UL43蛋白在制备预防和治疗线粒体功能障碍的药物中的应用

摘要

本发明公开了UL43蛋白在制备预防和治疗细胞线粒体功能障碍的药物，以及制备预防和治疗代谢综合征的药物中的应用。本发明通过实验发现UL43蛋白能够从宿主细胞膜上内吞到胞内，并定位到宿主细胞的线粒体上，同时，UL43蛋白可以增加糖酵解途径中PFK‑1和PK酶的活性，产生大量的丙酮酸进入线粒体，进一步激活TCA循环和氧化磷酸化过程，从而提升胞内的ATP含量，实现对线粒体功能障碍和代谢综合征疾病的治疗。

说明书

技术领域

本发明属蛋白研究和应用机制领域，更具体地说，本发明涉及一种能用于预防和治疗细胞疾病的药物的UL43蛋白。

背景技术

单纯疱疹病毒（Herpessimplexvirus，HSV）属于α-疱疹病毒，病毒粒子是一个直径为186 nm的球形粒子，如图1-1所示，成熟的HSV在形态上主要包括四种组分：核心包括病毒线性双链DNA基因组，缠绕成纤丝卷轴；衣壳呈二十面体对称结构，直径为100 nm，由162个互相连接呈放射排列且中空轴孔的壳粒组成的，具有保护病毒基因组的作用；衣壳外环绕一层形态比较松散的蛋白质区域，厚薄不均，称为被膜；最外层为典型的具有脂质双层膜结构的囊膜，上面有突起，包含大量的包膜糖蛋白，有囊膜的病毒直径为150～200 nm。HSV-1基因组编码大约90个转录单位，至少编码84种蛋白。其中有5个基因可以编码衣壳蛋白，如UL19（VP5）、UL35（VP26）、UL38（VP19C）、UL18（VP23）、UL26.5（VP22a or ICP35）；至少有14种病毒来源的蛋白存在于病毒的被膜中，并在病毒的进入和病毒粒子形成过程中发挥着重要作用；囊膜上目前发现至少包括11中糖蛋白（gB、gC、gD、gE、gG、gH、gI、gK、gL、gM和gN）和四种非糖蛋白（UL9、UL20、UL24、UL43）。UL43蛋白是一个高度保守的多跨膜蛋白，在疱疹病毒中UL43蛋白仅在α和γ类疱疹病毒中编码（表1-2）。HSV-1病毒中的UL43基因和PRV中的UL43基因一样在病毒复制的早期就被转录和翻译成UL43蛋白。Carter等人研究表明，HSV-1病毒的UL43蛋白的分子量大小约为34kDa，要比利用UL43基因的开放阅读框（ORF）预测的分子量要小的多。在EBV病毒中UL43的同源基因为BMRF2基因，编码蛋白的分子量大小约为53-55kDa，Johannsen 和Tugizov等人研究发现BMRF2蛋白表达在病毒的包膜上，能够通过RGD基序与细胞整合素相互作用介导上皮细胞的极化从而完成EBV的侵染过程。有趣的是，Wardf等人研究发现，UL43基因的反义阅读框为UL43.5基因，所编码的蛋白为UL43.5蛋白，与UL43基因表达不同的是UL43.5属于晚期基因。HSV-1病毒的UL43.5蛋白定位在宿主细胞核，能够与主要的衣壳蛋白ICP5（infected cell protein 5）和衣壳支架蛋白ICP35在结构上与那些相关的病毒DNA合成明显不同。因此，UL43.5蛋白推测是一个参与病毒衣壳组装结构相关的蛋白。UL43蛋白作为病毒囊膜蛋白中仅有的四个多跨膜蛋白（gK、gM、UL20和UL43）之一，为病毒的非必需蛋白，在体内和体外病毒的复制和病毒生长都不是必需的。仅Barbara等在2005年发表研究表明，PRV UL43蛋白在体外瞬时表达时可能与gM的功能类似，通过调节其他糖蛋白的作用来抑制膜融合过程。

通过查询NCBI可知，UL43蛋白为多跨膜蛋白，Barbara等人的研究成果显示，在PRV病毒中UL43蛋白预测结构为九跨膜结构，在胞内区含有一段较长的亲水环。Ren和Melancon等人分别研究显示，gK和UL20中同样含有YXXΦ基序，但是当Y（酪氨酸）突变为A（丙氨酸）之后，会影响病毒囊膜蛋白的内吞，进而抑制病毒的胞间传播和组装、释放。同样作为多跨膜蛋白，UL43蛋白在HSV-1成功感染宿主细胞后能够表达在宿主细胞膜上，但是在胞内新病毒的组装过程仍需要各个膜蛋白，所以在宿主细胞内我们初步推断UL43基因利用胞内原料合成UL43蛋白表达在宿主细胞膜上，然后在进入到胞内参与新病毒的组装释放过程。目前，人们对HSV-1 UL43蛋白的功能研究和作用机制上不清楚，UL43蛋白的多跨膜结构的特殊性与其在病毒生命周期中发挥的功能是一个值得探讨的科学命题。

细胞的能量代谢是经过一系列的酶催化的连续反应，为机体提供能量。生物体一切生命活动所需的能量，主要来源于体内糖、脂肪和蛋白质的氧化分解，这三类营养物质中蕴藏着能被机体利用的化学能，它们是机体活动的能源物质，线粒体是真核生物进行氧化代谢的部位，负责的最终氧化的共同途径是三羧酸循环与氧化磷酸化。其中，机体所需能量的70%以上是由食物中糖类物质提供的，它的消化分解产物葡萄糖被吸收入血液后，主要通过糖酵解和氧化磷酸化途径最终在线粒体内合成ATP，为细胞供能。

