一种基于脂肪酸组成差异性鉴别岱衢族与闽‑粤东族大黄鱼的方法

摘要

本发明公开了一种基于脂肪酸组成差异性辨别岱衢族大黄鱼与闽‑粤东族大黄鱼的方法，采集大黄鱼肌肉，抽取总脂后皂化、甲脂化，通过GC‑MS分析后，定性定量肌肉中脂肪酸，当所述肌肉中脂肪酸[C18：1/(C20：1+C22：1)]＜5.0时，判别所采集的大黄鱼为岱衢族大黄鱼；当肌肉中脂肪酸[C18：1/(C20：1+C22：1)]＞5.0时，判别所采集的大黄鱼为闽‑粤东族大黄鱼，其优点在于根据岱衢族大黄鱼具有明显区别于闽‑粤东族的脂肪酸标记物，并通过脂肪酸标记物的定量比值来加大区分度，从而简化鉴别方法和提升准确率，为岱衢族大黄鱼的种质资源保护、良种选育和市场销售提供技术支持。

说明书

技术领域

本发明涉及大黄鱼所属种族的鉴别方法，尤其是涉及一种基于脂肪酸组成差异性鉴别岱衢族与闽-粤东族大黄鱼的方法。

背景技术

大黄鱼(Larimichthys crocea)，隶属于鲈形目(Perciformes)，石首鱼科(Sciaenidae)，黄鱼属(Larimichthys)，是一类能进行集群洄游的近海鱼类，传统上分为3个地理种群：岱衢族、闽-粤东族和硇洲族。野生岱衢族大黄鱼资源由于酷渔滥捕而濒临衰竭，在宁波地区养殖的大黄鱼多为闽-粤东族大黄鱼。闽-粤东族大黄鱼在品质和风味不如本地岱衢族大黄鱼，而后者在生长速度和抗寒能力等方面也更有优势，在市场上价格要比闽- 粤东族大黄鱼高。为此，宁波市启动岱衢族大黄鱼野生亲本采捕、驯养、繁育和种质库建设项目，至今已成功繁育出优质的岱衢族大黄鱼鱼种。

岱衢族大黄鱼和闽-粤东族大黄鱼在外观上相似，采用传统的性状观察，主观性强，很难有效区分。因此，开发岱衢族大黄鱼区别于闽-粤东族大黄鱼的鉴别方法，对于种质资源保护、良种选育和市场销售等方面都显得非常重要。目前关于岱衢族大黄鱼的鉴别方法仅有少量报道，丁文超等(丁文超，李明云，管丹冬，冯威.大黄鱼4个家系的形态差异分析[J].宁波大学学报(理工版)，2009，22(2)：185-190.)通过对10个贡献率较大的形态变量进行逐步判别分析，建立了大黄鱼4个家系的判别公式，但其综合判别率仅为 92.5％。王德祥等(王德祥，王军，苏永全.不同种群大黄鱼的鉴别引物和鉴别方法[P].中国专利：200610135259，2006.11.28.)和丁诗华等(丁诗华，黄丽英，张海琪，徐晓林. 大黄鱼(Pseudosciaena crocea)岱衢洋选育群体和官井洋养殖群体的遗传差异分析[J].海洋与湖沼，2006，37(1)：41-46.)采用单引物RAPD-PCR扩增图谱来区分岱衢族大黄鱼和闽-粤东族大黄鱼，然而，RAPD-PCR技术对DNA模板的质量、扩增的条件和体系都有很高的要求，而其自身固有的缺陷即可重复性差很难克服。针对岱衢族大黄鱼和闽粤东族大黄鱼D-loop和ND4区域存在的差异位点，OTU分型后对两段区域进行结合分析从而鉴别岱衢族大黄鱼(沈锡权，何萌萌，严小军，等.岱衢族大黄鱼(Pseudosciaena crocea)线粒体基因组全序列的扩增及其特异鉴别引物的开发[J].海洋与湖沼，2013， 44(3)：755-762.)，其实验数据可重复性强，鉴别准确率较高，但上述方法还是存在小概率的误判。

