吲哚‑TEMPO缀合物及其在保护远隔器官对抗缺血再灌注损伤中的用途

摘要

本发明公开了具有通式I结构的吲哚‑TEMPO缀合物及其在保护远隔器官对抗缺血再灌注损伤中的用途。研究表明本发明合成的一系列新颖的吲哚‑TEMPO缀合物在二甲苯诱导的耳水肿小鼠模型中表现出抗炎性质，进而证明了这些化合物可以保护细胞免受模拟的I/R诱导的活性氧类物质过量产生和线粒体功能障碍。此外，本发明已经证明吲哚‑TEMPO缀合物可以减轻由于肠I/R损伤在啮齿动物中诱导的多器官损伤，而且这些吲哚‑TEMPO缀合物的药理学特征和作用机制涉及会聚作用，包括通过脂质过氧化降低自由基产生的能力，并伴随以炎症过程中的ROS介导活化作用的减弱。本发明为抗肠缺血/再灌注损伤提供了一种新的技术手段。

说明书

技术领域

本发明涉及一种吲哚-TEMPO缀合物及其用途，特别涉及吲哚-TEMPO缀合物 在保护远隔器官对抗缺血再灌注损伤中的用途，本发明属于医药技术领域。

背景技术

肠缺血/再灌注(I/R)损伤代表在各种环境发生的临床综合征，包括腹主动脉瘤，小肠移植，绞窄性疝和新生儿坏死性小肠结肠炎。肠系膜上动脉(SMA)的再灌注诱 导多形核中性粒细胞(PMN)的激活，伴随着促炎物质的释放和更多自由基的产生。 包括羟基自由基在内的这些基团，通过促进脂质和DNA氧化/过氧化，增加自由基 的形成和相关的线粒体的去极化，以及最终的细胞凋亡，在肠I/R损伤的病理生理 学中发挥作用。此外，这些I/R损伤后激活的促炎因子在静脉和淋巴系统中循环， 诱导远程器官损伤，促成全身炎症反应和急性呼吸窘迫综合征，对此已在多个记录 了减轻ROS影响的干预措施有益效果的研究中加以强调。

4-羟基-TEMPO(TEMPOL)是一种稳定的哌啶氮氧化物，作为电子自旋共振光谱 中的水溶性中间体被广泛使用。TEMPOL能渗透生物膜，在胞液中积累，可在体外 清除超氧化物阴离子，因此可充当“SOD(超氧化物歧化酶)模拟物”。此外，TEMPOL 可能通过清除超氧化物阴离子，或通过细胞内Fe²⁺浓度的降低来减少羟基自由基的>

已有关于吲哚衍生物具有抗氧化和抗炎性质的报道。在这方面，有哈尔碱(harmane)，二氢骆驼蓬碱(harmaline)和骆驼蓬酚(harmalol)通过限制透明质酸， 软骨胶原和免疫球蛋白G的氧化损伤抑制肝脏中的脂质过氧化。其他数据表明，β- 咔啉生物碱通过清除ROS发挥保护性抗氧化作用；我们的实验室最近研发了一系列 表现出增强的抗氧化和抗炎活性的吲哚β-咔啉衍生物。由于ROS和炎性白细胞在 I/R损伤的发病机制中起重要作用，抗氧化剂治疗和抑制缺血后嗜中性粒细胞浸润 具有几乎肯定的治疗相关性。在许多情况下考虑治疗方案时，组合治疗通常通过病 状改善的增加来提高治疗功效。由于不同的药代动力学模式，两种潜在协同作用药 物的全身给药将以不同的效率通向治疗靶。然而，当共施用药剂作为单一化学实体 引入时，可以实现治疗上的优势。据此我们假设并据以继续研究：TEMPO这一部 分的自由基清除特性，加上与我们以前开发的吲哚衍生物观察到的抗炎活性，将产 生具有协同增强的抗氧化，抗炎和抗缺血活性的新的缀合物。为了评估这个假设， 我们制备了一系列新的吲哚-TEMPO缀合物，并表征了它们在体外和体内实验性缺血/再灌注模型中减弱I/R损伤的生物学能力。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一系列新的吲哚-TEMPO缀合物，并提供这 些缀合物在保护远隔器官对抗缺血再灌注损伤中的用途。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

本发明发明人合成了一系列新颖的吲哚-TEMPO缀合物，它们在二甲苯诱导耳 水肿小鼠模型中表现出抗炎性质，进而证明了这些化合物可以保护细胞免受模拟的 I/R诱导的ROS(活性氧类物质)过量产生和线粒体功能障碍。此外，本发明已经证明 吲哚-TEMPO缀合物可以减轻由于肠I/R损伤在啮齿动物中诱导的多器官损伤，而 且这些吲哚-TEMPO缀合物的药理学特征和作用机制涉及会聚作用，包括通过脂质 过氧化降低自由基产生的能力，并伴随以炎症过程中的ROS介导活化作用的减弱。

具体的，本发明的一种吲哚-TEMPO缀合物，其具有通式I所示的结构：

其中，X为碳，氧，氮，硫，硅，磷或硼原子；X通过饱和或不饱和键结合； X可以与任何取代基形成键；n选自4-6的整数；

其中，R选自氢、取代或未取代的，直链，环状或支链的C_1-5烷基或羰基、酰>

在本发明中，优选的，通式I中，基团选自

其中R₁-R₄选自氢、取代或未取代的，直链，环状或支链的C_1-5烷基。

在本发明中，优选的，所述的取代或未取代的，直链，环状或支链的C_1-5烷基>1-5烷基或羰基，所述的取代的酰胺基包括1-氧基-2,2,6,6-四甲基哌啶-4->

在本发明中，优选的，R选自氢、甲基、异丙基、正丁基-2-基、异丁基、2-氨 基-2-氧代乙基、咪唑-4-基-甲基、苯甲基、4-氨基丁基、对羟基苯甲基、2-甲硫基乙 基、羟甲基、吲哚-3-基-甲基、R1与N原子共同形成吡咯-2,N-基、1-羟基乙基、 3-氨基3-氧代丙基

在本发明的具体实施例中，所述的吲哚-TEMPO缀合物选自具有以下结构的化 合物：

进一步的，本发明还提出了合成所述的吲哚-TEMPO缀合物的方法，包括以下 步骤：

从光学活性L-色氨酸开始，通过Pictect-Spengler反应制备母体β-咔啉1，然后进行保护性偶联，得中间体4和5；在β-咔啉环的3-位，引入不同的氨基酸以产生 一系列吲哚衍生物7a-s；然后，引入末端炔基官能团作为合成“手柄”以便引入 TEMPO部分，通过铜(I)催化叠氮化物/炔环加成反应(CuAAC)(Le Droumaguet,C.； Wang,C.；Wang,Q.luorogenic clickreaction.Chem Soc Rev.39:1233-9；201037. Kawamoto,S.A.；Coleska,A.；Ran,X.；Yi,H.；Yang,C.Y.；et al.Design of triazole-stapled BCL9α-helical peptides to target theβ-catenin/B-cell CLL/lymphoma 9 (BCL9)protein-protein interaction.J.Med.Chem.55:1137-1146；2012.Yapici,N.B.； Mandalapu,S.R.；Chew,T.L.；Khuon,S.；Bi,L.Determination of intracellular pH using sensitive,clickable fluorescentprobes.Bioorg.Med.Chem.Lett.22:2440-2443；2012. Yapici,N.B.；Jockusch,S.；Moscatelli,A.；Mandalapu,S.R.；Itagaki,Y.；et al.New rhodaminenitroxide based fluorescentprobes for intracellular hydroxyl radicalidentification in livingcells.Org Lett.14:50-53；2012.)获得所需的目标物9a-s。