糖的有氧氧化（aerobic oxidation）是机体获得能量的主要方式，有氧氧化的调节是为了适应机体或者是不同器官对能量的需要。糖的有氧氧化大致可分为三个阶段：第一阶段为葡萄糖的糖酵解（glycolysis）途径，一分子葡萄糖转变成两分子的丙酮酸，在细胞液中进行；第二阶段为乙酰辅酶A（CoA）的生成，丙酮酸进入线粒体，由丙酮酸脱氢酶复合体催化，经氧化脱羧基转化成乙酰CoA；第三阶段为三羧酸循环（TCA）以及氧化磷酸化，包括电子的跨膜传递生成的ATP和底物水平磷酸化生成的ATP，同时生成二氧化碳和水。在糖的有氧氧化中的关键酶是：丙酮酸脱氢酶系、柠檬酸合酶、异柠檬酸脱氢酶，这三种酶在糖有氧氧化中起到关键作用。己糖激酶、6-磷酸果糖激酶-1（6-phosphofructokinase 1，PFK1）和丙酮酸激酶（pyruvate kinase，PK）是糖酵解过程中的限速酶，分别催化3个不可逆的反应。

机体对能量的需求变化很大，因此糖的有氧氧化的速率必须加以调节。在正常的情况下，糖酵解途径和TCA循环的速度是相协调的，糖酵解产生多少丙酮酸，TCA循环就正好需要多少丙酮酸来提供乙酰CoA。目前认为调节糖酵解途径流量最重要的是PFK-1的活性，ATP和柠檬酸是此酶的变构抑制剂，AMP、ADP、1,6-二磷酸果糖和2,6-二磷酸果糖均是此酶的变构激活剂，因此胞内的ADP/ATP的比率会影响糖酵解途径的流量。在糖的有氧氧化中丙酮酸脱氢酶复合体可通过变构效应和共价修饰两种方式进行快速调节，反应产物乙酰CoA和NADH+H⁺对酶有反馈抑制作用，另外，ATP对此酶也具有抑制作用，AMP则具有激活作用。

腺苷酸转位酶（adenine nucleotide transporter，ANT），也称为腺苷酸载体（AAC），是靶定在线粒体内膜上的功能蛋白，主要负责细胞质与线粒体之间腺苷酸的交换。ANT单体包含三个大小约为100个氨基酸的同源重复的区域，每个同源重复区是由两个跨膜的α-螺旋组成，共六个（TM1-TM6）；分别被线粒体基质侧的三个环（Repeat1- Repeat3）和膜间隙侧两个环所连接，其中基质侧的三个重复环还分别含有三个同源序列（h1-2、h3-4、h5-6）；ANT蛋白序列的N端和C端均位于膜间隙中。同样，ANT蛋白在螺旋h2、h4、h6处分别具有三个底物绑定位点Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，在不同的生物体的直接同源蛋白中这三个绑定位点具有高度保守性，绑定位点Ⅱ会因不同的底物类型有所区别。腺嘌呤核苷酸通过G-[IVLM]形成的疏水区域与ANT绑定位点Ⅱ相互结合，磷酸基团通常是通过[RK]结合ANT绑定位点Ⅰ和Ⅲ。ANT蛋白还具有两个保守的呈对称结构的氨基酸序列，线粒体基质侧在奇数螺旋结构上由P-X-(D/E)-X-X-(R/K)模块构成，线粒体内外膜间隙侧在偶数螺旋结构上由(F/Y)-(D/E)-X-X-(R/K)模块构成。这两个模块带电的残基能够形成盐桥的网络结构，分别命名为线粒体网络结构和细胞质网络结构。ANT蛋白的六个跨膜螺旋结构相互倾斜，能够形成一个类似“篮筐”状的孔穴结构，当孔穴结构朝向膜间隙时构成c构象，当孔穴结构朝向线粒体基质时构成m构象。ANT蛋白中奇数螺旋中保守的P-X-(D/E)-X-X-(R/K)模块为c构象时能够阻止进入线粒体的通道，然而偶数螺旋中保守的(F/Y)-(D/E)-X-X-(R/K)模块为m构象时能够阻止进入线粒体内外膜间隙的通道。

ANT蛋白能够将线粒体中产生的ATP^{4->转运到细胞质中，并将细胞质中合成ATP的原料ADP3->转运至线粒体基质。但是这种转运能够受到膜电位的调控，主要表现为对底物的亲和力和最大转运速率的变化，当线粒体膜电位高于100 mV时，转运速率随膜电位的升高而加快；当线粒体的膜电位低于100 mV时，其转运速率随膜电位的降低而减慢。ANT蛋白在细胞中同电压依赖性阴离子通道（VDAC）一起构成线粒体通透性转运孔（MPTP），当受到Ca+、CAT等刺激时MPTP能够允许分子量小于1.5>}

发明内容

本发明的目的在于：进一步对UL43蛋白进行研究，确定其在细胞中的定位和作用机制，使其在疾病治疗中发挥作用。

为了实现上述发明目的，本发明根据实验发现，UL43蛋白可用于制备预防和治疗细胞线粒体功能障碍的药物，还可用于制备预防和治疗代谢综合征的药物。

为了实现上述发明目的，本发明还提供了一种预防和治疗细胞线粒体功能障碍的药物，其包括有效剂量的作为活性成分的UL43蛋白、UL43蛋白衍生物、UL43蛋白的药用盐，或UL43蛋白的活性肽段，以及药学上可接受的载体。

为了实现上述发明目的，本发明还提供了一种预防和治疗代谢综合征的药物，其包括有效剂量的作为活性成分的UL43蛋白、UL43蛋白衍生物、UL43蛋白的药用盐，或UL43蛋白的活性肽段，以及药学上可接受的载体。

相对于现有技术，本发明通过实验发现UL43蛋白能够从宿主细胞膜上内吞到胞内，并定位到宿主细胞的线粒体上，同时，UL43蛋白可以增加糖酵解途径中PFK-1和PK酶的活性，产生大量的丙酮酸进入线粒体，进一步激活TCA循环和氧化磷酸化过程，从而提升胞内的ATP含量，因此可知，UL43蛋白可用于对线粒体功能障碍和代谢综合征疾病的治疗，拓宽了UL43蛋白的应用领域。可以理解的是，蛋白功能主要依赖于蛋白上的活性肽段发生活性作用，因此，UL43蛋白的活性肽段也可以用于对线粒体功能障碍和代谢综合征疾病的治疗。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式，对本发明及有益效果进行详细说明。