近年来，利用不同群体脂肪酸组成的特异性使其作为指纹图谱，在物种的种质鉴定中取得了广泛应用。本发明拟对岱衢族大黄鱼和闽-粤东族大黄鱼的脂肪酸组成进行分析，探索采用特异性脂肪酸来对两种地理种群大黄鱼进行区分的可行性。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种基于脂肪酸组成差异性鉴别岱衢族与闽-粤东族大黄鱼的方法，根据岱衢族大黄鱼具有明显区别于闽-粤东族的脂肪酸标记物，并通过脂肪酸标记物的定量比值来加大区分度，从而简化鉴别方法和提升准确率。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种基于脂肪酸组成差异性鉴别岱衢族与闽-粤东族大黄鱼的方法，其特征在于：包括如下具体步骤：1)材料制备：采集大黄鱼肌肉；2)对大黄鱼肌肉进行总脂的抽提，皂化，甲酯化；3)气相色谱质谱联用分析：对脂肪酸甲酯化样品进行气相色谱质谱联用分析，获得气相色谱保留时间和质谱图；4)定性与定量分析脂肪酸：根据气相色谱保留时间和质谱图与标准谱库对比，分析获取各种脂肪酸的种类，采用面积归一法计算出各脂肪酸组分的百分含量；5)鉴别分析：当所述肌肉中脂肪酸[C18：1/(C20：1+C22：1)]＜5.0时，判别所采集的大黄鱼为岱衢族大黄鱼；当所述肌肉中脂肪酸[C18：1/(C20：1+C22：1)]＞5.0时，判别所采集的大黄鱼为闽-粤东族大黄鱼。

作为优选，当所述肌肉中脂肪酸C20：5/C20：4＞4.0时，判别所采集的大黄鱼为岱衢族大黄鱼；当所述肌肉中脂肪酸C20：5/C20：4＜4.0时，判别所采集的大黄鱼为闽-粤东族大黄鱼。

作为优选，所述肌肉肌肉采集自大黄鱼背部侧线位置。

作为优选，步骤2)中取背部侧线位置肌肉冷冻干燥后，准确称取0.1g干重肌肉提取总脂。

作为优选，步骤2)中的气相色谱条件为：进样口温度250℃，载气为纯度为99.999％的高纯氦，柱流速0.81ml/min，柱前压73.0KPa，柱起始温度150℃，保持3.5min后，以20℃/min升至200℃，再以5℃/min升至280℃，保持37min。分流进样1μL，分流比50∶1；

质谱条件为：离子源选用电子轰击(electron impact，EI)源，电子能量为70EV，离子源温度200℃，接口温度250℃，选取全程离子碎片扫描(SCAN)模式，质量扫描范围为40～600，溶剂延迟3.5min。用化学电离(Chemical Ionization，CI)源分析时，反应气为甲烷。

作为优选，步骤2)中总脂的皂化方法为：在总脂中加入2mL5％-6％的氢氧化钾-甲醇水4∶1(V/V)溶液，60℃温度下水浴2h，冷却后移到离心管中，加入1ml的饱和 NaCl溶液，再用1∶1(V/V)盐酸调节PH至小于1后，1∶4氯仿∶正己烷(V/V)6ml分三次混合均匀后提取，提取液合并后加2ml蒸馏水取上层液后，旋转干燥；

甲脂化方法为：向皂化后的样品中，加入0.5mL 14％BF3-甲醇液，60℃的水浴锅中加热1h，取出冷却后转移到离心管中，用4ml正己烷分两次加入样品瓶浸润后分别加入试管中提取，再加入3ml的1∶4氯仿∶正己烷(V/V)提取合并提取液后，加入3g无水Na₂SO4静置5-6小时，取上层液蒸干，用1mL色谱纯正己烷定容后，上机分析。

与现有技术相比，本发明的优点在于以大黄鱼肉质中脂肪酸含量低、差异性明显的肌肉为鉴别材料，根据岱衢族大黄鱼具有明显区别于闽-粤东族的脂肪酸标记物，并通过脂肪酸标记物的定量比值来加大区分度，从而简化鉴别方法和提升准确率，为岱衢族大黄鱼的种质资源保护、良种选育和市场销售提供技术支持。

