基于含重复AGGGTT序列的银纳米簇探针对阿尔兹海默症标志物荧光检测的方法

摘要

本发明公开了一种基于含重复AGGGTT序列的银纳米簇探针对阿尔兹海默症标志物荧光检测的方法，该方法是用DNA

说明书

技术领域

本发明涉及一种阿尔兹海默症标志物检测方法，特别涉及一种构建含重复AGGGTT序列的银纳米簇探针的方法，以及利用含重复AGGGTT序列的银纳米簇探针对阿尔兹海默症标志物进行荧光检测的方法，该方法利用阿尔兹海默症标志物与DNA₁/DNA₂-AgNCs-Cu²⁺探针中的铜离子结合并发生荧光信号变化的原理来检测阿尔兹海默症标志物的含量，属于生物纳米领域。

技术背景

阿尔兹海默症已经成为二十一世纪威胁人类健康的重大疾病之一，成功检测低含量的阿尔兹海默症标志物已成为亟待解决的问题。β淀粉样蛋白的单体、寡聚体和纤维体作为阿尔兹海默症主要标志物，广泛存在于脑脊液中，成功检测β淀粉样蛋白单体和寡聚体的含量对阿尔兹海默病的预防和治疗具有积极的作用，但已有的检测方法中，灵敏度和检测浓度范围有待提高。目前对这些标志物检测方法有共振光散射光谱(C.K.Wang,D.J.Liu,Z.X.Wang,Chem.Commun.2011,47, 9339.)、毛细管电泳(R.Picou,J.P.Moses,A.D.Wellman,I.Kheterpal,S.D.Gilman, Analyst 2010,135,1631.)、荧光光谱测定法(N.P.Cook,V.Torres,D.Jain,A.A.Martí, J.Am.Chem.Soc.2011,133,11121)、电化学生物传感法(a)M.Vestergaard,K.Kerman, M.Saito,N.Nagatani,Y.Takamura,E.Tamiya,J.Am.Chem.Soc.2005,127,11892；b) L.Liu,Q.G.He,F.Zhao,N.Xia,H.J.Liu,S.J.Li,R.L.Liu,H.Zhang,Biosens. Bioelectron.2014,51,208.)、SPR免疫分析(N.Xia,L.Liu,M.G.Harrington,J.X. Wang,F.M.Zhou,Anal.Chem.2010,82,10151.)和免疫分析(L.Carlred,A. Gunnarsson,S.Solé-Domènech,B.Johansson,V.Vukojevi,L.Terenius,A.Codita,B. Winblad,M.Schalling，F.P.J.Am.Chem.Soc.2014,136,9973.)，虽然这些检测方法具有高选择性和高灵敏性，但是成本高，还需要引入复杂的生物活性分子或是基于抗体的免疫分析。

发明内容

针对现有的检测阿尔兹海默症标志物的方法存在的缺陷，本发明的目的是在于提供一种信号强、灵敏度高、检测浓度范围广的通过荧光信号变化来实现阿尔兹海默症标志物检测的方法。

为了实现上述技术目的，本发明提供了一种基于含重复AGGGTT序列的银纳米簇探针对阿尔兹海默症标志物荧光检测的方法，该方法包括如下步骤：

1)以DNA₁为模板合成DNA₁-AgNCs银纳米簇；

2)所述DNA₁-AgNCs银纳米簇与DNA₂特异性结合，得到DNA₁/DNA₂-AgNCs>

3)所述DNA₁/DNA₂-AgNCs与铜离子结合，得到DNA₁/DNA₂-AgNCs-Cu²⁺探针；

4)所述DNA₁/DNA₂-AgNCs-Cu²⁺荧光探针与一系列不同浓度的标准Aβ_1-40>1-40>

或者，

所述DNA₁/DNA₂-AgNCs-Cu²⁺荧光探针与一系列不同浓度的标准Aβ_1-40>1-40oligomer>

5)所述DNA₁/DNA₂-AgNCs-Cu²⁺荧光探针与待测Aβ_1-40monomer溶液反应后，进行荧光检测，得到荧光信号值，根据Aβ_1-40monomer溶液浓度与荧光信号值的标准曲线，计算待测Aβ_1-40monomer溶液的浓度；