图1为质粒图谱和构建模型，A：pFLAG-CMV-2质粒的图谱；B：构建带有flag标签的UL43模型图。

图2为HSV-1 UL43蛋白的多跨膜结构。

图3为构建真核表达载体PCR产物，其中，M为Mark，1~2为质粒pHUL43 PCR产物；3~4：突变型质粒pHUL43（Y144A）PCR产物。

图4为PCR产物测序部分结果。

图5为蛋白表达结果，其中，1、2：(f)UL43，即带有Flag标签的UL43；3、4：(f)UL43(Y144A)，即带有Flag标签的UL43(Y144A)。

图6为UL43蛋白的内吞以及胞内定位实验结果。

图7为UL43蛋白影响细胞糖酵解途径，A：葡萄糖摄取量；B：胞内ATP含量；C：PFK-1酶活力；D：LDH酶活力；E：PK酶活力；* 代表p><0.05。

图8为UL43蛋白影响氧化磷酸化过程，A：复合体Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ亚基mRNA表达水平；B：蛋白表达水平；* 代表p><0.05。

图9为免疫共沉淀结果。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案和有益技术效果更加清晰，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的实施例仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明，实施例的参数、比例等可因地制宜做出选择而对结果并无实质性影响。

实施例1 HSV-1 UL43蛋白内吞作用以及胞内定位实验

UL43蛋白属于多跨膜蛋白，在HSV-1成功侵染宿主细胞后UL43蛋白能够表达在宿主细胞膜上，经过前期研究显示，UL43蛋白的氨基酸序列中含有内吞基序。因此，本实施例主要探究HSV-1 UL43蛋白是否依赖YXXΦ基序的从宿主细胞膜上内吞到胞内，以及UL43蛋白的胞内定位。

实验材料：

HSV-1 UL43真核表达质粒pHUL43、HSV-1 UL43（Y144A）突变型表达质粒pHUL43（Y144A）、标记Flag标签的UL43表达质粒pCMV(f)UL43、标记Flag标签的UL43突变型质粒pCMV(f) UL43(Y144A)。真核表达载体pCDNA3.1+购自Invitrogen公司，质粒pFLAG-CMV-2购自Sigma公司。

单纯疱疹病毒F株（HSV-1 F）、菌株DH5α受体菌和HEK293T细胞均为市售购买。

主要试剂请参见表1。

表1 主要试剂

主要溶液：

LB液体培养基：称取酵母提取物 0.5 g，胰蛋白胨 1.0 g，NaCl 1.0 g，溶于100 ml蒸馏水中，水浴溶解，调至PH 7.2，121℃高压蒸汽灭菌20 min，4℃保存备用。加10%-15%的琼脂在灭菌后，即为LB固体培养基。

SDS-PAGE电泳缓冲液：称取Tris 15.15 g、甘氨酸93.85 g、SDS 5 g溶于1000 ml蒸馏水中，配置成5×母液，4℃保存备用。使用时，用蒸馏水将母液稀释稀释5倍成1×工作液。

转膜缓冲液：称取Tris 29 g、甘氨酸14.5 g、SDS 1.85 g和量取1000 ml甲醇溶于4000 ml蒸馏水中，均匀搅动使其充分溶解，4℃保存备用。

TBST缓冲液：称取NaCl 400 g和Tris-Base 121 g溶于4000 ml蒸馏水中，调至PH8.0，加蒸馏水定容到5000 ml，配成10×TBS缓冲液母液，室温保存备用。加入蒸馏水稀释10倍配置为浓度1× 的工作液，取500 ml加入0.5 ml吐温-20，摇动混匀，现配现用。

封闭缓冲液：称取脱脂奶粉10 g溶于200 ml TBST缓冲液中，即为5%脱脂奶粉溶液，4℃保存备用。

抗体稀释液：称取BSA粉末10 g溶于200 ml TBST缓冲液中，即为5% BSA溶液，4℃保存备用。

显影液：将购买的显影粉1包溶于300 ml 蒸馏水中，加热至温度50℃，待完全溶解后，再加入显影粉2包，蒸馏水定容至体积1000 ml，室温避光保存。

定影液：将购买的定影粉1包溶于1000 ml蒸馏水中，均匀搅动使其充分溶解，分装到可避光的棕色瓶中，室温保存备用。

实验方法：

利用http://bp.nuap.nagoya-u.ac.jp/sosui在线网站，对HSV-1 UL43蛋白质跨膜结构进行预测分析；同样利用NetPhos 2.0程序进行预测UL43蛋白质的磷酸化位点。

根据NCBI上查询到的HSV-1 UL43基因的序列号（NC_001806.2），利用Primers5.0软件设计引物UL43-for和UL43-rev用于HSV-1 UL43的扩增，还有引物UL43 Y144A-s和UL43Y144A-as用于UL43点突变体的构建。引物由上海生工公司合成。

表2 突变体构建所用引物

注：引物序列中同源于HSV-1 UL43基因序列的部分为正常字体，下划线部分为引入酶切位点，小写字体部分为点突变位点。

取单层HEK293T细胞用于HSV-1病毒培养，当约有75%细胞发生病变时，收集并处理病毒液，最终获得HSV-1基因组并作为目的基因扩增模板。具体操作步骤如下：

（1）取单层HEK293T细胞，弃去原细胞培养液，用PBS缓冲液反复冲洗3次，充分去除死亡或者未贴壁的细胞。

（2）从-80℃冰箱中取出HSV-1病毒，并溶解。

（3）取200 μl病毒加入到细胞中，均匀混合，置于培养箱中。每隔15-20 min摇匀一次，使病毒完全吸附细胞。

（4）约2 h后病毒可完成侵染细胞，加入4 ml新鲜细胞培养液，置于37℃、5% CO₂培养箱中培养过夜。

（5）第二天早，在倒置显微镜下观察细胞形态，约有75%的细胞变成圆形并且折光率增加，即说明病毒已成功侵染细胞。

（6）用吸管充分吹打均匀后，每管200 μl分装于冻存管中，-80℃保存备用。

（7）取适量病毒液，在100℃水浴煮10 min，然后12000 rpm离心5 min，离心沉淀即为目的基因扩增模板。

利用引物UL43-for和UL43-rev（如表2）扩增HSV-1 UL43目的基因，并纯化回收PCR产物。

PCR反应体系如下：

10×PCR Buffer5.00 μlDNA聚合酶0.25 μldNTP（2.5mM）2.00 μlMgCl₂1.50 μlUL43-for（10μM）1.00 μlUL43-rev（10μM）1.00 μl模板4.00 μlddH₂O12.75 μl总计25.00 μl

