一种基于7‑硝基苯呋咱的谷胱甘肽和半胱氨酸荧光探针及其制备方法

摘要

本发明公开了一种基于7‑硝基苯呋咱的谷胱甘肽和半胱氨酸荧光探针及其制备方法，将中间体4‑氨基‑7‑硝基苯并呋咱与三乙胺混合于二氯甲烷溶液中，冰浴条件下滴加含丙烯酰氯的二氯甲烷溶液，之后进行反应，反应产物经过后续处理得到谷胱甘肽和半胱氨酸荧光探针。该荧光探针用于环境或生物样品中的谷胱甘肽和半胱氨酸的荧光传感分析。通过荧光分光光度计研究了探针MP1在DMSO/ PBS(10 mM,pH=7.4,1/9,v/v)溶液体系中与各类氨基酸的识别特性。结果表明：探针MP1对谷胱甘肽和半胱氨酸的选择性好，抗干扰能力强，可以灵敏快速的从多种氨基酸中区分出谷胱甘肽和半胱氨酸，具有很好的应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于谷胱甘肽和半胱氨酸荧光识别的新型检测剂，具体涉及一种基于7-硝基苯呋咱的谷胱甘肽和半胱氨酸荧光探针分子的制备方法与应用。

背景技术

在生物体中，生物硫醇如谷胱甘肽(GSH)，半胱氨酸(Cys)等在生理过程如细胞代谢过程和维持氧化还原反应平衡等过程中发挥着重要的作用。细胞内该类硫醇含量的变化会引起一系列的疾病，如艾滋病、水肿、冠心病、帕金森症、癌症和牛皮癣等。作为细胞内含量最高的非蛋白质硫醇，谷胱甘肽(GSH)在保持氧化还原动态平衡过程中发挥着非常重要的作用，其含量的过高或者过低则与癌症等许多疾病有着直接的关系。生物体内半胱氨酸(Cys)的缺乏会引起一系列病症，如皮肤损伤，肝脏水肿等病症。因此，快速实时监测该类硫醇在生物体内的含量在临床医学和生物化学中有着重要的意义。

荧光探针具有选择性好、灵敏度高、操作简便快速、对检测物损伤少等优点已被广泛应用于检测环境和生物体系中的金属阳离子、阴离子、生物体内活性小分子等方面。荧光探针分子的开发与利用研究是化学与生物、医学、农业等科学的交叉领域。荧光探针技术是在分子水平上对研究对象进行研究的分析方法。荧光探针目前已经被广泛应用于环境和生物体中重金属、生物活性小分子等物质的检测。

荧光探针法因其具有操作简单，专一高效的选择性已被广泛应用于检测环境和生物体系中的金属阳离子、阴离子、生物体内活性小分子等方面。相比于生物体内常见的其他氨基酸，生物硫醇如半胱氨酸(Cys)，谷胱甘肽(GSH)分子结构中都含有巯基，因此对生物硫醇的检测可以通过对巯基的识别来实现。巯基具备较强的亲核性，目前已报道的很多硫醇荧光探针主要是利用其较强的亲核性来实现对生物硫醇的高效识别。

发明内容

本发明提出了一种基于7-硝基苯呋咱的谷胱甘肽和半胱氨酸荧光探针及其制备方法，合成的荧光探针能够灵敏快速的从多种氨基酸中区分出谷胱甘肽和半胱氨酸。

实现本发明的技术方案是：一种基于7-硝基苯呋咱的谷胱甘肽和半胱氨酸荧光探针（记作MP1），所述荧光探针分子的结构式如下：

。

所述的基于7-硝基苯呋咱的谷胱甘肽和半胱氨酸荧光探针的制备方法，步骤如下：

避光条件下，将中间体4-氨基-7-硝基苯并呋咱（NBD-NH₂）与三乙胺混合于二氯甲烷溶液中，冰浴条件下滴加含丙烯酰氯的二氯甲烷溶液，反应后，反应液用饱和氯化钠溶液洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，减压除去溶剂，用乙酸乙酯和正己烷为洗脱剂，经硅胶柱层析分离得到浅黄色固体，得到谷胱甘肽和半胱氨酸荧光探针。

所述步骤（1）中，避光条件为采用锡箔纸包裹反应容器。

所述步骤中三乙胺为缚酸剂，中间体4-氨基-7-硝基苯并呋咱与三乙胺的摩尔比为1：（2-10），所用二氯甲烷需经无水处理，所述冰浴反应温度为0℃，反应时间为3-12小时。

所述中间体4-氨基-7-硝基苯并呋咱与丙烯酰氯的摩尔比为1：（2-5）。

所述硅胶柱分离的洗脱液为乙酸乙酯和正己烷，所述乙酸乙酯与正己烷的体积比为1：（5-20）。

所述中间体4-氨基-7-硝基苯并呋咱的制备方法为：避光条件下，将氨水溶液逐滴滴加到含有4-氯-7-硝基苯呋咱的甲醇溶液中，所述4-氯-7-硝基苯呋咱的甲醇溶液的浓度为40-70%，室温下搅拌反应20-30小时，减压蒸馏得到固体，所述固体用乙酸乙酯溶解，以乙酸乙酯和石油醚作为洗脱剂，硅胶柱层析分离得到黄褐色固体，所述黄褐色固体为中间体4-氨基-7-硝基苯并呋咱。