附图说明

图1为岱衢族大黄鱼与闽-粤东族大黄鱼脂肪酸结果的PLS-DA得分图，图中■表示为闽-粤东族大黄鱼(Min-yue stock)，M-S1、M-S2和M-S3为4月龄闽-粤东族大黄鱼， M-M1、M-M2和M-M3为16月龄闽-粤东族大黄鱼，M-L1、M-L2和M-L3为28月龄闽-粤东族大黄鱼；●表示为岱衢族大黄鱼(Dai-qu stock)，D-S1、D-S2和D-S3为4月龄岱衢族大黄鱼，D-M1和D-M2为16月龄岱衢族大黄鱼，D-L1和D-L2为4年龄岱衢族大黄鱼。

图2为岱衢族和闽-粤东族大黄鱼C18：1/(C20：1+C22：1)和C20：5/C20：4比值的散点图；■表示为闽-粤东族大黄鱼(Min-yue stock)；●表示为岱衢族大黄鱼(Dai-qustock)，D-L1 和D-L2为4年龄岱衢族大黄鱼；▲表示为在岱衢洋捕捞到的野生大黄鱼(DaiQu Sea)，图中DQS1和DQS2表示为在岱衢洋捕捞到的野生大黄鱼。

图3为岱衢族大黄鱼相对于闽-粤东族大黄鱼的S-载荷图。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。

实施例1

(一)材料制备

2010年7月在象山黄皮岙网箱养殖区采集样品，岱衢族大黄鱼采自宁波市海洋渔业研究院养殖基地，闽粤东族大黄鱼为同一养殖区的闽-粤东族的大黄鱼；共采集样品如下：4月龄闽粤东族大黄鱼3条进行分析(M-S)；16月龄闽粤东族大黄鱼3条进行分析(M-M)；28月龄闽粤东族大黄鱼3条进行分析(M-L)；4月龄岱衢族大黄鱼子一代3 条进行分析(D-S)；16月龄岱衢族大黄鱼子一代2条进行分析(D-M)；4龄岱衢族大黄鱼亲鱼2条进行分析(D-L)；岱衢洋海域捕捞2条野生大黄鱼，分别进行分析(DQS)。有关大黄鱼各实验组的形体指标如表1所示，为平均值，SD为方差。

表1.大黄鱼样品的形体指标

(二)总脂的抽提、皂化和甲酯化

a.总脂的抽提：

取背部侧线部位肌肉冷冻干燥后，准确称取0.1g干重肌肉用Bligh-Dyer法(BlighE G， Dyer W J.A rapid method of total lipid extraction andpurification.Canadian Journal of Biochemistry&Physiology，1959，37(8)：911-917.)提取总脂。

b.总脂皂化与甲酯化

在总脂中加入2mL5％-6％的氢氧化钾-甲醇水4∶1(V/V)溶液，60℃温度下水浴2h，冷却后移到离心管中，加入1ml的饱和NaCl溶液，再用1∶1(V/V)盐酸调节PH至小于1后，1∶4氯仿∶正己烷(V/V)6ml分三次混合均匀后提取，提取液合并后加2ml 蒸馏水取上层液后，旋转干燥。

向上述处理后的样品中，加入0.5mL14％BF3-甲醇液，60℃的水浴锅中加热1h，取出冷却后转移到离心管中，用4ml正己烷分两次加入样品瓶浸润后分别加入试管中提取，再加入3ml的1∶4氯仿∶正己烷(V/V)提取合并提取液后，加入3g无水Na2SO4 静置5-6小时，取上层液蒸干，用1mL色谱纯正己烷定容后，上机分析。

(三)GC-MS(Gas Chromatography-Mass Spectrometer，气相色谱-质谱联用)分析

GC(气相色谱)条件：进样口温度250℃，载气为纯度为99.999％的高纯氦，柱流速0.81ml/min，柱前压73.0KPa，柱起始温度150℃，保持3.5min后，以20℃/min 升至200℃，再以5℃/min升至280℃，保持37min。分流进样1μL，分流比50∶1。

MS(质谱)条件：离子源选用电子轰击(electron impact，EI)源，电子能量为70EV，离子源温度200℃，接口温度250℃，选取全程离子碎片扫描(SCAN)模式，质量扫描范围为40～600，溶剂延迟3.5min。用化学电离(Chemical Ionization，CI)源分析时，反应气为甲烷。