PCR条件设置：94℃5 min，94℃1 min，55℃1 min，72℃1 min30 s，30个循环；72℃ 10min。PCR结束后，将PCR产物置于4℃保存，1%琼脂糖凝胶电泳分离鉴定。

使用浓度为1%的琼脂糖凝胶进行核酸电泳验证PCR的产物。利用胶回收试剂盒对目的片段进行回收、纯化。具体操作步骤如下：

（1）电泳结束后，在紫外照射下用已灭菌的干净的切胶刀将含有DNA片段的亮条带的琼脂糖胶块切下。切胶时，尽可能的将空琼脂块切除,且切胶的速度要快，防止DNA损失的过多。

（2）按每1 mg凝胶约为1 μl凝胶体积来换算，加入3倍体积量的Buffer W1于EP管，65℃水浴10 min，均与摇动至凝胶完全溶解。

（3）再向EP管中加入Buffer W2 体积为Buffer W1用量的一半，均匀混合，12000rpm离心30 s，弃上清，重复操作一次。

（4）用洗涤液漂洗两次，12000 rpm离心1 min，弃上清。

（5）加入35 μl Eluent静止5 min，12000 rpm离心2 min，洗脱DNA，即可得到纯化的目的DNA。

pHUL43质粒为市购得到。利用重叠延伸PCR产生特异位点突变方法制备突变型pHUL43（Y144A）质粒，将UL43基因第430-432位的碱基由TAT突变为CGT，即对应UL43蛋白第144位的氨基酸由酪氨酸（Y）突变为丙氨酸（A）。根据基因定点突变试剂盒，步骤如下：

（1）利用UL43 Y144A-s和UL43 Y144A-as引物（如表2），在引物中段分别导入突变核苷酸GCC和GGC，分别与扩增UL43基因的上游引物UL43-for和下游引物UL43-rev配对使用，即引物UL43-for和引物UL43 Y144A-s配对，引物UL43 Y144A-as和引物UL43-rev配对，均以pHUL43质粒为模板。分别PCR扩增拟突变位点上下游的DNA序列，所得片段末端均带有突变核苷酸。

（2）将带有突变核苷酸的片段重叠延伸连接。最后将获得的PCR产物测序验证。

（3）PCR产物回收纯化操作同前。

（4）同样将突变的UL43基因构建到质粒pCDNA3.1+中，得到突变型pHUL43（Y144A）质粒，-20℃保存备用。

UL43基因定点突变反应体系设置如下：

Nuclease-Free Water30 μlReaction Buffer（10×）5 μl引物（10μM each）2 μldNTP Mix（2.5mM each）4 μlpHUL43质粒模板1 μl总体积49 μl

PCR反应条件：95℃1 min，95℃40 s，60℃1 min，68℃1 min30 s，20个循环；72℃10min。PCR结束后，将PCR产物置于4℃保存，1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

制备表达质粒pCMV(f)UL43和pCMV(f) UL43(Y144A)：

（1）以UL43-for和UL43-rev为上下游引物，分别以pHUL43质粒和pHUL43（Y144A）质粒为模板，分别进行独立的PCR过程，PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，回收纯化DNA。

（2）将UL43和突变UL43回收的PCR产物分别进行EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切，在回收产物。

（3）同时，EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切pFLAG-CMV-2空质粒（如图1），制备pFLAG载体大片段。

（4）将UL43和突变UL43双酶切后回收产物分别与pFLAG载体大片段混合，在T4 DNA连接酶的作用下，分别获得标记Flag标签的UL43表达质粒pCMV(f)UL43和标记Flag标签的UL43突变型质粒pCMV(f) UL43(Y144A)。

感受态细胞制备：

（1）取实验室冻存的DH5α菌种接种于LB平板中，37℃培养16 h。

（2）挑取单菌落接种于50 ml LB液体培养基中，37℃培养至OD值为0.5左右（范围0.4-0.6）。

（3）将25 ml菌液移至预冷的50 ml EP管中，在冰上放置30 min，使培养物冷却到0℃，4℃，4000 rpm低温离心10 min，弃上清，回收菌体。

（4）加入5 ml预冷的0.1 mol/L的CaCl₂，重悬每份沉淀，放置于冰浴上30>

（5）加入1 ml 用冰预冷的0.1 mol/L的CaCl₂（含15%甘油）重悬菌体沉淀。

（6）在冰上将细胞分装成小份，100 ul/份，-80℃冻存备用。

重组质粒的转化：

（1）取适量DH5α感受态细胞,向其中加入9 μl连接反应物后的产物, 混匀, 冰浴 30min；

（2）放入42℃水浴，热休克 2 min；立即转移到冰水浴中冷却1 min；

（3）冷却后向其中加入400 μl LB液体培养液，37℃, 180 rpm, 震荡培养1 h，使其活化

（4）涂布于含X-gal, IPT, Amp的LB固体培养基上，置于37℃生化培养箱15 min，待菌液吸收完全后，倒置培养16-20 h。

质粒的鉴定与提取：

挑取白色菌落接种于5 ml LB液体培养基（含氨苄抗性）中，过夜培养，根据质粒小提取试剂盒，操作如下：

（1）取2 ml细菌培养物，12000 rpm离心1 min，弃上清，并加入250 μl溶液1（含有RNaseA），震荡，使沉淀彻底悬浮。

（2）向EP管中加入溶液2，上下翻转6-8次。同样加入溶液3，上下翻转6-8次，充分混匀。12000 rpm离心10 min，将上清移至另一EP管中。

（3）将上清加入吸附柱中，室温放置2 min，12000 rpm 离心1 min，弃废液，将吸附柱重新放回收集管中。

（4）向洗脱柱中加入 750 μl 的洗柱液，离心1 min (12000 r/min)，弃液，向其中倒入 250 μl的洗柱液， 离心 5 min (12000 r/min) 后，弃液。

