

本发明的第三个目的是提出所述提取物的应用。

实现本发明上述目的的技术方案为：

一种无刺蜂蜂蜜多酚物质的提取方法，包括步骤：

1)无刺蜂蜂蜜用醋酸水溶液溶解，经过搅拌和超声处理后，过滤，分离出无刺蜂蜂蜜水溶液；

2)将大孔树脂倒入无刺蜂蜂蜜水溶液中，搅拌吸附0.5～2h；

3)将吸附后的大孔树脂填入柱中，分别用醋酸水溶液、纯水淋洗(以除去极性物质，糖等)，最后用乙醇溶液洗脱并收集洗脱液，

4)洗脱液减压真空浓缩至成为固形物，复溶于纯水，并用乙酸乙酯萃取。收集乙酸乙酯层，氮气吹干，得无刺蜂蜂蜜提取物。该提取物放置于-20℃冰箱中备用。

本提取方法可针对黄纹无刺蜂的蜂蜜但不限于此。

进一步地，步骤1)中所述醋酸水溶液的pH值为1.8～2.5,无刺蜂蜂蜜和醋酸水溶液的质量体积比为8g：20～60mL；所述超声的时间为20～40min，所述过滤的过滤介质为棉花、滤纸、滤膜中的一种。

优选地，步骤2)中所述大孔树脂为Amberlite XAD-2大孔树脂，大孔树脂和无刺蜂蜂蜜的质量比例为1：0.5～2，所述大孔树脂首先经乙醇浸泡活化，然后用于吸附。

其中，步骤3)中所述醋酸水溶液的pH值为1.8～2.5,无刺蜂蜂蜜和醋酸水溶液、纯水的质量体积比为8g：10～20mL：20～30mL。

其中，步骤3)中无刺蜂蜂蜜和无水乙醇溶液的质量体积比为8g：50～80mL；步骤4)中减压真空浓缩的温度为30～50℃。

其中，步骤4)中水箱和有机相的体积比为1：2～6。

所述的提取方法，还包括对步骤4)得到的无刺蜂蜂蜜提取物进行液相色谱-串联质谱联用分离的操作，

色谱条件：采用十八烷基硅烷色谱柱，流动相为纯水-甲醇；流速0.2mL/min；进样量2μL；柱温30℃；洗脱梯度为0-2min，5％；2-10min，15％-30％；10-25min，30％-90％；25-30min，90％；30-31min，15％；

质谱条件：ESI源，载气温度(Gas Temp)：350℃，干燥气流速(Drying Gas):11L/min，雾化气压(Nebulizer)：40psig。

本发明所述提取方法得到的无刺蜂蜂蜜提取物。

所述的无刺蜂蜂蜜提取物在免疫调节中的应用。

优选地，所述的无刺蜂蜂蜜提取物在制备抗炎症药物中的应用。

本发明提出的方法，实现了对无刺蜂蜂蜜中多酚物质的提取，每100g无刺蜂蜂蜜可得固形物0.1519g，试验证明该提取物具有免疫调节功能。本发明通过XAD-2柱层析提取富集无刺蜂蜂蜜有效成分，进行了无刺蜂蜂蜜提取物的成分分析、应用研究，发现无刺蜂蜂蜜提取物具有丰富的黄酮、多酚类活性成分，具有显著的抗氧化、抗炎活性，对于预防和治疗炎症疾病药物、食品、保健品的开发和应用具有广泛的应用价值。

本实验通过XAD-2柱层析法富集了我国海南无刺蜂蜂蜜中的多酚类有效活性成分，利用液相色谱串联四级杆飞行时间质谱(Q-TOF-LC/MS)法测定其多酚化学成分，研究了我国无刺蜂蜂蜜多酚提取物的体外抗氧化活性(DPPH、ABTS的自由基清除、总还原力)及对细菌脂多糖诱导的小鼠单核巨噬细胞体外炎症反应的调节作用，探讨无刺蜂蜂蜜的抗炎、抗氧化作用及其可能的机制，为我国无刺蜂蜂蜜的开发利用提供理论依据。