所述4-氯-7-硝基苯呋咱与氨水溶液的物质的量之比为1:（15-30）。

基于7-硝基苯呋咱的谷胱甘肽和半胱氨酸荧光探针在检测谷胱甘肽和半胱氨酸中的应用。

所述二氯甲烷无水处理的方法为：向二氯甲烷中加入氢化钙回流2-4小时后蒸馏，即得无水的二氯甲烷。

本发明中制备荧光探针MP1的过程中所使用的化学试剂、溶剂、金属盐等均购自国药集团化学试剂有限公司。在荧光探针MP1的确证和性能测试过程采用Bruke公司DTX-400型核磁共振谱仪，溶剂为氘代氯仿，以TMS为内标记录核磁共振氢谱和碳谱。采用Thermo公司的Q-Exactive HR-MS质谱仪记录高分辨质谱数据。采用日本日立公司F-7000荧光光谱仪记录荧光光谱。

本发明的具体合成路线如下：

本发明的有益效果是：通过简单的一步反应得到荧光探针，合成路线短，方法简便，产率高。荧光探针在DMSO/PBS(10 mM, pH = 7.4, 1/9, v/v)溶液体系中对谷胱甘肽和半胱氨酸的选择性好，抗干扰能力强，可以灵敏快速的从多种氨基酸中区分出谷胱甘肽和半胱氨酸。荧光探针结构中的荧光团4-氨基-7-硝基苯并呋咱具有较长的发射波长和良好的细胞通透性，有利于该类探针在生物体内识别谷胱甘肽和半胱氨酸，因此具有较好的应用前景。

附图说明

图1为本发明的荧光探针MP1荧光选择性图，激发波长380 nm。

图2为本发明的荧光探针MP1识别GSH的竞争性实验图，激发波长380 nm，发射波长500 nm。

图3为本发明的荧光探针MP1识别Cys的竞争性实验图，激发波长380 nm，发射波长500 nm。

图4为本发明的荧光探针MP1荧光动力学实验图，激发波长380 nm，发射波长500nm。

图5为本发明的荧光探针MP1识别GSH的荧光滴定图，插图为最低检测限图，激发波长380 nm，发射波长500 nm。

图6为本发明的荧光探针MP1识别Cys的荧光滴定图，插图为最低检测限图，激发波长380 nm，发射波长500 nm。

图7为本发明的荧光探针MP1识别GSH和Cys的酸碱度实验图，激发波长380 nm，发射波长500 nm。

具体实施方式

实施例1

荧光探针的合成：

（1）避光条件下，将氨水溶液逐滴滴加到含有4-氯-7-硝基苯呋咱的甲醇溶液中，所述4-氯-7-硝基苯呋咱与氨水溶液的物质的量之比为1:15，所述4-氯-7-硝基苯呋咱的甲醇溶液的浓度为40%，室温下搅拌反应20小时，减压蒸馏得到固体，所述固体用乙酸乙酯溶解，以乙酸乙酯和石油醚作为洗脱剂，硅胶柱层析分离得到黄褐色固体，所述黄褐色固体为中间体4-氨基-7-硝基苯并呋咱；

（2）避光条件下，将中间体NBD-NH₂>

核磁共振氢谱测定：¹H>J =1.6>J =>J =>J =>J =>

核磁共振碳谱测定：¹³C>

高分辨质谱测定：HR-MS m/z: 理论值：C₉H₇N₄O₄>

实施例2

本实施例中荧光探针的制备方法如下：

（1）避光条件下，将氨水溶液逐滴滴加到含有4-氯-7-硝基苯呋咱的甲醇溶液中，所述4-氯-7-硝基苯呋咱与氨水溶液的物质的量之比为1:20，所述4-氯-7-硝基苯呋咱的甲醇溶液的浓度为60%，室温下搅拌反应25小时，减压蒸馏得到固体，所述固体用乙酸乙酯溶解，以乙酸乙酯和石油醚作为洗脱剂，硅胶柱层析分离得到黄褐色固体，所述黄褐色固体为中间体4-氨基-7-硝基苯并呋咱；

（2）避光条件下，将中间体NBD-NH₂>

核磁共振氢谱测定：¹H>J =1.6>J =>J =>J =>J =>

核磁共振碳谱测定：¹³C>

高分辨质谱测定：HR-MS m/z: 理论值：C9H7N4O4>

实施例3

本实施例中荧光探针的制备方法如下：

（1）避光条件下，将氨水溶液逐滴滴加到含有4-氯-7-硝基苯呋咱的甲醇溶液中，所述4-氯-7-硝基苯呋咱与氨水溶液的物质的量之比为1:30，所述4-氯-7-硝基苯呋咱的甲醇溶液的浓度为70%，室温下搅拌反应30小时，减压蒸馏得到固体，所述固体用乙酸乙酯溶解，以乙酸乙酯和石油醚作为洗脱剂，硅胶柱层析分离得到黄褐色固体，所述黄褐色固体为中间体4-氨基-7-硝基苯并呋咱；