这些氨基酸提供各种官能团，包括阳离子(Lys，Arg)，芳香基团(Tyr，Trp，Phe)，阴离子(Glu，Asp)和中性脂肪基团(Ser，Thr，Gly，Ala，Leu，Val，Ile)等不同基团。使用¹H和¹³C>

合成路线如下所示：

其中，试剂和条件为：I甲醛和硫酸；IIBoc2O和三乙胺；III苄醇，多磷酸， 回流；IVHOBt，DCC；VH₂，Pd/C；VI>2，Pd/C；炔丙胺，HBTU，三乙胺；IX>

更进一步的，本发明还提出了所述的吲哚-TEMPO缀合物在制备减弱肠缺血/ 再灌注诱导的远端器官损伤中的用途。

综上，本发明设计和合成了一系列新的吲哚-TEMPO缀合物(9a-s)，它们具有非 甾体抗炎药(NSAID)和一般抗氧化剂所具有的有益效果。该吲哚-TEMPO缀合物的 抗炎和抗氧化作用可以取决于两种药理学性质：(i)吲哚部分的抗炎能力； (ii)TEMPO基团可能有清除和灭活线粒体O₂^-·以及其它ROS的能力。本发明的研究>

在本发明中，我们研究了预先给予吲哚-双TEMPO 9r,s以减轻肠道I/R诱导的 肠以及包括肺，肝和肾的远端器官损伤的能力。尽管这些化合物的机制需要进一步 研究，但是它们的保护活性可能源于其抗炎，抗氧化和抗细胞凋亡的能力，这得到 吲哚-TEMPO缀合物可抑制1)LPO产生；2)TNF-α的释放；和3)线粒体细胞色素c 的释放这些事实的支持。然而，需要更多的研究来研究其他细胞因子(例如IL-1，IL-6) 是否参与由肠缺血/再灌注损伤诱导的多器官损伤，以及吲哚-TEMPO缀合物是否可 以在多器官功能衰竭期间保护另一个重要器官心脏，使之不受肠I/R损伤影响。这 些问题的答案可以帮助我们更好地理解吲哚TEMPO缀合物的机制和优化其使用， 单独或作为组合治疗剂的一部分以预防或减弱肠I/R损伤引起的多器官功能衰竭。

附图说明

图1为二甲苯诱导耳水肿试验法评估吲哚-TEMPO缀合物(9a-s)，Tempol(Tem) 及其前体(7a-s)的抗炎活性。阿司匹林(Asp)为阳性对照。n＝10；口服阿司匹林剂量 ＝20mg/kg；Tempol，7a-s和9a-s的口服剂量为0.10mmol/kg；*：与阿司匹林相比， p<0.05；**：与阿司匹林相比，p<0.01。

图2为耳水肿试验法评价不同剂量(0.02,0.05,0.10mmol/kg)的9f，i，j，p，r， s化合物的抗炎活性的结果n＝10；*：与0.02mmol/kg剂量的相同化合 物相比，p<0.05；**：与0.02mmol/kg剂量的相同化合物相比，p<0.01。

图3为吲哚-TEMPO缀合物(9f，i，p，r，s)及其前体7f，i，j，p，r，s对MPO 活性(U/g组织)的影响。n＝10。###：与载体对照相比，p<0.001；***：与二甲苯+ 载体对照相比，p<0.001；**：p<0.01；*：p<0.05。

图4A为吲哚-TEMPO缀合物的氧化还原反应；图4B吲哚-TEMPO缀合物及其 前体的最低能量构象异构体和最高占据分子轨道(HOMO)能量在图4中部分阐明。

图5为在没有(C)或用TEMPOL(Tem)或吲哚-TEMPO缀合物(9f，i，j，p，r，s) 预处理的模拟缺血-再灌注中的细胞死亡。误差条表示至少三个独立实验的平均值的 标准误差(与对照相比，*p<0.05)。

图6为在模拟缺血/再灌注(sI/R)期间线粒体中的氧化应激的检测。(A)用MitoProbe，MitoTracker和Hoechst 33342染色的HUVEC细胞的典型共焦荧光图像。 在sI/R期间，线粒体经历不同的形态学变化；(B)通过测量在不同时间点的荧光强 度增加，确定线粒体中O₂^-·的水平。在sI/R期间，MitoProbe荧光相对于基线值的增>

图7为模拟I/R期间细胞色素c的释放。(A)用MitoProbe将HUVEC细胞染 色。在模拟缺血后或再灌注3小时后，将细胞固定在基线。然后对细胞色素c进行 免疫染色；(B)将显示细胞色素c再分布的细胞加以量化并表达为总细胞群体的百分 比。在经历模拟I/R的细胞中观察到发生细胞色素c释放的细胞的百分比的显著增 加。在用吲哚-双TEMPO(9r,s)处理的细胞中细胞色素c释放显著减弱。误差条表示 来自至少三次独立实验的平均值的标准误差(与对照相比，*p<0.05)。

图8为来自I/R和I/R+9s处理组的小肠组织切片的代表性显微照片。(A)：H 与E染色；(B)：改性三色染色；(C)NADH染色。在I/R组中，绒毛的缩短，绒毛 尖端的空泡化，明显的固有层的解离和多形核白细胞的积累；用9s处理导致粘膜损 伤显著减弱，仅有轻微剥落的绒毛尖端和保存良好的腺体结构。(D)：9r,s对脂质 过氧化物的产生的影响(nmol/μg)；(E)：9r,s对血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的影响； 在D、E中，a：与假手术相比，p<0.01；b：与盐水+I/R相比，p<0.01。

图9为来自I/R和I/R+9s组的肾组织切片的代表性显微照片。(A)：H与E染 色；(B)：改性三色染色；(C)：NADH染色。从I/R组小鼠获取代表性组织切片： 管状坏死，管状结构的崩解和Bowman胶囊破裂在取自I/R组小鼠的组织中明显可 见；组织切片取自I/R+9s(30mg/kg)处理的小鼠：大多数小管是完整的，在9s治疗 组中，肾小管坏死显著减少，间质扩张最少。D)：9r,s对血尿素氮(BUN)血清水平 的影响；(E)：9r,s对肌酐(Cr)血清水平的影响；D与E，a：与假手术相比，p<0.01； b：与盐水+I/R相比，p<0.01。

图10为肝组织切片的代表性显微照片。(A)：H与E染色；(B)：改良三色染 色；(C)NADH染色。从I/R组的小鼠获取代表性组织切片：在从I/R组小鼠取出 的组织中明显出现严重的窦性扩张，出血，增粗的中心静脉和退化的肝细胞；从I/R +9s(30mg/kg)处理的小鼠获取的组织切片：存在轻度窦性扩张；中央静脉，肝门静 脉和肝细胞在大多数区域表现正常。D)：9r,s对丙氨酸氨基转移酶(ALT)血清水平 的影响；(E)：9r,s对天冬氨酸氨基转移酶(AST)血清水平的影响；在D与E中，a： 与假手术相比，p<0.01；b：与盐水+I/R相比，p<0.01。