(四)定性与定量分析脂肪酸

原始脂肪酸数据由GC-MS数据处理系统(SHIMADZU公司)采集，可以初步得出各组分的分子量；再依据GC-EIMS-TIC图中各组分的离子碎片质量谱，通过对NIST库和 WILEY库检索并参考脂肪酸标准谱图，定性出所有的脂肪酸组分。采用面积归一法计算出各脂肪酸组分的相对百分含量。

获取的岱衢族和闽-粤东族大黄鱼肌肉脂肪酸组成如表2所示，含量数据为百分比％，为平均值，SD为方差。

表2.大黄鱼的脂肪酸组成(％，

通过表2结果的比较分析可以看出，闽-粤东族大黄鱼与岱衢族大黄鱼及疑似岱衢族大黄鱼肌肉中脂肪酸种类基本一致，不同年龄阶段的SFA、MUFA和PUFA含量检验显示，大黄鱼各个年龄阶段之间的总SFA、总MUFA、总PUFA含量均没有显著差异。饱和脂肪酸的总量(SFA)与单不饱和脂肪酸的总量(MUFA)相近而大于多不饱和脂肪酸的总量(PUFA)，其中，含量最高的脂肪酸为C16：0，其次为C18：1(n-9)、C16：1(n-9)、 C22：6(n-3)、C20：5(n-3)、C16：1(n-9)；比较对应脂肪酸的相对含量，岱衢族大黄鱼中C16：0、C20：1(n-9)、C20：5(n-3)、C22：1(n-9)比闽粤东族大黄鱼中要高很多，而闽粤东族大黄鱼中C18：0、C18：1(n-9)和C20：4(n-6)则要明显比岱衢族大黄鱼高。

其中，C18：1(n-9)也记为C18：1n-9或C18：1；C20：1(n-9)也记为C20：1n-9或C20：1；C22：1(n-9)也记为C22：1n-9或C22：1；C20：5(n-3)也记为C20：5或C20：5n-3；C20：4(n-6) 也记为C20：4或C20：4n-6。

(五)鉴别分析

脂肪酸的数据结果导入SIMCA-P+11.5软件(瑞典Umetrics AB公司，Umea)进行主成分分析(principal component analysis，PCA)、偏最小二乘法辨别分析(partial leastsquares discriminate analysis，PLS-DA)和正交偏最小二乘法辨别分析(Optimizedpartial least squares discriminate analysis，OPLS-DA)。

通过无监督模式的PCA分析两种地理种群大黄鱼有着明显的类群差别，而且越小的大黄鱼差别越大，两种最大的大黄鱼比较接近。

PLS-DA分析：将岱衢族、闽-粤东族分为二组，进行有监督模式的识别分析即 PLS-DA分析(图1)。岱衢族大黄鱼与闽-粤东族大黄鱼在第一主成分方向上明显分为两个区域。

OPLS-DA分析：将岱衢族大黄鱼与闽-粤东族大黄鱼进行OPLS-DA分析。在第一主成分方向上，两者种类的分布有着显著的差异；而在第二主成分方向上，无论是那类大黄鱼都有着同样的与生长时间紧密相关的分布趋势。结合表2可看出C16：0、 C16：1(n-9)、C18：1(n-9)、C22：5(n-3)含量随年龄增加而增加的，而12-M-C15：0、C18：0、 C18：2(n-6)、C20：2(n-7)、C20：5(n-3)、C22：1(n-9)、C22：6(n-3)、C24：1(n-9)含量随年龄增加而减小的。

脂肪酸标志物分析：为了确定是哪种脂肪酸造成了两类大黄鱼的聚类差异，从相对岱衢族大黄鱼的S-载荷图(图3)可见，根据变异权重参数(VIP)分别提取出对样品差异分布有重要贡献的脂肪酸变量。观察权重靠前的脂肪酸种类(表3)，主要有5种脂肪酸在两种大黄鱼的分布中占有最大的权重，分别是是18、20、22碳n-9位单不饱和脂肪酸以及EPA和AA。

表3.权重靠前的脂肪酸

从相对岱衢族大黄鱼的S-载荷图可见，20：1(n-9)、22：1(n-9)以及EPA在岱衢族大黄鱼中含量明显比闽-粤东族要高，而18：1(n-9)和AA明显要比闽-粤东族要低。另外，从表2中可以看出，两类大黄鱼间总SFA、MUFA、和PUFA没有明显整体差别。