或者，

所述DNA₁/DNA₂-AgNCs-Cu²⁺荧光探针与待测Aβ_1-40oligomer溶液反应后，进行荧光检测，得到荧光信号值，根据Aβ_1-40oligomer溶液浓度与荧光信号值的标准曲线，计算待测Aβ_1-40oligomer溶液的浓度；

所述DNA₁包含与DNA₂互补的片段和合成银纳米簇模板的片段；

所述DNA₂包含与DNA₁互补的片段和重复AGGGTT片段。

优选的方案，所述DNA₂中重复AGGGTT片段的数量为3～5。通过origin软件拟合出不同重复序列探针的稳定常数以及通过大量实验验证，重复AGGGTT片段的数量为3～5时，稳定性最好。因此，本发明技术方案优选DNA₂中重复AGGGTT>

较优选的方案，所述DNA₁的序列号为：5’---CCT>

较优选的方案，所述DNA₂的序列号为：5’---AAT>

优选的方案，将DNA₁磷酸缓冲液与AgNO₃溶液混合后，加入新配制的NaBH₄溶液混匀，在20～30℃恒温下反应，即得DNA₁-AgNCs。更优选的方案，先将DNA₁与硝酸银溶液、磷酸缓冲液(20mM，pH>1-AgNCs体系2h即可达到稳定。

较优选的方案，DNA₁、AgNO₃和NaBH₄的摩尔比为1:5～7:5～7。更优选为>

优选的方案，所述DNA₁-AgNCs银纳米簇与DNA₂在溶液体系中混合，于>1/DNA₂-AgNCs荧光探针。

优选的方案，所述铜离子与DNA₁/DNA₂-AgNCs在溶液体系中混合反应，即得DNA₁/DNA₂-AgNCs-Cu²⁺复合探针。

较优选的方案，所述铜离子与DNA₁/DNA₂-AgNCs的摩尔比为4～6:3；反应温度为20～30℃，反应时间为0.3～0.8h。

优选的方案，所述DNA₁-AgNCs银纳米簇与DNA₂以1.5:1的摩尔比混合，在>1/DNA₂-AgNCs-Cu²⁺荧光探针。本发明的技术方案中采用的DNA₂与DNA₁进行混匀一定时间之后，两链的碱基会一一进行互补配对。经过实验证明，两链进行互补配对所需的时间为1h，随后加入硝酸铜反应需要0.5h，体系达到完全的稳定，即得到检测阿尔兹海默症标志物的荧光探针。

较优选的方案，所述DNA₁/DNA₂-AgNCs-Cu²⁺荧光探针与标准Aβ_1-40monomer>

较优选的方案，所述DNA₁/DNA₂-AgNCs-Cu²⁺荧光探针与标准Aβ_1-40oligomer>

本发明的技术方案关键在于采用两条具有特殊序列的DNA(DNA₁与DNA₂)>1包含与DNA₂互补的片段和合成银纳米簇模板的片段，所述DNA₂包含与DNA₁互补的片段和重复AGGGTT片段。当DNA₁与DNA₂互补时，DNA₂中富含G碱基的片段靠近银纳米簇，DNA₁/DNA₂-AgNCs荧光探针的荧光得到增强，随后加入铜离子后，荧光发生猝灭，主要是铜离子与DNA₂中的重复AGGGTT片段中G碱基结合，使得DNA₂富含G碱基的片段脱离银纳米簇合成位点，从而导致荧光发生猝灭，当加入Aβ_1-40monomer或Aβ_1-40oligomer后，>1-₄₀monomer或Aβ_1-40oligomer可与DNA₂中的G碱基竞争并剥夺铜离子，从而释放出G碱基，使得被释放G碱基重新靠近银纳米簇，通过荧光信号增强来检测阿尔兹海默症标志物的含量，利用该原理，实现了Aβ_1-40monomer或Aβ_1-40>1-40monomer>1-40oligomer的线性范围分别在5～100nM和2～100nM之间，荧光强度随着浓度的增加呈线性增强，检测范围相对传统的方法较宽。