图11为肺组织切片的代表性显微照片。(A)：H与E染色；(B)：改良三色染 色；(C)NADH染色。从缺血/再灌注的小鼠获取的代表性组织切片：在I/R组中记 录了出血，显著的细胞浸润和肺泡空间的消失；组织切片获取的I/R+9s(30mg/kg) 治疗的小鼠：间隔增厚和嗜中性粒细胞浸润在9s干预后显著改善。

图12为提出的吲哚-双TEMPOs与细胞色素c相互作用的机制；

图13A-C为化合物7a-s以及9a-s的分子动力学模拟结果。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是 限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。除非另有说明，所有化学品一般均购 自SigmaAldrich。所有反应在氮气气氛(1bar)下进行。使用TLC(60F₂₅₄型的Merck硅>18柱4.6mm×150mm)确认中间体和最终产物的>

实施例1 3S-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸(1)的制备

在5.0g(24.5mmol)L-色氨酸的溶液中加入25mL H₂SO₄(1mol/L)，80mL水和8mL>

Mp 280-282℃；EI/MS：217[M+H]⁺；IR(KBr)：3450,3200,3000,2950,2850,1700,1601,1452,1070,900cm^-1；¹H>6)：δ＝10.99(s，1H)，9.89(s，>

实施例2N-Boc-3S-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸(2)的制备

将1.1g(5.0mmol)化合物1在15mL DMF和1.4mL三乙胺中的悬浮液在室温下 剧烈搅拌，随后加入1.1g(7.7mmol)Boc-N₃并再搅拌30分钟。将反应混合物在室温>4干燥。>4后，将滤液通过蒸发干燥。所得残余物在CHCl₃中结晶，得>

Mp 165-170℃；¹H>6)：δ＝10.87(s,1H),9.86(s,1H),7.32>

实施例3(S)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-羧酸苄酯(3)的制备

在搅拌条件下，向10.0g聚磷酸和50mL苄醇的溶液中加入0.02mol化合物1。 将反应混合物在92℃下搅拌8小时,然后在200ml水中与20ml浓硫酸溶液混合。 混合物用20ml乙醚处理,分离水相,然后用调节至pH10的碳酸钠水溶液中和。用 乙醚(3×70ml)萃取该溶液,乙醚相用无水硫酸镁干燥。过滤后,滤液用氯化氢鼓泡， 沉淀出目标化合物3，产率为58％。

Mp：122-124℃；[α]_D²⁵＝53.4(c＝1.0,甲醇)；ESI-MS(m/z)：307[M+H]⁺；¹H>6)：δ/ppm＝7.27-7.40(m,7H),6.95(t,J＝7.5Hz,1H),7.02(t,J>13C>6)>

实施例4 3-(3-((苄氧基)羰基)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-2-羰基)-3,4-二 氢-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-2(9H)-甲酸叔丁酯(4)的制备

在0℃,搅拌下向化合物2(1.0mmol)的无水THF溶液中加入1.1mmol N-羟基苯 并三唑(HOBT)和1.1mmol N，N'-二环己基碳二亚胺(DCC)。搅拌30分钟后，加入 化合物3(1.1mmol)在5mL无水THF中的悬浮液。将反应混合物用N-甲基吗啉调 节至pH 8-9，然后在室温下搅拌过夜，直至TLC显示原料已耗尽。蒸发后，将残余 物溶于40mL乙酸乙酯中。将溶液用5％碳酸氢钠，5％KHSO4和饱和氯化钠充分 洗涤。分离有机层并用无水Na2SO4干燥。粗残余物经过滤并减压蒸发后，通过硅 胶快速柱色谱法纯化，得到化合物4，产率为80.6％。

Mp：230-232℃；[α]_D²⁵＝41.9(c＝1.0,甲醇)；ESI-MS(m/z)：606[M+H]⁺；¹H>6)：δ/ppm＝10.82-10.97(m,J＝27.5Hz,J＝49.5Hz,2H),>13C>6)δ/ppm＝>

实施例5 2-(2-(叔丁氧羰基)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-羰基)-2,3,4,9- 四氢-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-羧酸(5)的制备

化合物4(0.5mmol)溶于10mL MeOH加入40mg Pd/C,通入H2,然后在室 温下搅拌,直至TLC显示原料已耗尽。粗残余物经过滤并减压蒸发后,通过硅胶快 速柱色谱法纯化,得到化合物5，产率为83.5％。

Mp：245-248℃；[α]_D²⁵＝19.9(c＝1.0,甲醇)；ESI-MS(m/z)：513[M-H]^-

实施例6化合物6a-s的制备

制备6a-s的一般方法：在0℃搅拌下，向化合物5(514mg,1.0mmol)的无水THF 溶液中加入1.2mmol N-羟基苯并三唑(HOBT)和1.2mmol N,N'-二环己基碳二亚胺 (DCC)。搅拌10分钟后,加入1.2mmol氨基酸苄酯盐酸盐在5mL无水THF中的悬 浮液。将反应混合物用N-甲基吗啉调节至pH 8-9,然后在室温下搅拌过夜,直至 TLC显示原料已耗尽。蒸发后,将残余物溶于40mL乙酸乙酯中。将溶液用5％碳 酸氢钠,5％KHSO₄和饱和氯化钠充分洗涤。分离有机层并用无水Na₂SO₄干燥。粗>

(1)3-((S)-3-((2-(苄氧基)-2-氧代乙基)氨基甲酰基)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶并 [3,4-b]吲哚-2-羰基)-3,4-二氢-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-2(9H)-甲酸-(S)-叔丁酯(6a)：

产率：43％。Mp：145-148℃；[α]_D²⁵＝12.6(c＝1.0,甲醇)；ESI-MS(m/z)：>+。¹H>6)：δ/ppm＝10.84-10.91(m,2H)；8.56(m,1H),>13C>6)δ/ppm＝>

(2)3-((S)-3-(((R)-1-(苄氧基)-1-氧代丙-2-基)氨基甲酰基)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶 并[3,4-b]吲哚-2-羰基)-3,4-二氢-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-2(9H)-羧酸-(S)-叔丁酯(6b)：

产率：51％。Mp：146-148℃；[α]_D²⁵＝-29.4(c＝1.0,甲醇)；ESI-MS(m/z)676[M+H]⁺；>1H>6)：δ/ppm＝10.81-10.88(m,2H)；8.42(m,1H),7.18-7.43(m,9H),6.89-7.09(m,4H),5.64(m,1H),5.35(m,1H),5.07(m,1H),4.81-4.99(m,3H),>13C>6)δ/ppm＝172.55,171.96,170.96,170.16,>

(3)3-((S)-3-(((R)-1-(苄氧基)-3-甲基-1-氧代丁基-2)氨基甲酰基)-2,3,4,9-四氢 (4,4-二氢-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-2-羰基)-3,4-二氢-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-2(9H)羧酸 -(S)-叔丁酯(6c)：

产率：55％。Mp：125-127℃；[α]_D²⁵＝-18.0(c＝1.0,甲醇)；ESI-MS(m/z)704[M+H]⁺；>1H>6)：δ/ppm＝10.81-10.88(m,2H)；8.22(m,1H),7.18-7.43(m,9H),6.93-7.08(m,4H),5.65(m,1H),5.36(m,1H),4.31-5.29(m,6H),4.15(m,1H),>13C>6)δ/ppm＝>

(4)3-((S)-3-(((2R,3R)-1-(苄氧基)-3-甲基-1-氧代戊基-2)氨基甲酰基)-2,3,4,9- 四氢-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-2-羰基)-3,4-二氢-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-2(9H)-羧酸-(S)- 叔丁酯(6d)：