（2）避光条件下，将中间体NBD-NH₂>

实施例1制备的探针MP1的应用例

（1）溶液的配制：

氯化钙、氯化钾、氯化钠、亚硝酸钠，双氧水及各类氨基酸均购自国药集团化学试剂有限公司。准确称量相应金属盐、氨基酸，溶解在高纯水中配制10 mM的溶液备用。购买的双氧水用去离子水稀释，根据比尔定律，过氧化氢的浓度由紫外光谱240 nm处的吸光度标定，根据公式c = A/Kb（b = 1 cm, K =43.6 M^-1>-1）计算。

1 mM的探针溶液配制：准确称量相应探针，将荧光探针溶解在DMSO溶液中配制1mM的溶液备用。

测试体系配制方法：在测试小瓶中，加入2.5 mL的10 mM PBS buffer (pH 7.4)，加入相应体积的测试样品溶液，混合均匀后，加入30 μL的1 mM探针溶液，最后滴加相应体积的DMSO和10 mM PBS buffer (pH 7.4)溶液使总体系为3 mL的10 mM PBS buffer (pH7.4)含有10 % DMSO的体系。

（2）选择性实验：

良好的选择性与较强的抗干扰性是检验一个荧光探针分子是否优良的重要标准。首先考察了探针对常见的活性硫、氨基酸、金属离子的选择性。加入以上所有测试物质没有对测试体系的荧光发射强度产生明显的变化。作为对比，相同条件下加入相应的谷胱甘肽（GSH）和半胱氨酸（Cys）时，体系荧光发射强度有明显的降低（图 1）。该实验结果表明探针对谷胱甘肽（GSH）和半胱氨酸（Cys）具备较好的选择性。为了测试探针对谷胱甘肽（GSH）和半胱氨酸（Cys）识别的抗干扰能力，在荧光发射光谱中分别测试了该探针的抗干扰性。如图2和图3所示，在 (10 µM)在DMSO/PBS(10 mM, pH = 7.4, 1/9, v/v)溶液中分别加入测试的各种常见氨基酸(100 µM)测试其荧光发射强度（500 nm），然后再向含有各种氨基酸的溶液中分别加入100 µM的谷胱甘肽（GSH）和半胱氨酸（Cys）溶液，由图2和图3可知，在常见氨基酸存在时加入谷胱甘肽（GSH）和半胱氨酸（Cys）与单独加入谷胱甘肽（GSH）和半胱氨酸（Cys）时所得到的荧光发射强度(500 nm)基本相同，该结果表明探针对谷胱甘肽（GSH）和半胱氨酸（Cys）的检测具有较强的抗干扰能力。

（3）识别动力学实验：

快速响应、实时监测是荧光探针检测的重要特点之一。通过荧光光谱仪考察了反应时间探针检测谷胱甘肽（GSH）和半胱氨酸（Cys）的影响。如图4所示，在DMSO/PBS(10 mM, pH =7.4, 1/9, v/v)溶液体系中，探针对谷胱甘肽（GSH）和半胱氨酸（Cys）识别时间为45分钟，并在45分钟后达到平衡。结果表明探针对谷胱甘肽（GSH）和半胱氨酸（Cys）识别时间为45分钟，其反应产物具备较强的稳定性。

（4）荧光滴定和检测限测试：

为了进一步研究探针对谷胱甘肽（GSH）和半胱氨酸（Cys）识别的灵敏度，通过荧光滴定实验测试了其最低检测限。如图5所示，在DMSO/ PBS(10 mM, pH = 7.4, 1/9, v/v)溶液体系中，控制探针浓度为 10 µM，不断增加 GSH 的浓度(0, 1, 2, 3, 5, 7, 10, 15, 20,30, 40, 50, 60, 70, 80, 100 µM)测试其荧光发射光谱，随着 GSH 浓度的增大，体系荧光发射强度不断降低，同时，体系荧光发射强度的降低在 GSH 浓度为 1-30 µM 间呈线性（R²=>

（5）pH 值对探针识别谷胱甘肽（GSH）和半胱氨酸（Cys）的影响：

为了测试探针可以在不同的生理条件下识别谷胱甘肽（GSH）和半胱氨酸（Cys），考察了其在不同 pH 值对其识别谷胱甘肽（GSH）和半胱氨酸（Cys）的影响。如图7所示：在DMSO/PBS(10 mM, pH = 7.4, 1/9, v/v)溶液体系中，改变缓冲体系的pH值（4-9），单独探针(10 μL)的荧光发射光谱变化不大，但是在谷胱甘肽（GSH）和半胱氨酸（Cys）（浓度分别为100 μL）存在的条件下，体系荧光发射强度在pH为7-9间具有较明显的淬灭，该结果表明探针可以应用于生理条件下识别谷胱甘肽（GSH）和半胱氨酸（Cys）。