本发明的DNA₁与DNA₂可购买于生工生物工程(上海)股份有限公司。两者的序列设计如下：DNA₁：5’---CCT>2：>1的3’端与DNA₂的5’端各有18个碱基互补，并且DNA1序列中5’---CCT>2序列中的G碱基结合，使得G碱基远离银纳米簇，荧光信号减弱，而Aβ蛋白的单体或寡聚体可以与铜离子结合，通过竞争剥夺与DNA2中与G碱基结合的铜离子，释放出G碱基使得荧光信号增强，可作为检测阿尔兹海默症标志物的探针。

本发明的DNA₂与DNA₁包含可以互补的基因片段，同时DNA₂序列中重复>2中重复AGGGTT片段的数量不同所得到的荧光信号的差异，并用origin软件计算拟合出不同反应的稳定常数，以最优稳定常数的反应做后期实验探针，可实现对稳定常数调控来优化探针，当加Aβ蛋白的单体或者寡聚体后，Aβ蛋白的单体或者寡聚体与铜离子结合，释放出G碱基，荧光信号发生变化，通过信号来检测阿尔兹海默症标志物的含量，故DNA₁/DNA₂-AgNCs-Cu²⁺可作为阿尔兹海默症标志物的含量检测的探针。

相对现有技术，本发明的技术方案带来的有益技术效果：

本发明的技术方案通过构建特殊的DNA₁/DNA₂-AgNCs-Cu²⁺荧光探针，实现了对阿尔兹海默症标志物Aβ_1-40monomer、Aβ_1-40oligomer的荧光检测，具有信号强、灵敏度高、检测浓度范围广等优点，有利于推广应用。

本发明的技术方案通过两条包含互补片段的特殊DNA链构建银纳米簇荧光探针，再利用两条DNA互补时，DNA₂中富含G碱基的片段靠近银纳米簇，>1/DNA₂-AgNCs荧光探针的荧光得到增强，随后加入铜离子，铜离子与DNA₂中富含G碱基的片段结合，荧光信号减弱，当加入Aβ_1-40monomer或者Aβ_1-40>1-40monomer或者Aβ_1-40oligomer将与铜离子结合，释放出G碱基，从而使得DNA₂包含的G碱基的片段重新靠近银纳米簇合成位点，>1/DNA₂-AgNCs-Cu²⁺荧光探针的荧光信号得以恢复的原理，实现了Aβ_1-40>1-₄₀oligomer荧光检测，具有检测下限低，检测范围广的特点，>1-40monomer和Aβ_1-40oligomer的检出下限可分别达到5nM和0.05nM，并且>1-40monomer和Aβ_1-40oligomer的线性范围分别在5～100nM和2～100nM之间，反应体系荧光强度随着浓度的增加呈线性减弱，检测范围相对传统的方法较宽。

本发明的技术方案银纳米簇荧光探针通过DNA核酸序列来稳定银纳米粒子，其稳定性好，具有稳定信号，且纳米簇的尺寸小，耐环境影响力强，可有效改善现有技术灵敏度低和检测限的问题。