（5）向柱子中加入50 μL的去离子水，静置 2 min，离心收集液体，-20℃保存备用。

脂质体转染：

根据Lipofectamine 2000脂质体转染试剂盒，具体操作如下：

（1）在24孔板中每孔0.5-2× 10⁵个细胞接种于500>

（2）用50 μl Opti-ME I无血清培养基稀释质粒DNA，轻轻混匀。取适量Lipofectamine 2000在50 μl Opti-ME I培养基中稀释，室温孵育5分钟。

（3）将前两步所稀释的DNA和Lipofectamine 2000混合（使总体积为100 μl），轻轻混匀，室温放置20分钟。

（4）每孔细胞中加入100 μl转染液，轻轻摇匀。

（5）37℃，5%CO₂培养转染4-6>

目的蛋白的鉴定：

通过Western blotting来检测HSV-1 UL43蛋白和突变型UL43（Y144A）蛋白的表达情况，具体操作步骤如下：

（1）制胶：配置12%的分离胶并注入玻璃板间隙至离上边缘1.5 cm处，上层加适量75%乙醇；待凝固，倒掉上层液体，注入5%浓缩胶，插入梳子，自然晾干。

（2）上样：将蛋白质样品100℃水浴3 min，在电泳槽中倒入新配置的电泳液，分别在两边泳道加入8 μl和5 μl蛋白maker，用1×蛋白上样缓冲液补足体积到10 μl，其余泳道各加10 μl样品，50 V恒压跑电泳。

（3）转膜：电泳结束后，剪取11 cm×8 cm滤纸和合适大小的0.22 μm的PVDF膜，用甲醇活化5 min，按照“海绵-6层滤纸-凝胶-PVDF膜-6层滤纸-海绵”组装转印夹层，夹板组装后转移至转膜槽，200 mA恒流转移60 min。

（4）孵育抗体：转膜结束后，TBS液洗膜5 min，5%的脱脂奶粉封闭1 h，TBST液洗膜3次，每次5 min，加一抗稀释液4℃过夜孵育；TBST液洗膜3次，每次5 min，加二抗稀释液室温孵育1 h。

（5）发光检测：TBST液洗膜，加发光液孵育3 min，用滤纸吸干发光液，将胶片和PVDF膜放入压片盒中压片1 min，取出胶片定影30 s，用水清洗，烘干，扫描。

免疫荧光染色：

利用激光共聚焦显微镜观察转染后UL43蛋白和突变的UL43（Y144A）蛋白胞内定位，初步研究UL43的功能。具体操作如下：

（1）细胞铺板：将2 ml密度2×10⁵的细胞铺到4个皿中，37℃，5%CO₂培养过夜，细胞长成单层，弃旧培养基，PBS清洗，弃PBS液。

（2）转染质粒：利用试剂Lipofectamine 2000进行转染，步骤如2.3.7。

（3）细胞固定：4%的甲醛室温固定25 min，1×PBS清洗3次，每次10 min。

（4）0.2% Triton X－100透化2－5 min，1×PBS清洗3次，每次10 min，5%BSA室温封闭30分钟。

（5）加一抗小鼠抗Anti-flag单抗稀释液孵育，4℃过夜，加二抗羊抗鼠IgG-RBITC抗体稀释液，30 min，避光。

（6）1×PBS清洗3次，加入新鲜培养基清洗2次，在加入新鲜培养基37℃温育。

（7）通过激光共聚焦显微镜，吸收光：565 nm，发射光：590 nm，可以观察到明亮的红色荧光。

（8）线粒体的荧光标记：

a、去除旧的细胞培养液，加入Mito-Tracker Green染色工作液（37℃预温育），37℃在避光的环境下与细胞共孵育30 min。

b、弃去Mito-Tracker Green染色工作液，新鲜细胞培养液清洗细胞2次，再加入37℃预热的新鲜细胞培养液。

c、同样利用激光共聚焦显微镜观察线粒体形态，可观察到线粒体呈绿色荧光。

（9）利用Image J软件中的Colocalization Finder插件对激光共聚焦结果图的UL43蛋白（红色）和线粒体（绿色）的共定位情况进行量化分析。

统计学处理：

采用SPSS18.0软件分析数据，两组比较作t检验，多组均数间比较采用One-way>p﹤0.05或者p﹤0.01表示。

结果：

UL43蛋白结构分析：根据前期研究表明，HSV-1病毒的UL43蛋白结构被预测有八跨膜结构域，N端和C端均位于胞外区域，胞内区含有一段较长的氨基序列为亲水蛋白。通过蛋白的磷酸化位点预测可知，HSV-1 UL43蛋白含有丰富的磷酸化位点，其中丝氨酸磷酸化位点6个、苏氨酸磷酸化位点7个和酪氨酸磷酸化位点1个。

利用NCBI获得UL43蛋白的氨基酸序列，共417个氨基酸。通过UL43蛋白氨基酸序列分析可知，UL43蛋白共有6个序列符合YXXΦ基序，即YANA（aa 59-62）、YAWL（aa 91-94）、YAAL（aa 133-136）、YPLF（aa 144-147）、YWWI（aa 174-177）、YAAL（aa 351-354），结合UL43蛋白预测的结构综合分析可知，只有第144到147位氨基酸为YPLF位于胞内i2区域符合内吞基序的位置要求（图2），其他的5个序列均不符合要求。

质粒pHUL43和pHUL43（Y144A）构建结果：

经NCBI查询可知正常HSV-1 UL43基因大小约为1200 pb，利用引物UL43-for和UL43-rev，以构建的HSV-1 UL43真核表达载体质粒pHUL43和pHUL43（Y144A）为模板，PCR扩增产物，通过琼脂糖凝胶电泳均可以观察到扩增出的两条大约为1200 bp左右的特异性目的条带（如图3），与实验前预期结果一致。同时，测序结果表明UL43的430位的碱基由TAT突变为CGT（如图4），说明质粒和突变型质粒pHUL43（Y144A）构建成功。