附图说明

图1：SBH对Raw 264.7细胞释放NO能力及相关炎症基因mRNA水平表达的影响。

具体实施方式

现以以下实施例来说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

说明书中使用的手段，如无特别说明，均为本领域常规的技术手段。

实施例1：

称取800g无刺蜂(海南，黄纹无刺蜂,Trigona ventralis Swith)蜂蜜，用4L醋酸(pH 2.0)水溶解，搅拌溶解后超声30min，棉花过滤，待用。Amberlite XAD-2大孔树脂经乙醇浸泡24h后，称取800g活化大孔树脂，水洗2-3遍至无味，倒入无刺蜂蜂蜜水溶液中，搅拌吸附1h。静置，弃去上清液，并将大孔树脂填入玻璃柱中，分别用1.6L pH 2的醋酸水溶液、2.4L纯水淋洗以除去糖等极性物质，最后用6.4L无水乙醇溶液洗脱并收集洗脱液，40℃减压真空浓缩至固形物，共1.2152g，复溶于10mL纯水，并用40mL乙酸乙酯萃取。收集乙酸乙酯层，氮气吹干，所得无刺蜂蜂蜜提取物(SBH)为0.552g，放置于-20℃冰箱中备用。

高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱(6510Q-TOF LC/MS)，安捷伦科技有限公司，进行液质联用分析，色谱条件：采用proshell 120SB-C18色谱柱(2.1mm×100mm，2.7μm)，流动相为纯水(A)-甲醇(B)；流速0.2mL/min；进样量2μL；柱温30℃；洗脱梯度为0-2min，5％；2-10min，15％-30％；10-2 5min，30％-90％；25-30min，90％；30-31min，15％。质谱条件：ESI源，载气温度(Gas Temp)：350℃，干燥气流速(Drying Gas):11L/min，雾化气压(Nebulizer)：40psig。无刺蜂蜂蜜的总酚酸含量为9.658±0.42mg CAE/100g，无刺蜂蜂蜜样品的总黄酮含量为1.614±0.26mg QE/100g，酚酸黄酮类物质含量丰富。其总黄酮含量高于Apis mellifera蜂蜜(如柑橘蜂蜜：0.17mg QE/100g；椴树蜂蜜：0.95mg QE/100g)。已有研究结果表明，植物的生长环境和气候条件会直接影响花蜜的成分组成，接受充足阳光的植物比生长在阴凉处相同品种及其他植物具有更多的多酚含量，特别是阳光充足、炎热潮湿的地区(如海南热带雨林地区)对于植物中的多酚含量影响显著，使得无刺蜂蜂蜜中含有较多的多酚物质。

本研究建立了24种酚酸黄酮类物质Q-Tof-LC/MS检测方法，其中在海南无刺蜂蜂蜜中检测出15种酚酸黄酮物质，结果如表1所示。没食子酸和桑色素含量最高，分别为225.308μg/100g和265.28μg/100g。丁香酸、阿魏酸、咖啡酸苯乙基酯和芹菜素含量较低，高良姜黄素在无刺蜂蜂蜜中首次发现，并没有在无刺蜂蜂蜜中检出异阿魏酸、迷失香酸、松鼠素、柯因、杨梅素、姜黄素、3,4-二甲氧基肉桂酸、槲皮素和芦丁，但Snandia和JanaínaMaria Sousa分别在巴西无刺蜂蜂蜜中检测出杨梅素和芦丁，说明不同区域的无刺蜂蜂蜜酚酸黄酮含量存在差异。

表1 HPLC-Q-TOF/MS分析15种酚酸黄酮化合物在无刺蜂蜂蜜中含量

实施例2无刺蜂蜂蜜提取物免疫调节能力试验

基于DPPH(二苯基苦基苯肼)、ABTS(2'-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)和RP(铁离子还原力)具有显著的重复性和可靠性，广泛用于定量测定天然产物和植物提取物的抗氧化能力。DPPH是一种很稳定的氮中心自由基，通过捕获物质的自由基反映其抗氧化性；ABTS氧化后生成蓝绿色自由基ABTs+，当抗氧化物存在时ABTs+受到抑制；还原Fe³⁺离子能力能够反映物质的抗氧化能力。无刺蜂蜂蜜提取物DPPH>50值为435±0.54μg/mL，ABTS>50值为423±0.34μg/mL，RP为0.582±0.02μmol>

