一种利用四倍体未受精子房培养创建二倍体水稻品系的方法

摘要

本发明提出了一种利用四倍体未受精子房培养创建二倍体水稻品系的方法，其步骤为a.选择四倍体常规水稻品系或光温敏雄性不育系作为材料；b.确定该花药是否处于小孢子单核发育早中期；c.未受精子房愈伤组织诱导的漂浮培养；d.子房愈伤组织分化出苗；e.芽苗分化出根；f.确定未受精子房培养植株的二倍体真实性。是一种“利用四倍体未受精子房培养创建二倍体水稻品系的方法”。本发明解决了目前多倍体水稻品系都来源于多次杂交、长期选择后形成，没有直接对应的二倍体品系以及四倍体水稻光温敏不育系在长日照高温期雄性不育而难以进行花药培养的实际问题。

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用四倍体未受精子房培养创建二倍体水稻品系的方法，属于现代农业的作物新品种选育技术领域。

背景技术

世界上目前种植的水稻全部是二倍体，从高等生物的多倍体进化趋势看，“利用远缘杂交和多倍体双重优势选育水稻新品种”是育种的一个新途径(蔡得田、袁隆平、卢兴桂，2001)，但是，这个理论意义和应用价值巨大的新途径尚有许多问题需要研发。由于在多倍体水稻品系选育中最后形成稳定的优良品系，一般都是要经历多次杂交、复合杂交与长期选择后形成的，都缺乏直接对应的二倍体品系。这十分不利于多倍体育种的理论研究和进行育种杂交、配组、选育。本发明专利就是既充分利用经过减数分裂后细胞内染色体减半的特点，又发挥未受精子房另一种单倍体来源的优势，可以克服光温敏雄性不育系缺少可育花药而不能通过花药培养获得单倍体的缺点。通过四倍体未受精子房培养，使已通过减数分裂形成的雌性配子在其合适的发育阶段，经过漂浮诱导培养后形成愈伤组织，并经分化出苗而形成稳定的二倍体水稻品系，这样所获得的二倍体水稻品系与其对应的四倍体水稻品系构建2x、4x配套材料体系，为在二倍体水平上与其它二倍体水稻品系杂交再加倍选择而广泛进入多倍体水稻品种选育的进程，推动多倍体水稻理论研究和育种实践都具有重要作用。

发明内容：

本发明的目的是提出利用四倍体未受精子房培养创建二倍体水稻品系的方法,开辟多倍体水稻单倍体培育的新途径，

本发明的技术方案为:a.选择稳定的四倍体常规水稻品系或光温敏雄性不育系作为材料，针对世界上没有现存的栽培稻多倍体，现有四倍体水稻品系是世界上第一批选育品系，它都是经历长期杂交和选择而育成的，且都具有多倍体减数分裂稳定性(PMeS)品系的血缘，但没有对应的二倍体品系；因此培养二倍体品系需要花药培养或未受精子房培养，特别是四倍体水稻光温敏雄性不育系在长日照高温期呈现雄性不育而难以进行花药培养。本发明首先采用稳定的四倍体常规品系和四倍体光温敏雄性不育系作为材料；

b.取材观察确定该花药是否处于小孢子单核发育早中期

在四倍体水稻的孕穗期，取剑叶叶枕与下一叶叶枕距-1.0cm～+2.5cm的幼穗，挑取颖花内的花药制片观察，确定该花药处于小孢子单核发育早中期，此特征是用对应切片观察确定为胚囊发育的成熟期。

c.未受精子房愈伤组织诱导的漂浮培养

经消毒处理后的合适幼穗，用尖镊子小心剥去颖壳而保留花药和子房于一体的小花，接种在液体愈伤组织诱导培养基上，让其漂浮在液面，减少振动防止下沉，置于黑暗条件25℃～28℃下培养，28天～40天后逐渐可见子房膨大成不均匀小球，靠近花柄端常有内生愈伤组织出现，此时同培养的花药上也可见愈伤组织生长；

所述诱导培养基配方为N₆+MCPA(2甲基4氯基苯氧乙酸)0.05mg/L～0.15mg/l+NAA0.1mg/L～0.5mg/L+KT>

d.子房愈伤组织分化出苗

无菌挑出上步骤培养的膨大子房，挑出其内淡乳黄色愈伤组织，置于愈伤组织分化培养基上，置于光照2000Lx～3000Lx条件下培养，愈伤组织逐渐有些地方显现绿色，并分化出芽苗；