HSV-1 (f)UL43蛋白和突变型 (f)UL43（Y144A）蛋白表达：

由于HSV-1 UL43蛋白暂时还没有特异性的抗体，所以通过pFLAG-CMV-2质粒构建如图1所示带有Flag标签的UL43，以HSV-1 UL43真核表达质粒pCMV(f)UL43和突变型UL43表达质粒pCMV(f) UL43(Y144A)转染HEK293T细胞后裂解液作为上样样品，经过Western blotting分析，在anti-Flag特异性抗体检测下，均发现在35 kDa左右有目的条带（Flag标签为1.01kDa，UL43为34 kDa，所以N端加Flag标签的UL43蛋白大小为35 kDa左右）。如图5所示，与实际相符，从蛋白水平特异性的鉴定了质粒pCMV(f)UL43和质粒pCMV(f) UL43(Y144A)均可以在HEK293T细胞中正常表达。

HSV-1 UL43蛋白的内吞：

病毒在侵染宿主细胞后病毒的膜蛋白能够留在或者表达在宿主细胞膜上，并且YXXΦ序列能够作为膜蛋白的内吞基序，介导病毒膜蛋白的内吞。因此，我们探究突变UL43的内吞基序后，观察UL43多跨膜蛋白是否可以从宿主细胞膜上内吞到宿主细胞内，正常地完成整个膜蛋白的内吞过程。

如图6A结果显示，由4℃转换到37℃后0 min时可以观察到两种质粒表达的蛋白均定位在宿主细胞膜上；30 min时，表达正常的UL43蛋白开始发生内吞，有部分UL43蛋白由宿主细胞膜上开始往胞内移动，60 min后，宿主细胞膜上大部分的UL43蛋白内吞到胞内；但是，表达突变内吞基序YPLF为APLF后，可以发现不管是30 min还是60 min，突变的UL43蛋白都只定位在宿主细胞膜上，没有发生内吞现象。因此，可以得出结论，HSV-1 UL43蛋白能够依赖YPLF内吞基序发生内吞，由宿主细胞膜上内吞到宿主细胞内。

通过对线粒体进行绿色荧光标记，发现如图6B所示，红色荧光和绿色荧光重合出现黄色荧光，Image J进行量化分析显示共定位，这说明HSV-1 UL43蛋白在内吞到宿主细胞内后能够定位到线粒体上。

HSV-1 UL43蛋白预测具有多个磷酸化位点的八跨膜蛋白，胞内i2区域的第144至147位氨基酸为YPLF预测为内吞基序。通过构建质粒pCMV(f)UL43和质粒pCMV(f) UL43(Y144A)，使UL43和突变型UL43蛋白带有Flag标签，通过PCR鉴定、基因测序以及Westernblotting分析确定了两种质粒构建成功。利用免疫荧光实验，通过激光共聚焦显微镜的观察可知，HSV-1 UL43蛋白是可以发生内吞现象，高度依赖于YPLF内吞基序，能由宿主细胞膜内吞到宿主细胞的线粒体上，可能影响宿主细胞的生理活动或者影响病毒的生命周期活动。

实施例2HSV-1 UL43蛋白胞内功能研究

通过实施例1可知，UL43多跨膜蛋白在宿主细胞内主要作用的器官为线粒体，而线粒体又作为细胞的供能器官，为细胞生命活动提供大量的ATP。因此，本部分主要探究HSV-1UL43蛋白对宿主细胞的线粒体产能途径的影响，以及UL43在线粒体上的定位靶点研究。

表3 主要试剂

实验材料来源葡萄糖检测分析试剂盒BioVision公司ATP含量测定试剂盒上海恪敏生物科技有限公司丙酮酸激酶试剂盒上海拜力生物科技有限公司果糖-6-磷酸激酶活性测定试剂盒上海索莱宝生物科技有限公司乳酸脱氢酶试剂盒上海拜力生物科技有限公司SsoFas EvaGreen SupermixBio-Rad公司小鼠抗Anti-Flag单抗上海爱必信生物科技公司羊抗鼠IgG- RBITC二抗上海瑞齐生物科技公司

表4 主要仪器

仪器名称来源多孔细胞培养板鼎国生物公司CO₂恒温培养箱SHEL-LAB公司低温冷冻离心机Beckman公司PCR扩增仪Biorad公司电泳仪北京六一仪器厂凝胶电泳成像分析系统UVP公司倒置光学显微镜Nikon公司酶标仪Thermo公司ATP生物发光仪美国NHD公司LightCycler 480 II实时荧光定量PCR系统Roche公司

主要溶液：

缓冲液A：500 mM Tris-HCl pH8.0，150 mM NaCI，0.1%TritoX-100。

缓冲液B：50 mM Tris-HCl pH8.0，0.1%TritonX-100。

抗体稀释液：称取BSA粉末10 g溶于200 ml TBST缓冲液中，即为5% BSA溶液，4℃保存备用。

实验方法：

以2× 10⁵的密度体积为2>2的皿，在CO₂培养箱中放置过夜即可以长成单层细胞，弃去旧的培养基用PBS冲洗2遍，去掉PBS。质粒pCMV(f)UL43和质粒pCMV(f)UL43(Y144A)利用脂质体转染的方法转染HEK293T细胞，如3.3.7所述。

葡糖糖含量检测：

根据葡萄糖检测分析试剂盒说明书操作：

（1）取质粒转染后0 h、4 h、8 h、16 h、24 h时间点的细胞培养基来测定葡萄糖含量。

（2）加入葡萄糖分析缓冲液把细胞培养基稀释100倍，取50μl稀释液加到96孔板中，并且加入等量的反应液（包含46 μl的葡萄糖分析缓冲液+2μl葡萄塘催化酶+2 μl葡萄糖底物），在25℃下反应30 min。