产率：48％。Mp：133.7-135℃；[α]_D²⁵＝-23.0(c＝1.0,甲醇)；ESI-MS(m/z)：>+。¹H>6)：δ/ppm＝10.82-10.91(m,2H),8.29(m,1H),>13C>6)δ/ppm＝172.51,171.44,>

(5)3-((S)-3-(((R)-1-(苄氧基)-4-甲基-1-氧代戊-2-基)氨基甲酰基)-2,3,4,9-四氢 -1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-2-羰基)-3,4-二氢-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-2(9H)-羧酸-(S)-叔丁 酯(6e)：

产率：55％。Mp：138-140℃；[α]_D²⁵＝-26.1(c＝1.0,甲醇)；ESI-MS(m/z)718[M+H]⁺；>1H>6)：δ/ppm＝10.81-10.88(m,2H)；8.32(m,1H),7.15-7.44(m,9H),6.93-7.09(m,4H),5.64(m,1H),5.35(m,1H),4.39-5.15(m,6H),4.21(m,1H),>13C>6)δ/ppm＝173.00,172.42,171.51,156.00,155.33,136.76,130.52,128.77,>

(6)3-((S)-3-(((R)-4-氨基-1-(苄氧基)-1,4-二氧代丁烷-2-基)氨基甲酰基)-2,3,4,9- 四氢-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-2(9H)–羧酸(S)叔丁酯(6f)：

产率：61％。Mp：162-164℃；[α]_D²⁵＝-2.5(c＝1.0,甲醇)；ESI-MS(m/z)719[M+H]⁺；¹H>6)：δ/ppm＝10.82-10.90(m,2H)；8.32(m,1H),7.18-7.50(m,>13C>6)δ/ppm＝206.95,172.34,171.60,171.28,170.47,>

(7)3-((S)-3-(((R)-1-(苄氧基)-3-(1H-咪唑-4-基)-1-氧代丙-2-基)氨基甲酰基)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-2-羰基)-3,4-二氢-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚 -2(9H)-羧酸-(S)-叔丁酯(6g)：

产率：64％。Mp：180-182℃；[α]_D²⁵＝-8.0(c＝1.0,甲醇)；ESI-MS(m/z)742[M+H]⁺；¹H>6)：δ/ppm＝10.84-10.82(m,J＝5Hz,2H)；8.58(m,J＝7Hz, 1H),7.96(s,1H),7.18-7.42(m,9H),6.89-7.11(m,5H),5.65(m,J＝1.5Hz,1H),5.34(m, J＝16.6Hz,1H),4.68-5.12(m,5H),4.31-4.52(m,2H),2.89-3.48(m,6H),1.48(s,9H)。>13C>6)δ/ppm＝172.24,171.06,170.60,163.42,155.26,136.77,135.01,132.52,>

(8)3-((S)-3-(((R)-1-(苄氧基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)氨基甲酰基)-2,3,4,9-四氢 -1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-2-羰基)-3,4-二氢-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-2(9H)-羧酸叔丁酯 (6h):

产率：58％。Mp：133-135℃；[α]_D²⁵＝-23.0(c＝1.0,甲醇)；ESI-MS(m/z)752[M+H]⁺；>1H>6)：δ/ppm＝10.76-10.90(m,2H)；8.35(m,1H),7.18-7.42(m,14H),6.89-7.11(m,4H),5.63(m,1H),5.35(m,1H),4.68-5.19(m,5H),4.21-4.65(m,>13C>6)δ/ppm＝171.45,171.29,>

(9)3-((R)-1-(苄氧基)-6-(((苄氧基)羰基)氨基)-1-氧代己-2-基)氨基甲酰基)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-2-羰基)-3,4-二氢-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚 -2(9H)–羧酸(S)-叔丁酯(6i)：

产率：57％。Mp：116-118℃；[α]_D²⁵＝-20.4(c＝1.0,甲醇)；ESI-MS(m/z)867[M+H]⁺；>1H>6)：δ/ppm＝10.82-10.89(m,J＝10Hz,2H)；8.25-8.45(m,>13C>6)δ/ppm＝172.84,172.03,171.23,169.90,156.52,155.97,141.64,>

(10)3-((S)-3-(((R)-1-(苄氧基)-3-(4-羟基苯基)-1-氧代丙-2-基)氨基甲酰基)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-2-羰基)-3,4-二氢-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚 -2(9H)-羧酸(S)-叔丁酯(6j)：

产率：66％。Mp：157-159℃；[α]_D²⁵＝-17.2(c＝1.0,甲醇)；ESI-MS(m/z)768[M+H]⁺；>1H>6)：δ/ppm＝10.80-10.91(m,2H)；9.33(s,1H),8.55(m,1H),7.18-7.42(m,9H),6.45-7.10(m,8H),5.64(m,1H),5.38(m,1H),4.66-5.15(m,6H),>13C>6)δ/ppm＝171.56,171.44,170.93,156.50,155.29,136.78,136.53,131.18,>

(11)3-((S)-3-(((R)-1-(苄氧基)-4-(甲硫基)-1-氧代丁烷-2-基)氨基甲酰基)-2,3,4,9-(3,4-二氢-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-2-羰基)-3,4-二氢-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚 -2(9H)-羧酸-(S)-叔丁酯(6k)：

产率：65％。Mp：131-133℃；[α]_D²⁵＝-16.5(c＝1.0,甲醇)；>+。¹H>6)：δ/ppm＝10.80-10.88(m,J＝>13C>6)δ/ppm＝>

(12)3-((S)-3-(((R)-1,3-双(苄氧基)-1-氧代丙-2-基)氨基甲酰基)-2,3,4,9-四氢-1H- 吡啶并[3,4-b]吲哚-2-羰基)-3,4-二氢-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-2(9H)-羧酸-(S)-叔丁酯 (61)：

产率：67％。Mp：120-122℃；[α]_D²⁵＝-15.4(c＝1.0,甲醇)；ESI-MS(m/z)782[M+H]⁺；>1H>6)：δ/ppm＝10.82-10.91(m,J＝16Hz,2H)；8.52(m,J＝8.0>13C>6)δ/ppm＝173.02,172.38,171.16,170.74,>

(13)3-((S)-3-(((R)-1-(苄氧基)-3-(1H-吲哚-3-基)-1-氧代丙-2-基)氨基甲酰基)-2, 3,4,9-(3,4-二氢-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-2-羰基)-3,4-二氢-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚 -2(9H)-羧酸-(S)-叔丁酯(6m)：

产率：54％。Mp：155-156℃；[α]_D²⁵＝-17.8(c＝1.0,甲醇)；ESI-MS(m/z)791[M+H]⁺；>1H>6)：δ/ppm＝10.78-10.90(m,J＝24.5Hz,3H)；8.56(m,1H),7.19-7.52(m,9H),6.90-7.09(m,9H),5.64(m,1H),5.36(m,1H),4.51-5.20(m,6H),>13C>6)δ/ppm＝>

(14)3-((S)-3-((R)-2-((苄氧基)羰基)吡咯烷-1-羰基)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶并 [3,4-b]吲哚-2-羰基)-3,4-二氢-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-2(9H)-羧酸(S)-叔丁酯(6n)：