表2无刺蜂蜂蜜总酚酸和总黄酮含量及抗氧化能力

巨噬细胞在天然免疫中具有关键作用，激活的巨噬细胞能够启动和增加多种炎症反应。抑制巨噬细胞的激活或阻碍巨噬细胞NO的过度释放可作为抑制多种炎症反应的治疗方法。RAW264.7细胞是由Abelson小鼠白血病病毒转换的巨噬细胞，对多种炎症刺激具有免疫活性。本研究选用1μg/mL LPS刺激细胞建立体外抗炎模型。为探讨无刺蜂蜂蜜对炎症反应的调节作用，利用Greiss反应测定细胞NO释放量及荧光定量PCR检测一些炎症因子。经LPS(内毒素)刺激24h后，刺激前用不同浓度无刺蜂蜂蜜提取物处理1h组其NO的释放量显著低于未经蜂蜜样品前处理组，表明无刺蜂蜂蜜对NO的释放有一定的抑制作用。且随着样品浓度的增加，NO释放量逐步降低，说明NO的释放量与样品的质量浓度呈一定的相关性。在浓度为50μg/mL、100μg/mL和200μg/mL时，对NO的释放量有极显著的抑制作用。由此推测无刺蜂蜂蜜通过抑制NO的释放起到抗炎作用。

为了评估无刺蜂蜂蜜对LPS刺激的RAW264.7细胞mRNA表达水平的影响，本研究利用qRT-PCR测定了参与炎症反应的5个关键基因表达量。iNOS在炎症过程高量表达，造成NO在细胞培养基的积累；IL-1β是一种重要的促炎症因子，能够加剧炎症反应，造成组织器官损伤；IL-6促炎细胞因子在炎症反应过程中出现高量表达；HO-1是一种应激反应蛋白质，能够有效调节细胞内的活性氧水平，具有抗氧化作用，在炎症反应中的高表达能够降低NO的释放而抑制炎症反应，并增强细胞抵抗凋亡的能力；MCP-1是重要的细趋化细胞因子，能够趋化及活化血液中的单核/巨噬细胞向炎症部位聚集，在炎症细胞渗透中发挥重要作用，参与多种慢性炎症疾病，并在激活的巨噬细胞中高水平表达。因此，这些细胞因子的mRNA表达水平可作为抗炎活性的重要指标。

本研究中，iNOS、IL-1β、IL-6、HO-1和MCP-1基因mRNA的水平表达定量结果见图1(与空白组相比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)。

相比较于LPS未刺激对照组，LPS刺激组对于炎症相关基因的转录有显著性变化，能够诱导iNOS、IL-1β、IL-6和MCP-1基因的高表达。与LPS组比较，低浓度无刺蜂蜂蜜预处理组(50μg/mL)能够极显著抑制iNOS和IL-1β基因mRNA的水平表达(p<0.001)，基因表达水平随无刺蜂蜂蜜质量浓度的增加而降低，具有一定的质量浓度相关性。并极显著增强HO-1基因mRNA的水平表达(p<0.001)，其表达水平随着剂量的增大而加强，由此推测，无刺蜂蜂蜜作为一种强氧化剂保护损伤细胞。无刺蜂蜂蜜预处理组对IL-6基因mRNA的水平表达抑制性不显著，50μg/mL处理组并没有出现抑制作用，但质量浓度为100μg/mL时，显著抑制基因的表达(p<0.01)，其对IL-6基因的抑制作用低于iNOS和IL-1β基因。50μg/mL无刺蜂蜂蜜预处理组显著抑制MCP-1基因mRNA的水平表达(p<0.01)，质量浓度为100μg/mL时具有极显著的抑制作用。这些结果表明，无刺蜂蜂蜜提取物具有较强的抗炎作用，其抗炎活性在炎症过程中能够选择性的改变抗炎相关基因mRNA的表达。

以上的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术人员对本发明的技术方案作出的各种变型和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。