（3）测取OD值，设置酶标仪450 nm波长。

（4）计算浓度：

细胞摄取葡萄糖量=新鲜培养基中葡萄塘含量-各时间点处理的培养基中葡萄塘剩余含量

ATP含量测定：

根据ATP含量测定试剂盒说明书操作：

（1）在冰上溶解待用的试剂，利用ATP测定裂解液将ATP标准溶液稀释成0.1、1、10 μM/L的浓度，制备标准曲线。

（2）细胞培养皿中加入200 μl裂解液，反复吹打至充分裂解，4℃下12000 rmp离心10 min，取上清。

（3）稀释ATP检测工作液，每个样品重复3次，每个监测孔中加100 μl ATP检测工作液，室温放置5 min，消耗掉本地ATP，在检测孔中加上100 μl待测样品或标准样品，充分混匀，间隔2 s，立即用生物发光仪检测CMP值。根据计算公式利用测出的标准曲线计算待测样品中ATP浓度。

丙酮酸激酶活力检测：

根据丙酮酸激酶试剂盒说明书操作：

（1）取400 μl细胞提取液，超声波破碎细胞（功率20%，超声3 s，间隔10 s，重复30次），8000 g，4℃离心10 min，保存上清待用。

（2）将试剂盒中试剂四与试剂五混匀，37℃水浴5 min，加入30 μl样本，开始计时，在340 nm波长下记录 20 s时初始吸光度A1。

（3）之后快速将比色皿水浴37℃水浴中准确反应2 min，快速取出比色皿后用擦镜纸擦干，340 nm下比色，记录2 min20 s时的吸光度A2，计算△A=A1-A2。

（4）PK酶活力计算公式：PK(U/10⁴>

果糖-6-磷酸激酶活力检测：

根据果糖-6-磷酸激酶活性测定试剂盒的说明书操作：

（1）细胞处理同4.3.3中步骤一。

（2）按照PFK工作液800 μl、样本30 μl、试剂六5 μl、试剂七5 μl的顺序加入1 ml比色皿中，340 nm波长记录20 s时的吸光度A1。

（3）37℃水浴10 min，取出用擦镜纸擦干，340 nm下比色，测定10 min20 s时的吸光度A2，计算△A=A1-A2。

（4）PFK酶活力计算公式：同4.3.3中计算公式。

乳酸脱氢酶活力检测：

根据乳酸脱氢酶试剂盒说明书操作：

（1）细胞处理；

（2）按照样本50 μl、试剂一250 μl、试剂二50 μl（仅实验组加）、蒸馏水50 μl（仅对照组加），充分混匀，37℃水浴15 min。再加试剂三，继续水浴15 min。然后再加试剂四，充分混匀室温静置3 min，450 nm下测吸光度并记录；

（3）LDH酶活力计算公式：

LDH(U/10⁴>4>

Real Time PCR：

检测细胞的氧化磷酸化的水平，可以通过测定四个复合物的mRNA的表达水平，即NDUFB-3、SDHB、CYC-1、SURF-1。从NCBI上获得基因序列，委托TaKaRa公司设计四对引物（如表5）。按照说明书在冰上配置SsoFas EvaGreen Supermix等相关试剂。

表5 基因引物序列

GeneForward primerReverse primerNDUFB-3SEQ ID NO:5SEQ ID NO:6SDHBSEQ ID NO:7SEQ ID NO:8CYC-1SEQ ID NO:9SEQ ID NO:10SURF-1SEQ ID NO:11SEQ ID NO:12β-tubulinSEQ ID NO:13SEQ ID NO:14

反应体系如下：

SsoFas EvaGreen Supermix5.0 μl10 μM上游引物0.5 μl10 μM下游引物0.5 μlcDNA模板2.0 μl无菌水2.0 μl总共10.0 μl

以细胞组作为对照组，β-tubulin作为表达量的内参，利用CFX manager software软件分析所得的结果，得出相关基因的相对表达量。

免疫共沉淀：

将通过基因芯片获得的目的差异表达基因作为研究对象，通过NCBI分别获得各个基因的完整序列，利用真核表达载体pCMV-Myc分别构建带有Myc标签的各个基因质粒，即pCMV(M)ACLY、pCMV(M)SLC25A5、pCMV(M)IDH3A、pCMV(M)PHKG2、pCMV(M)UQCRQ、pCMV(M)PFKFB3。通过Western blotting的方法观察各个基因的表达情况，从而确认质粒构建是否成功。然后将成功构建的各个质粒分别与pCMV(f)UL43质粒共表达在HEK293T细胞中，寻找UL43蛋白的相互作用蛋白。具体操作如下：

（1）取转染24-48 h的细胞，加入适量细胞裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂），冰上裂解30min，细胞裂解液于4℃，12000 rpm离心30 min后取上清；

（2）取少量裂解液以备Western blotting分析，剩余裂解液分别加1 μgAnti-flag和Anti-Myc抗体加入到细胞裂解液，4℃缓慢摇晃孵育过夜；

（3）取10 μl protein A 琼脂糖珠，用适量裂解缓冲液洗3次，3000 rpm离心3 min；

（4）将protein A 琼脂糖珠加入到一抗孵育过夜的细胞裂解液中4℃缓慢摇晃孵育2-4h，使抗体与protein A琼脂糖珠偶连；

（5）免疫沉淀后，4℃ 3000 rpm离心3 min，弃掉上清，分别用缓冲液A和缓冲液B冲洗2次，加入15 μl的2×SDS上样缓冲液，沸水煮5分钟；

（6）通过Western blotting鉴定相互作用蛋白。

UL43蛋白对糖酵解途径的影响：

利用激光共聚焦显微镜观察发现UL43蛋白能够依赖YPLF基序内吞到胞内，并能够在宿主细胞内定位到线粒体上，并且经过基因芯片分析可知UL43蛋白主要影响宿主细胞的能量代谢系统，并且，这充分说明UL43蛋白可能会影响宿主细胞的ATP生成途径。然而，糖酵解途径和氧化磷酸化是细胞内ATP产生的主要途径，所以分别检测这两条途径的活性。