产率：61％。Mp：150-152℃；[α]_D²⁵＝-2.7(c＝1.0,甲醇)；ESI-MS(m/z)702[M+H]⁺；¹H>6)：δ/ppm＝10.73-10.92(m,J＝27.5Hz,2H)；7.48(m,>13C>6)δ/ppm＝172.11,171.89,168.97,157.13,155.61,136.66,>

(15)(S)-3-((S)-3-(((2R,3R)-1,3-双(苄氧基)-1-氧代丁烷-2-基)氨基甲酰基)-2,3, 4,9四氢(3,4-二氢-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-2-羰基)-3,4-二氢-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚 -2(9H)-羧酸-(S)-叔丁酯(6o):

产率：55％。Mp：123-125℃；[α]_D²⁵＝-19.1(c＝1.0,甲醇)；ESI-MS(m/z)796[M+H]⁺；>1H>6)：δ/ppm＝10.82-10.91(m,2H)；8.3(m,J＝9Hz,1H),>13C>6)δ/ppm＝173.22,172.59,171.98,170.46,155.59,138.57,136.52,131.06,>

(16)3-((S)-3-(((R)-1-(苄氧基)-5-(3-硝基胍基)-1-氧代戊-2-基)氨基甲酰基)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-2-羰基)-3,4-二氢-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚 -2(9H)-羧酸-(S)-叔丁酯(6p)：

产率：68％。Mp：170-172℃；[α]_D²⁵＝-22.1(c＝1.0,甲醇)；ESI-MS(m/z)806[M+H]⁺；>1H>6)：δ/ppm＝10.84-10.89(m,2H)；8.56(m,1H),7.10-7.44(m,9H),6.89-7.10(m,4H),5.63(m,1H),5.37(m,1H),4.69-5.20(m,6H),4.49(m,1H),>13C>6)δ/ppm＝171.85,>

(17)3-((S)-3-(((R)-5-氨基-1-(苄氧基)-1,5-二氧代戊-2-基)氨基甲酰基)-2,3,4,9 四氢-(1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-2-羰基)-3,4-二氢-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-2(9H)-羧酸-(S)- 叔丁酯(6q)：

产率：57％。Mp：158-159℃；[α]_D²⁵＝-12.1(c＝1.0,甲醇)；ESI-MS(m/z)733[M+H]⁺；>1H>6)：δ/ppm＝10.83-10.91(m,2H)；8.44(m,J＝7.5Hz,1H),>13C>6)δ/ppm＝173.90,172.77,171.88,>

(18)2-((S)-2-((S)-2-叔丁氧基羰基-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶并[3,4-b]-羰基)-2,3,4,9- 四氢-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-甲酰氨基)-(R)-琥珀酸二苄酯(6r)：

产率：59％。Mp：114-117℃；[α]_D²⁵＝-10.9(c＝1.0,甲醇)；ESI-MS(m/z)810[M+H]⁺；>1H>6)：δ/ppm＝10.83-10.88(m,J＝4Hz,2H)；8.54(m,J＝8Hz,>13C>6)δ/ppm＝>

(19)2-((S)-2-((S)-2-叔丁氧基羰基-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶并[3,4-b]羰基)-2,3,4,9- 四氢-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-甲酰氨基)-2-(R)-戊二酸二苄酯(6s)：

产率：62％。Mp：114-116℃；[α]_D²⁵＝-15.2(c＝1.0,甲醇)；ESI-MS(m/z)824[M+H]⁺；>1H>6)：δ/ppm＝10.81-10.88(m,2H)；8.39(m,J＝7.5Hz,1H),>13C>6)δ/ppm＝172.64,172.07,170.93,156.05,155.25,136.82,130.59,129.26,>

实施例7化合物7a-s的制备

制备化合物7a-s的一般方法：在1.0mmol 6a-s的乙酸乙酯(5mL)溶液中加入1mLHCl/EtOAc。将反应混合物在室温下搅拌,直到TLC表明原料已耗尽。蒸发后,残 余物通过硅胶快速柱色谱法纯化,得到化合物7a-s。

(1)2-((S)-2-((S)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-羰基)-2,3,4,9-四氢-1H- 吡啶并[3,4-b]吲哚-3-甲酰胺基)乙酸苄酯(7a)：

产率：89％。Mp：180-183℃；[α]_D²⁵＝-74.4(c＝1.0,甲醇)；ESI-MS(m/z)562[M+H]⁺；>1H>6)：δ/ppm＝11.29(m,1H),10.25(m,1H),9.85(m,1H),8.75>13C>6)δ/ppm＝>

(2)2-(S)-2-((S)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-羰基)-2,3,4,9-四氢-1H-吡 啶并[3,4-b]吲哚-3-甲酰氨基)丙酸-(R)-苄酯(7b):

产率：87％。Mp：176-178℃；[α]_D²⁵＝-77.6(c＝1.0,甲醇)；ESI-MS(m/z)576[M+H]⁺；>1H>6)：δ/ppm＝11.34(m,1H),10.35(m,1H),9.88(m,1H),8.68>13C>6)δ/ppm＝>

(3)3-甲基-2-((S)-2-((S)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-羰基)-1,2,3,4-四 氢-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-甲酰氨基)丁酸-(R)-苄酯(7c)：

产率：90％。Mp：168-170℃；[α]_D²⁵＝-98.9(c＝1.0,甲醇)；ESI-MS(m/z)604[M+H]⁺； 1H>6)：δ/ppm＝11.37(m,1H),10.25(m,1H),9.89(m,1H),>13C>6)δ/ppm＝172.35,171.46,169.69,>

(4)2-((S)-2-((S)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-羰基)-2,3,4,9-四氢-1H- 吡啶并[3,4-b]吲哚-3-甲酰氨基)-(2R,3R)-3-甲基-戊酸苄酯(7d)：

产率：87％。Mp：166-168℃；[α]_D²⁵＝-129.0(c＝1.0,甲醇)；>+；¹H>6)：δ/ppm＝11.37(m,1H),10.35>13C>6)δ/ppm＝172.34,171.27,169.68,136.82,>

(5)4-甲基-2-((S)-2-((S)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-羰基)-2,3,4,5-四 氢-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-甲酰氨基)戊酸-(R)-苄酯(7e)：

产率：92％。Mp：156-158℃；[α]_D²⁵＝-57.3(c＝1.0,甲醇)；ESI-MS(m/z)618[M+H]⁺；>1H>6)：δ/ppm＝11.36(m,1H),10.30(m,1H)；9.85(m,1H),8.65>13C>6)δ/ppm＝172.42,172.39,169.63,136.78,136.30,129.49,128.97,128.69,>

(6)4-氨基-4-氧代-2-((S)-2-((S)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3羰基)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-甲酰胺基)丁酸-(R)-苄酯(7f)：

产率：92％。Mp：194-196℃；[α]_D²⁵＝-137.0(c＝1.0,甲醇)；>+；¹H>6)：δ/ppm＝11.28(m,1H),10.95>13C>6)δ/ppm＝172.38,171.38,170.10,169.46,136.79,>

(7)3-(1H-咪唑-4-基)-2-((S)-2-((S)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-羰 基)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-甲酰氨基)丙酸-(R)-苄酯(7g)：

收率：93％。Mp：183-185℃；[α]_D²⁵＝-72.5(c＝1.0,甲醇)；ESI-MS(m/z)642[M+H]⁺；>1H>6)：δ/ppm＝11.25(m,1H),10.98(m,1H),10.05(m,1H),>13C>6)δ/ppm＝171.40,170.18,169.42,136.82,136.06,135.43,135.22,130.67,>