这些脂肪酸的组成在直观的数据上很难直接判别(见表4)。但进一步分析发现，C18：1/(C20：1+C22：1)和C20：5/C20：4的比值参数可作为岱衢族大黄鱼的判别生化指标(表4和图2)：当[C18：1/(C20：1+C22：1)]＞5.0或/和C20：5/C20：4＜4.0，可以判别为闽-粤东族大黄鱼；当[C18：1/(C20：1+C22：1)]＜5.0或/和C20：5/C20：4＞4.0，可以判别为岱衢族大黄鱼。

对2条野生岱衢洋大黄鱼(DQS1和DQS2)的脂肪酸组成进行测定(表4和图2)，基于脂肪酸组成比值的大黄鱼种群判别公式可判定其为岱衢族大黄鱼。

表4岱衢族和闽-粤东族大黄鱼的差异脂肪酸含量及比值

岱衢族大黄鱼具有明显区别于闽-粤东族大黄鱼的脂肪酸标记物(关键脂肪酸)，而这些关键脂肪酸的定量比值可更加大其区分度，包括：C18：1/(C20：1+C22：1)和 C20：5/C20：4，从而简化鉴别方法而准确率更高。C18：1(n-9)、C20：1(n-9)、C22：1(n-9)属于大黄鱼能自身合成脂肪酸，C18：1(n-9)可通过脂肪酸延长酶生成C20：1(n-9)和 C22：1(n-9)，C20：1(n-9)和C22：1(n-9)也可通过氧化生成C18：1(n-9)，因而采用 C18：1/(C20：1+C22：1)能反应两种地理种群大黄鱼的种质特性。

本实施例中发现随着鱼龄增大两种地理种群大黄鱼的脂肪酸组成趋近，虽然关键脂肪酸的定量比值加大了区分度，但4龄岱衢族大黄鱼C18：1/(C20：1+C22：1)比值达到4.6和4.9(表4和图2)，与划定的区分值5非常接近；按照制定判定标准，大龄大黄鱼的误判率将升高，尽管28月龄的岱衢族大黄鱼C18：1/(C20：1+C22：1)比值达到16以上，因此对于2龄以上大黄鱼的鉴别通过本研究的脂肪酸标记技术和课题组先前研究分子标记技术(沈锡权，何萌萌，严小军，等.岱衢族大黄鱼(Pseudosciaena crocea)线粒体基因组全序列的扩增及其特异鉴别引物的开发[J].海洋与湖沼，2013，44(3)：755-762.)结合将更加准确。本实施例对2条野生岱衢洋大黄鱼的脂肪酸组成进行测定(表4和图2)，基于脂肪酸组成比值的大黄鱼种群判别公式可判定其为岱衢族大黄鱼。

本实施例采取同一海区，相同饲料喂养的岱衢族和闽粤东族大黄鱼作为试验材料，以减少养殖环境和摄食饲料的影响。李桑等(李桑，陈春燕，黄旭雄，陈乃松，龚续.植物油部分替代饲料中鱼油对大黄鱼脂肪及脂肪酸的影响[J].上海海洋大学学报，2015，24(5)：726-736.)研究表明大黄鱼肝脏的脂肪酸组成相对肌肉更易受到摄食饲料脂肪酸组成情况的影响；随着各实验组饲料中C18：1n-9、C18：2n-6含量的逐步上升，肝脏中C18：1n-9和C18：2n-6含量表现相应的上升趋势，而肌肉中则呈现出先降低后稍升高；E组饲料中EPA和DHA的含量比F组高，鱼体肝脏的EPA和DHA绝对含量E组显著高于F组，而肌肉中却呈现出E组显著低于F组；大黄鱼肝脏的脂肪酸组成总体上随着饲料脂肪酸组成的变化而出现相似变化，而肌肉所受饲料脂肪酸组成的影响较肝脏小。大西洋鲑内脏总脂绝对含量约80％，而总脂组成中TAG占比94％以上而磷脂不到 1％，而白肌中总脂绝对含量约4％，而其中TAG和磷脂的比例约73％和20％(Nanton D A，Vegusdal A，A M B，et al.Muscle lipidstorage pattern，composition，and adipocyte distribution in different parts ofAtlantic salmon(Salmo salar)fed fish oil and vegetable oil. Aquaculture，2007，265(1-4)：230-243.)。TAG通常用来储备能量，其对饲料中所含脂肪酸种类缺少选择性，而磷脂作为细胞膜结构的重要组成部分呈现出吸收特定脂肪酸的特性 (Tanamati，A.，Stevanato，F.B.，Visentainer，J.E.L.，Matsushita，.et al.Fatty acid composition inwild and cultivated pacuand pintadofish.European Journal of Lipid Science &Technology， 2009，111，183-187；Olsen R E，Taranger G L，T，et al.Improvedmethod for triacylglycerol-derived fatty acid profiling by various non-lethaland lethal sampling techniques in Atlantic salmon.Aquaculture EnvironmentInteractions，2013，4(3)：251-261.)。因此采用肌肉脂肪酸组成的特异性来区分岱衢族和闽粤东族大黄鱼比较合适，尤其是采用背部侧线位置肌肉的脂肪酸组成，背部侧线位置肌肉的TAG占比更少，而磷脂的比例高。