对于糖酵解途径的活性检测主要从细胞葡萄糖摄取量、细胞ATP含量、糖酵解限速酶活性等方面进行检测。如图7所示，转染UL43蛋白会随时间变化而改变细胞的葡萄糖摄取量，0-16 h葡萄糖的摄取量逐步增加，在16 h到达最高峰（p＜0.05），随后摄取量有所下降；但是转染突变后的UL43(Y144A)，会发现对细胞的葡萄糖摄取量的影响较小，与对照之间无明显差异（图7A）。同样转染UL43蛋白会增加细胞ATP含量，16 h达到最高峰；与之相比，转染突变后的UL43(Y144A)无明显变化（图7B）。另外本实施例还通过研究果糖-6-磷酸激酶（PFK-1）和丙酮酸激酶（PK）的活力来评估糖酵解途径的活性。结果显示，转染UL43蛋白能够明显的增加PFK-1 和PK的酶活力，16 h酶活力均为最强；同样，转染突变后的UL43(Y144A)两个酶活力与对照相比均无明显变化（图7C,E）。葡萄糖通过糖酵解途径会产生大量的丙酮酸，而丙酮酸可以在有氧的环境下转变为乙酰辅酶A（Co-A）随后进入线粒体进行三羧酸循环（TCA循环）；但是丙酮酸在无氧的环境下会转变为乳酸，所以本实施例还通过检测乳酸脱氢酶（LDH）的活力来监控丙酮酸的去向。实验发现，转染UL43蛋白之后会明显下调细胞的LDH酶活力，同样转染突变后的UL43(Y144A)无明显影响（图7D）。

这些实验结果表明，UL43蛋白只有发生内吞作用并靶定在宿主细胞的线粒体上才能够促进细胞的葡萄糖摄取量，增加糖酵解过程的限速酶活性，从而提升糖酵解途径，另外通过检测LDH酶活性可以确定糖酵解途径生成的丙酮酸能够进入线粒体转化为Co-A，并促进TCA循环。因此在线粒体内会产生更多的NADH+H⁺和FADH₂，促进后续的氧化磷酸化过程。

UL43蛋白对氧化磷酸化过程的影响：

为了进一步验证UL43蛋白是否可以促进宿主细胞的氧化磷酸化过程，本实施例检测了此过程的四个复合物的mRNA以及蛋白的表达水平，来初步评价UL43蛋白对氧化磷酸化过程的影响。

氧化磷酸化过程的电子传递链主要包括四种酶复合体（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ），而NADH脱氢酶1-β3（NDUFB3）、琥珀酸脱氢酶复合物β亚基（SDHB）、细胞色素C-1（CYC-1）、Surfeit locusprotein（SURF1）分别是复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的亚基。首先通过Real Time PCR技术分别检测了NDUFB3、SDHB、CYC-1、SURF1四个基因的mRNA表达水平。

如图8结果显示，在转染UL43蛋白后四个基因的表达量均有所上升，16 h时表达量达到最大值，随后有所降低（p><0.05）；但是转染突变的UL43(Y144A)之后，与对照相比四种基因的表达量无明显变化（图8A）。从蛋白水平利用Western blotting检测了酶复合物Ⅰ和Ⅳ表达水平，细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ（COXⅠ）是酶复合物Ⅳ的亚基，所以通过检测COXⅠ的表达水平来评估酶复合物Ⅳ的表达水平。研究结果显示，转染UL43蛋白后complexⅠ和COXⅠ的表达增加，在16 h达到高峰，这与检测复合物基因的mRNA表达水平结果一致（图8B）（p><0.05）。

综上结果表明，UL43蛋白能够提高宿主细胞的糖酵解途径和氧化磷酸化过程，使宿主细胞进入一种能量生成活跃的状态，产生更多的ATP，从而促进细胞的能量代谢途径。

免疫共沉淀结果：

为了初步探究UL43蛋白在宿主细胞内的互相作用蛋白，将基因芯片所得的候选目的差异表达基因分别与UL43蛋白做了免疫共沉淀。实验结果显示，只有基因SLC25A5的表达产物（即ANT2）能够与UL43蛋白发生共沉淀，其他的基因均未产生共沉淀（均为阴性结果未在图中显示）（图9）。ANT2是位于线粒体内膜的蛋白，作为一个传递泵能够将线粒体内的ATP泵到胞液中，将胞液的ADP泵到线粒体内，并参与ATP的合成过程。因此，可以初步推断ANT2是UL43在宿主细胞内的一个作用靶点，能够与其相互作用促进宿主细胞的线粒体产能途径。

通过利用相关的试剂盒分别检测了糖酵解途径中葡萄糖吸收量、细胞中ATP含量、PFK-1、PK、LDH的酶活力，并且利用RT-PCR以及Western blotting方法检测了氧化磷酸化过程中四种酶复合物的基因以及蛋白的表达水平，实验结果显示转染UL43蛋白后宿主细胞的产能途径明显增强。通过利用免疫共沉淀的方法初步判断UL43蛋白能够与线粒体内膜上的ANT2相互作用，进而影响宿主细胞的线粒体产能途径。

SEQ ID NO:1 UL43-for

CCGAATTCAAGCTTATGCTCCGCAACGACAGCC

SEQ ID NO:2 UL43-rev

CGCGGATCCTTTATTGAAAAATATATCAA

SEQ ID NO:3 UL43 Y144A-s

CTCGCCGATGACGTCgccCCGCTCTTTCTCCTCGCCCCG

SEQ ID NO:4 UL43 Y144A-as

GAGGAGAAAGAGCGGggcGACGTCATCGGCGAGCAC

SEQ ID NO:5 NDUFB-3正向

TCAGATTGCTGTCAGACATGG

SEQ ID NO:6 NDUFB-3反向

TGGTGTCCCTTCTATCTTCCA

SEQ ID NO:7 SDHB正向

AAATGTGGCCCCATGGTATTG

SEQ ID NO:8 SDHB反向

AGAGCCACAGATGCCTTCTCTG

SEQ ID NO:9 CYC-1正向

TGGCCCCTCCCATCTACAC

SEQ ID NO:10 CYC-1反向

ATCCTTGGCTATCTGGGACATG

SEQ ID NO:11 SURF-1正向

CAAACCTACGCCAAAATCCA

SEQ ID NO:12 SURF-1反向

GAAATGAATGAGCCTACAGA

SEQ ID NO:13 β-tubulin正向

CCCAACAATGTGAAGACGG

SEQ ID NO:14 β-tubulin反向

GCCTCGGTGAACTCCATCT

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