(8)3-苯基-2-((S)-2-((S)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-羰基)-2,3,4,9四 氢-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-甲酰氨基)丙酸-(R)-苄酯(7h)：

产率：82％。Mp：154-156℃；[α]_D²⁵＝-88.3(c＝1.0,甲醇)；ESI-MS(m/z)652[M+H]⁺；>1H>6)：δ/ppm＝11.35(m,1H),10.89(m,1H),9.98(m,1H),8.85>13C>6)δ/ppm＝172.36,170.55,169.30,>

(9)6-(((苄氧基)羰基)氨基)-2-((S)-2-((S)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚 -2,3,4,9-四氢-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-甲酰氨基)己酸-(R)-苄酯(7i)：

收率：85％。Mp：134-136℃；[α]_D²⁵＝-54.0(c＝1.0,甲醇)；ESI-MS(m/z)767[M+H]⁺；>1H>6)：δ/ppm＝11.28(m,1H),10.95(m,1H),10.20(m,1H),9.85>13C>6)δ/ppm＝172.35,171.84,169.82,156.55,136.81,136.29,130.01,129.49,128.77,128.16,127.09,122.22,119.61,118.04,111.62,105.33,67.53,66.26,65.58,54.60,53.03,52.35,50.93,42.23,30.88,29.42,23.03,21.51。

(10)3-(4-羟基苯基)-2-((S)-2-((S)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶并[3,4-b]-羰基)-2,3,4,9- 四氢-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-甲酰胺基)丙酸-(R)-苄酯(7j)：

产率：83％。Mp：175-178℃；[α]_D²⁵＝-77.6(c＝1.0,甲醇)；ESI-MS(m/z)668[M+H]⁺；>1H>6)：δ/ppm＝11.25(m,1H),10.90(m,1H),10.25(m,1H),>13C>6)δ/ppm＝172.43,170.63,>

(11)4-(甲硫基)-2-((S)-2-((S)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶并[3,4-b]-2,3,4,9-四氢-1H- 吡啶并[3,4-b]吲哚-3-甲酰胺基)丁酸-(R)-苄酯(7k)：

产率：88％。Mp：165-168℃；[α]_D²⁵＝-82.5(c＝1.0,甲醇)；ESI-MS(m/z)635[M+H]⁺；>1H>6)：δ/ppm＝11.27(m,1H),10.30(m,1H),9.85(m,1H),8.65>13CNMR(DMSO-d₆)δ/ppm＝172.35,170.72,169.54,136.81,136.27,129.92,>

(12)3-(苄氧基)-2-((S)-2-((S)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-羰基)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-甲酰氨基)丙酸-(R)-苄酯(7l)：

产率：87％。Mp：148-150℃；[α]_D²⁵＝-78.8(c＝1.0,甲醇)；ESI-MS(m/z)682[M+H]⁺；>1H>6)：δ/ppm＝11.30(m,1H),10.20(m,1H),9.85(m,1H),8.78 (m,1H),7.15-7.56(m,9H),6.98-7.12(m,4H),5.01-5.35(m,J＝11Hz,J＝9.5Hz,2H), 4.75-5.00(m,J＝11.5Hz,2H),4.25-4.65(m,6H),3.15-3.58(m,4H),2.89-3.10(m,2H)。>13C>6)δ/ppm＝172.41,170.15,169.60,137.78,136.77,136.15,129.47,>

(13)3-(1H-吲哚-3-基)-2-(2-(2,3,4,9-四氢-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-羰基)-2,3,4, 9四氢-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-甲酰氨基)丙酸苄酯(7m)：

产率：89％。Mp：184-186℃；[α]_D²⁵＝-67.4(c＝1.0,甲醇)；ESI-MS(m/z)691[M+H]⁺；>1H>6)：δ/ppm＝11.36(m,1H),10.97(m,1H),10.25(m,1H),>13C>6)δ/ppm＝172.43,171.87,>

(14)1-((S)-2-((S)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-羰基)-2,3,4,9四氢-1H- 吡啶并[3,4-b]吲哚-3-羰基)吡咯烷-2-羧酸-(R)-苄酯(7n)：

产率：85％。Mp：169-171℃；[α]_D²⁵＝-62.4(c＝1.0,甲醇)；ESI-MS(m/z)602[M+H]⁺；>1H>6)：δ/ppm＝11.32(m,1H),10.25(m,1H),9.85(m,1H),>13C>6)δ/ppm＝172.41,171.50,169.10,136.73,136.29,>

(15)(3R)-3-(苄氧基)-2-((S)-2-((S)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-羰 基)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-甲酰氨基)丁酸-(2R)-苄酯(7o)：

产率：85％。Mp：154-156℃；[α]_D²⁵＝-64.7(c＝1.0,甲醇)；ESI-MS(m/z)696[M+H]⁺；>1H>6)：δ/ppm＝11.37(m,1H),10.25(m,1H),9.89(m,1H),8.45>13C>6)δ/ppm＝172.42,>

(16)(R)-(3-硝基胍基)-2-((S)-2-((S)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶并[3,4-b]-羰基)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-甲酰氨基)戊酸苄酯(7p)：

产率：87％。Mp：174-175℃；[α]_D²⁵＝-26.7(c＝1.0,甲醇)；ESI-MS(m/z)706[M+H]⁺；>1H>6)：δ/ppm＝11.27(m,1H),10.96(m,1H),9.89(m,1H),8.65>13C>6)δ/ppm＝172.38,171.70,169.61,159.80,136.80,136.22,130.00,128.78,>

(17)5-氨基-5-氧代-2-((S)-2-((S)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-羰 基)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-甲酰氨基)戊酸-(R)-苄酯(7q)：

产率：81％。Mp：179-181℃；[α]_D²⁵＝-80.3(c＝1.0,甲醇)；ESI-MS(m/z)633[M+H]⁺；>1H>6)：δ/ppm＝11.30(m,1H),10.95(m,1H),10.56(m,1H),>13C>6)δ/ppm＝174.13,172.44,171.70,169.62,>

(18)(R)-2-((S)-2-((S)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-羰基)-2,3,4,9-四氢 -1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-甲酰氨基)琥珀酸二苄酯(7r)：

产率：80％。Mp：140-142℃；[α]_D²⁵＝-103.7(c＝1.0,甲醇)；>+；¹H>6)：δ/ppm＝11.33(m,1H),10.25>13C>6)δ/ppm＝172.36,170.52,170.29,169.46,>

(19)(R)-2-((S)-2-((S)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-羰基)-2,3,4,9-四氢 -1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-甲酰氨基)戊二酸二苄酯(7s)：

产率：82％。Mp：135-137℃；[α]_D²⁵＝-96.4(c＝1.0,甲醇)；ESI-MS(m/z)724[M+H]⁺；>1H>6)：δ/ppm＝11.27(m,1H),10.25(m,1H),9.89(m,1H),8.69>13C>6)δ/ppm＝173.21,172.59,171.38,169.80,136.77,136.23,129.94,129.45,>

实施例8化合物8a-s的制备

化合物8a-s的一般制备方法：在1.0mmol 7a-s的无水乙醇(140mL)溶液中加入0.20g Pd/C。在H₂气氛中将反应混合物在室温下搅拌,直到TLC指示起始材料耗尽。>2Cl₂洗涤,真空蒸发合并的滤液。将残余物>2Cl₂中,用饱和盐水溶液洗涤两次。将有机层用无水Na₂SO₄干燥,过滤并浓>