所述分化培养基为MS+KT1.0mg/L～3.0mg/L+NAA 0.3mg/L～0.70mg/L+水解乳蛋白50mg/L～100mg/L+天冬酰胺10mg/L～20mg/L+谷酰胺10mg/L～20mg/L+蔗糖3％+琼脂0.75％；

e.芽苗分化出根

当芽长至0.5cm～2.0cm高度时，将这些子房愈伤组织分化出的芽苗，分块接种到生根培养基中，培养15天～30天分化出根而成为完整植株；

所述培养基为1/2～2/3MS培养基+NAA 0.3mg/L～0.70mg/L+KT 0.1mg/L～0.55mg/L+活性炭0.03％～0.05％+蔗糖1.5％～2.0％+琼脂0.75％,

f.确定未受精子房培养植株的二倍体真实性

形态学上观察幼苗叶片下表皮的气孔及其保卫细胞的叶绿体数，二倍体比四倍体少近一倍；用细胞学的染色体制片观察培养后获得植株根尖细胞的染色体，二倍体为2n＝2x＝24，四倍体为2n＝4x＝48，这样确定子房培养植株中的二倍体真实性。

本发明解决了目前多倍体水稻品系都来源于多次杂交、长期选择后形成，没有直接对应的二倍体品系以及四倍体水稻光温敏不育系在长日照高温期雄性不育而难以进行花药培养的实际问题。

具体实施方法

下面以实施例“多倍体水稻未受精子房培养创建二倍体水稻品系T1-2x和PS001-2x的过程,对本发明进一步说明。

a.选择稳定的四倍体常规水稻品系PRT1,或光温敏雄性不育系PS001、PS002、PS003为试材,PRT1是稳定的丰产性好，穗大、粒大的四倍体常规水稻品系；PS001、PS002、PS003是光温敏雄性不育系，在武汉正季播种，在长日照高温条件下表现出雄性不育的特点；PRT1、PS001、PS002、PS003都具有多倍体减数分裂稳定性(PMeS)特性。

b.取材观察花药发育时期。在四倍体水稻的孕穗期，取剑叶叶枕与下一页叶枕距-1.0cm～+2.5cm的幼穗，在穗中部挑取颖花内的花药经染色制片观察，确定该花药处于小孢子单核发育早中期，或光温敏雄性不育系的切片观察对应的胚囊发育的成熟期。

c.未受精子房愈伤组织诱导的漂浮培养。经消毒处理后的合适幼穗，用尖镊子小心剥去颖壳而保留花药和子房于一体的小花，接种在液体愈伤组织诱导培养基上，让其漂浮在液面，减少振动防止下沉。诱导培养基配方为N₆+MCPA(2甲基4氯基苯氧乙酸)0.05mg/L～0.15mg/l+NAA>

d.子房愈伤组织分化出苗。培养45天～48天后，无菌挑出膨大子房，用尖镊子拨开子房挑出其内淡乳黄色愈伤组织，将其置于愈伤组织分化培养基上，分化培养基为MS+KT1.0mg/L～3.0mg/L+NAA 0.3mg/L～0.70mg/L+水解乳蛋白50mg/L～100mg/L+天冬酰胺10mg/L～20mg/L+谷酰胺10mg/L～20mg/L+蔗糖3％+琼脂0.75％；置于光照2000Lx～3000Lx条件下培养，愈伤组织逐渐在有些地方显现绿色，并分化出芽苗。

e.芽苗分化出根。当芽苗长至0.5cm～2.0cm高度时，将子房愈伤组织分化出的芽苗，分块接种到生根培养基中，培养基为1/2～2/3MS培养基+NAA 0.3mg/L～0.70mg/L+KT 0.1mg/l～0.55mg/L+活性炭0.03％～0.05％+蔗糖1.5％～2.0％+琼脂0.75％,培养15天～30天分化出根而成为完整植株。

f.确定未受精子房培养植株的二倍体真实性。形态学上观察四倍体水稻植株茎秆粗壮，籽粒比二倍体大50％以上，一般颖尖有芒；细胞学的染色体制片观察培养后获得植株根尖细胞染色体，二倍体为2n＝2x＝24，四倍体为2n＝4x＝48，这样确定子房培养植株中的二倍体真实性，并将2x，4x植株成对收获种子保留。来自于PRT1四倍体常规品系的未受精子房培养形成的二倍体植株，命名为PRT1-2x，其对应四倍体为PRT1-4x；来自于四倍体光温敏雄性不育系PS001,PS002和PS003未受精子房培养的二倍体植株为PS001-2x、PS002-2x、PS003-2x其对应四倍体品系为PS001-4x、PS002-4x和PS003-4x。

本发明创建未受精子房培养获得二倍体品系的技术，开辟了由四倍体获得二倍体品系的新途径；构建的2x,4x成套水稻品系对于理论研究和实践杂交育种都具有重要意义，并在扩大育种杂交范围和提升育种速度上有重要的实际作用。