本实施例采取同一海区喂养相同饲料的岱衢族和闽粤东族大黄鱼作为试验材料，以减少养殖环境和摄食饲料的影响。而岱衢族大黄鱼C20：1(n-9)和C22：1(n-9)含量高于闽- 粤东族而C18：1(n-9)含量整好相反，这表明其应更受自身遗传方面的影响。岱衢族大黄鱼在磷脂酰胆碱为主要极性脂类的C18：1，C22：1和C20：4等关键脂肪酸含量方面显著区别于闽-粤东族大黄鱼。从PC中脂肪酸变化看基本吻合上述总脂肪酸的变化趋势，所有带C22：1、EPA的PC在岱衢族中含量均比闽东族高，所有带18：1和20：4的PC包括神经酰胺在闽东族中含量均比岱衢族高，跟总脂肪酸变化不同的是带20：1的脂类没有显示同样的变化趋势。研究表明在小鼠中冷诱导型基因Elovl3行使此功能，此基因敲除会导致肝和褐色脂肪组织中C20：1(n-9)和C22：1(n-9)含量降低，而C22：1(n-9)可能是脂肪酸代谢中的重要信号分子；Elovl3基因敲除小鼠皮毛蓬松，皮肤屏障功能受损，御寒能力差，体重不易增加(Zadravec D.Metabolic Significance of Fatty Acid Elongation.Universitetsservice AB，Stockholm，2010.)。因此这个生化功能的差异可能与岱衢族大黄鱼相对于闽粤东族更能适应低温环境的地理种群特征相一致。

然而越小的大黄鱼脂肪酸组成差别越大，随着其生长两种大黄鱼脂肪酸组成逐渐接近。可能因其幼小时肌肉中的脂肪积累少磷脂的比例高，然而随着其生长在养殖环境中肌肉中的脂肪不断积累，肌肉组织总脂中TAG的含量提升而磷脂含量不变；TAG对脂肪酸选择特异性小深受饲料中脂肪酸组成的影响，因此喂养相同饲料的两种地理种群大黄鱼，其脂肪酸组成有趋同之势。张薇等(张薇，徐善良，沈勤，等.大黄鱼鱼种阶段脂肪酸组成研究[J].水产科学，2009，28(3)：117-121.)研究发现随着大黄鱼鱼体成长，肌肉中的脂肪不断累积，总脂的绝对含量从3月龄的71.82mg/g上升到6月龄的125.58mg/g，当鱼类摄入过高能量又不能及时消耗和转化时，便会以体脂的形式暂时储存在肌肉等组织中。而通过对2龄野生和养殖岱衢族大黄鱼肌肉的脂肪酸测定分析发现，养殖岱衢族大黄鱼的总脂含量比野生大黄鱼高1倍以上，而它们的FFA和磷脂(主要是PE和PC) 含量相差不大，养殖岱衢族大黄鱼的TAG含量占比达到58.22％，因此其总脂的增量就体现在TAG含量上(徐继林，严小军，罗瑜萍，等.岱衢族野生大黄鱼与养殖大黄鱼肌肉脂类和脂肪酸组成的比较研究[J].中国食品学报，2008，8(1)：108-114.)。