将残余物溶解在10mL无水CH₂Cl₂中,并依次补充2-(1H-苯并三唑-1->2Cl₂稀释,随后用盐水洗涤。合并有机层,用无水硫>

4-叠氮基-Tempo：在冰浴将1.1g NaN₃(17.0mmol)溶解于5mL水中,加甲苯5mL。>3溶液直至鼓泡停止。反应混合物用甲苯(10mL×2)萃取,有机层用无>3(23.8mmol)。随后,加入100mgCuSO₄(0.63mmol),随后加入12mL三氟甲>3溶液洗涤并用>1H>3)δppm：1.15(s,6H),1.21(s,6H),1.52(t,J＝12.2Hz,2H),1.85>13C>3)δppm20.1,32.5,44.3,52.9,59.1。

实施例9化合物9a-s的制备

制备化合物9a-s的一般方法：室温下在0.5mmol化合物8a-s和0.6mmol 4-叠氮基-Tempo在3mL乙腈中的溶液中加入15.2mg碘化铜(I)(0.08mmol)。将反应混合物 在室温下搅拌6小时。反应混合物用饱和NaHCO₃水溶液(3×10mL)洗涤,然后用乙>

(1)(S)-N-(2-(((1-(1-(1-氧基-2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基) 氨基)-2-氧代乙基)-2-((S)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-羰基)-2,3,4,9-四氢 -1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-甲酰胺(9a)：

产率：57％。¹H>3),δ/ppm＝11.52(brs),10.84(brs),9.87(brs),8.85(brs),7.60(brs),7.21-7.45(brs),6.90-7.20>13C>6)δ/ppm＝172.3,170.0,169.1,136.8,136.3,130.5,129.4,128.8,127.6,123.1,126.5,122.6,119.7,121.2,119.0,118.2,117.3,111.8,105.1,>+计算值>

(2)(S)-N-((R)-1-(((1-(1-氧基-2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基) 氨基)-1-氧代丙-2-基)-2-((S)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-羰基)-2,3,4,9-四氢 -1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-甲酰胺(9b)：

产率：68％。¹H>3),δ/ppm>13C>6)δ/ppm＝172.5,170.5,169.3,130.4,131.5,136.2,137.2,130.5,123.0,127.6,126.7,122.0,121.5,120.3,121.8,112.1,>+计算值720.3782,实测值720.3851。

(3)(S)-N-((R)-1-(((1-(1-氧基-2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基) 氨基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)-2-((S)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-羰 基)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-甲酰胺(9c)：

产率：55％。¹H>3),δ/ppm＝11.55(brs),10.87(brs),9.07(brs),8.78(brs),7.63(brs),7.22-7.40(brs),6.90-7.20>13C>6)δ/ppm＝170.5,171.3,169.8,131.2,135.8,134.3,131.5,129.7,128.5,123.2,126.4,127.4,122.5,122.6,120.2,120.3,>+计算值748.4095,实测值>

(4)(S)-N-((2R,3R)-1-(((1-(1-氧基-2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)-1H-1,2,3-三唑-4- 基)甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代戊烷-2-基)-2-((S)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶并[3,4-b]-3-羰 基)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-甲酰胺(9d)：

产率：47％。¹H>3),δ/ppm＝11.50(brs),10.98(brs),8.97(brs),8.65(brs),7.62(brs),6.92-7.20(brs),7.21-7.40>13C>6)δ/ppm＝172.2,170.7,169.8,131.7,132.5,137.5,135.3,131.4,123.1,>+计算值762.4251[M+H]⁺,实测值：762.4312。

(5)(S)-N-((R)-1-(((1-(1-氧基-2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基) 氨基)-4-甲基-1-氧代戊烷-2-基)-2-((S)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-羰 基)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-甲酰胺(9e)：

产率：51％。¹H>3),δ/ppm＝11.50(brs),10.88(brs),9.17(brs),8.67(brs),7.62(brs),6.92-7.20(brs),7.21-7.35(brs),4.95(brs),4.45-4.55(brs),3.70-3.90(brs),2.95-3.05(brs),2.0(brs),1.52-1.75(brs),1.20(brs),1.01(brs)。观察到的>13C>6)δ/ppm＝171.8,>+计算值762.4251,实测值：762.4297。

(6)(R)-N¹-((1-(1-氧基-2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)-2-((S)-2-((S)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-羰基)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶并>

产率：56％。¹H>3),δ/ppm＝11.53(brs),10.83(brs),9.08(brs),8.67(brs),7.64(brs),7.05-7.23(brs),7.02(brs),6.95-7.20(brs),7.21-7.40(brs),4.85-4.95(brs),4.45-4.55(brs),3.70-3.90(brs),2.93-3.05(brs),2.77(brs),2.011.20(brs)。>13C>6)δ/ppm＝172.7,172.2,170.6,169.6,138.1,135.0,132.7,130.5,131.3,>+计算值763.3840。实测值：763.3877。

(7)(S)-N-((R)-1-(((1-(1-氧基-2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲 基)氨基)-3-(1H-咪唑-4-基)-1-氧代丙-2-基)-2-((S)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶并[3,4-b]羰 基)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-甲酰胺(9g)：

产率：47％。¹H>3),δ/ppm＝11.50(brs),10.85(brs),8.97(brs),8.52(brs),7.60-7.65(brs),7.21-7.45(brs),4.92-4.96(brs),4.45-4.55(brs),3.70-3.95(brs),>13C>6)δ/ppm＝171.7,170.5,169.3,137.6,136.3,135.8,132.1,>+计算值786.4000。实测值：786.4076。

(8)(S)-N-((R)-1-(((1-(1-氧基-2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基) 氨基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)-2-((S)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-羰基)-2,3, 4,9-四氢-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-甲酰胺(9h)：

产率：52％。¹HNMR(400MHz,CDCl₃),δ/ppm＝11.50(brs),10.87(brs),8.95(brs),8.67(brs),7.62(brs),6.92-7.20(brs),7.21-7.45(brs),4.95-5.05(brs),4.45-4.57(brs),>13C>6)δ/ppm＝172.5,171.0,169.7,136.5,137.0,>+计算>

(9)(S)-N-((R)-6-氨基-1-(((1-(1-氧基-2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)-1H-1,2,3-三唑-4- 基)甲基)氨基)-1-氧代己-2-基)-2-((S)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-羰 基)-2,3,4,9-1,2,3,4-四氢-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-甲酰胺(9i)：

产率：58％。¹H>6)：δ/ppm＝11.37(brs),10.97(brs),>13C>6)δ/ppm＝171.8,170.5,169.3,131.5,130.8,135.8,137.4,132.0,123.5,128.1,126.9,122.3,122.8,120.4,119.4,>+计算值777.4360,实测值777.4425。

(10)(S)-N-((R)-1-(((1-(1-氧基-2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲 基)氨基)-3-(4-羟基苯基)-1-氧代丙-2-基)-2-((S)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚 -3-(羰基)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-甲酰胺(9j)：

产率：41％。¹H>13C>6)δ/ppm＝172.4,170.6,169.7,156.7,136.4,131.2,132.4,130.2,129.4,>+计算值812.4044。实>

(11)(S)-N-((R)-1-(((1-(1-氧基-2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲 基)氨基)-4-(甲硫基)-1-氧代丁烷-2-基)-2-((S)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3- 羰基)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-甲酰胺(9k)：