本发明的技术方案利用银纳米簇荧光探针对阿尔兹海默症标志物Aβ_1-40>1-40oligomer的检测，具有快速、高效，准确的特点，仅需15min>

本发明的技术方案通过荧光信号变化的方法检测阿尔兹海默症标志物，性质更稳定，操作更为简便，有利于推广应用。

附图说明

【图1】为通过荧光信号变化的方法检测阿尔兹海默病标志物的实验方法的示意图；

【图2】为DNA合成银纳米簇的激发和发射图谱；

【图3】为Aβ_1-40monomer与DNA₁/DNA₂-AgNCs-Cu²⁺荧光探针反应时间图；

【图4】为用origin软件拟合含不同重复序列的DNA₁/DNA₂-AgNCs-Cu²⁺荧光探针的稳定常数图；

【图5】为以4个重复序列的DNA₁/DNA₂-AgNCs-Cu²⁺荧光探针对在一定浓度范围内检测阿尔兹海默病标志物Aβ_1-40monomer含量的荧光图。

【图6】为以4个重复序列的DNA₁/DNA₂-AgNCs-Cu²⁺荧光探针对在一定浓度范围内检测阿尔兹海默病标志物Aβ_1-40oligomer含量的荧光图；

【图7】为以4个重复序列的DNA₁/DNA₂-AgNCs-Cu²⁺荧光探针在一定浓度范围内检测阿尔兹海默症标志物Aβ_1-40monomer含量的荧光图；

【图8】为以4个重复序列的DNA₁/DNA₂-AgNCs-Cu²⁺荧光探针在一定浓度范围内检测阿尔兹海默症标志物Aβ_1-40oligomer含量的荧光图。

其中：

图2中a为激发波长，b为发射波长，可以看出银纳米簇的激发波长在472nm 处，发射波长在540nm处；

图3可以看出Aβ_1-40monomer与DNA₁/DNA₂-AgNCs-Cu²⁺荧光探针反应15min时可达到稳定；

图4可以看出a,b和c分别为重复序列是3,4和5的DNA₁/DNA₂-AgNCs-Cu²⁺荧光探针通过计算拟合出来的稳定常数；

图5可以看出4个重复序列的DNA₁/DNA₂-AgNCs-Cu²⁺荧光探针在一定的浓度范围内Aβ_1-40monomer与其所对应的响应信号有一定的线性关系；

图6可以看出4个重复序列的DNA₁/DNA₂-AgNCs-Cu²⁺荧光探针在一定的浓度范围内Aβ_1-40oligomer与其所对应的响应信号有一定的线性关系。

从图7可以看出荧光信号随着Aβ_1-40monomer浓度增大而增强。

从图8可以看出荧光信号随着Aβ_1-40oligomer浓度增大而增强。

具体实施方式

以下实施例旨在进一步说明本发明内容，而不是限制本发明权利要求保护的范围。

实施例1

DNA₁-AgNCs制备方法，步骤如下：

取15μL的DNA₁(100μM)与73uL磷酸缓冲液(20mM，pH>3水溶液(1.5mM)室温下震荡混匀15min，然后加入6μL新鲜配制的NaBH₄(1.5mM)迅速混匀并移入25℃恒温水浴锅中反应2h，即可检测其荧光。

DNA₁/DNA₂-AgNCs反应步骤如下：

取5μL>2(100μM)与50μLDNA₁-AgNCs溶液混匀并在25℃恒温水浴锅中反应1h，即可检测其荧光信号。

DNA₁/DNA₂-AgNCs-Cu²⁺探针制备步骤如下：

取6uL硝酸铜(0.156mM)加入已反应好的DNA₁/DNA₂-AgNCs溶液(55μL)>

Aβ_1-40monomer坐标曲线的建立步骤如下：

用磷酸缓冲液(10mM，pH 7.4)配置不同浓度的Aβ_1-40monomer溶液，每个溶液取相同体积加入到DNA₁/DNA₂-AgNCs-Cu²⁺荧光探针溶液中，15min后检测其荧光信号，重复5组实验，用origin软件做出线性拟合曲线图。

Aβ_1-40oligomer坐标曲线的建立步骤如下：

用磷酸缓冲液(10mM，pH 7.4)配置不同浓度的Aβ_1-40oligomer溶液，每个溶液取相同体积加入到DNA₁/DNA₂-AgNCs-Cu²⁺荧光探针溶液中，15min后检测其荧光信号，重复5组实验，用origin软件做出线性拟合曲线图。

Aβ_1-40monomer待测溶液检测步骤如下：

用脑脊液配置不同浓度的Aβ_1-40monomer溶液，每个溶液取相同体积加入到DNA₁/DNA₂-AgNCs-Cu²⁺荧光探针溶液中，15min后检测其荧光信号。

Aβ_1-40oligomer待测溶液检测步骤如下：

用脑脊液配置不同浓度的Aβ_1-40oligomer溶液，每个溶液取相同体积加入到>1/DNA₂-AgNCs-Cu²⁺荧光探针溶液中，15min后检测其荧光信号。

稳定常数拟合测步骤如下：

分别向已经反应好了的已反应好的DNA₁/DNA₂-AgNCs溶液中加入不同体积的铜离子(0.078mM)，可得到不同浓度的铜离子对应的荧光值，利用origin软件对其进行拟合可得到相应反应的稳定常数。