产率：49％。¹H>6)：δ/ppm＝11.52(brs),10.88(brs), 8.97(brs),8.65(m,1H),7.65(brs),6.91-7.20(brs),7.21-7.45(brs),4.95-5.05(brs),4.45-4.55(brs),3.70-3.95(brs),2.90-3.10(brs),2.05-2.60(brs),2.00-2.10(brs),1.20(brs)。>13C>6)δ/ppm＝170.3,169.7,172.4,136.8,136.3,130.2,130.6,130.5,123.7,>+计算值780.3815。实测值,780.3887。

(12)(S)-N-((R)-3-羟基-1-(((1-(1-氧基-2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)-1H-1,2,3-三唑 -4-基)甲基)氨基)-1-氧代丙-2-基)-2-((S)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-羰 基)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-甲酰胺(9l)：

产率：51％。¹H>6)：δ/ppm＝11.55(brs),10.88(brs),>13C>6)δ/ppm＝172.8,170.2,167.4,130.4,135.5,>+计算值>

(13)(S)-N-((R)-1-(((1-(1-氧基-2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲 基)氨基)-3-(1H-吲哚-3-基)-1-氧代丙-2-基)-2-((S)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶并[3,4-b]吡啶 -3-羰基)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-甲酰胺(9m)：

产率：43％。¹H>6)：δ/ppm＝11.57(brs),11.02(brs),>13C>6)δ/ppm＝172.4,171.7,>+>

(14)(R)-N-((1-(1-氧基-2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)氨 基)-1-(S)-2-((S)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-羰基)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶并 [3,4-b]吲哚-3-羰基)吡咯烷-2-甲酰胺(9n)：

产率：38％。¹H>6)：δ/ppm＝11.52(brs),10.25(brs),>13C>6)δ/ppm＝170.8,169.2,167.8,136.2,135.5,131.5,>+计算值746.3938,实测值746.4007。

(15)(S)-N-((2R,3R)-3-羟基-1-(((1-(1-氧基-2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)-1,2,3-三唑 -4-基)甲基)氨基)-1-氧代丁烷-2-基)-2-((S)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-羰 基)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-甲酰胺(9o)：

产率：51％。¹H>6)：δ/ppm＝11.57(brs),10.65(brs),>13C>6)δ/ppm＝172.4,171.5,169.7,131.5,>+计算值750.3887,实测值750.3943。

(16)(S)-N-((R)-1-(((1-(1-氧基-2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲 基)氨基)-5-(3-硝基胍基)-1-氧代戊-2-基)-2-((S)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3- 羰基)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-甲酰胺(9p)：

产率：47％。¹H>6)：δ/ppm＝11.54(brs),11.02(brs),>13C>6)δ/ppm＝172.4,171.70,>+计算值850.4273,实测值850.4345。

(17)(R)-N¹-((1-(1-氧基-2,2,6,6-四甲基哌-4-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)-2-((S)-2-((S)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-羰基)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶并>

产率：54％。¹H>6)：δ/ppm＝11.50(brs),10.95(brs),>13C>6)δ/ppm＝174.1,172.4,171.7,169.6,136.7,136.2,>+计算值777.3996,>

(18)N¹,N⁴-双((1-(1-氧基-2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)-2-((S)-2-((S)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-羰基)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶并>

产率：45％。¹H>6)：δ/ppm＝11.60(brs),10.89(brs), 8.98(brs),8.65(brs),8.42(brs),7.60-7.65brs),6.97-7.20(brs),7.21-7.45(brs), 4.15-4.55(brs),4.55-4.96(brs),3.70-3.95(brs),2.75-3.10(brs),1.93-2.0(brs),1.20(brs)。>13C>6)δ/ppm＝173.8,172.5,170.3,169.8,136.8,136.2,131.2,131.0,130.9,128.4,128.0,123.6,122.5,121.8,120.3,118.7,111.0,111.5,105.6,72.4,70.7,56.5,55.0,50.7,43.5,44.0,36.6,39.0,37.8,32.9,25.6,23.3,22.5。HR/MS[M+H]⁺计算值998.5399,实测值,998.5450。

(19)(R)-N¹,N⁵-双((1-(1-氧代-2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲>

产率：49％。¹H>6)：δ/ppm＝11.57(brs),11.02(brs),>13C>6)δ/ppm＝174.1,171.3,>+计算值1012.5555,实测值1012.5632。

实施例10吲哚-TEMPO缀合物9a-s在保护远隔器官对抗缺血再灌注损伤中的 用途

1、方法

1.1细胞培养

人脐静脉内皮细胞(HUVEC)在加有内皮细胞生长补充剂，5％胎牛血清和青霉 素/链霉素溶液的内皮细胞培养基中，在37℃下，5％CO₂的培养箱中培养。

1.2模拟缺血/再灌注(sI/R)方案

sI/R在流通室中实现。简言之，用磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗涤细胞，并在平衡盐 溶液(116mmol/L NaCl，5.4mmol/L KCl，0.8mmol/L MgSO₄，1mmol/L>2PO₄，>2和10mg/L酚红)中孵育。然后将细胞在配有紧凑型气体氧含量控制>2和5％CO₂的气体>

1.3分子动力学模拟

基于MM2力场进行分子动力学评价(CambridgeSoft Chem与Bio 3D 12.0)。使 用的一些重要参数以下：步间隔：2.0fs；帧间隔：10fs；10000步后终止；加热/ 冷却速率：1.000Kcal/atom/ps；目标温度：300°K.

1.4生物测定

所有动物实验按照美国国家卫生研究院公布的“Guide to the Care and Use ofLaboratory Animals”进行。

1.5体内抗炎活性评价

用二甲苯诱导的耳水肿试验法评价所合成化合物的抗炎活性。简言之，将雄性ICR小鼠(20±2g)随机分为三组，包括测试组，载体对照(1％羧甲基纤维素溶液，CMC) 和阳性对照组(阿司匹林)。阳性对照组接受阿司匹林在CMC(10mg/kg)中的口服悬浮 液。测试组最初接受测试物质在CMC中的口服悬浮液(0.10mmol/kg)。三十分钟后， 将0.03ml二甲苯施加到右耳的前、后表面，左耳用作对照。在施用二甲苯后两小时， 处死小鼠，取出两只耳朵。使用软木钻孔器获得多个圆形截面并称重。通过从处理 的截块重量中减去未处理的组织截块重量来确定与二甲苯刺激相关的重量增加。 髓过氧化物酶(MPO)活性

测定组织相关的髓过氧化物酶(MPO)活性，是一种用来测量嗜中性粒细胞浸润 和氧化损伤的间接估计方法，根据先前报道的一种方法进行。结果表示为U/g组织。

1.6尾出血时间测量

以0.50mmol/kg的剂量给雄性小鼠(体重18-22g)口服施用新合成的吲哚-TEMPO缀合物(9a-s)。在给药30,45,60和90分钟后，将小鼠放置在管支架中，使其尾部伸 出，在尾部切出2mm切口。每30秒用纸巾轻轻擦去流动的血液直到出血停止并记 录时间。

1.7肠缺血/再灌注模型

将雄性Wistar小鼠(250±50g)随机分为五个实验组：(1)假手术组：以除了缺血/再灌注(I/R)外的下述程序处理的小鼠(n＝8)；(2)I/R组：经受肠缺血45分钟，接着 再灌注12小时然后以下述程序处理的小鼠(n＝8)；(3)I/R+药物(TEMPOL或吲哚- 双TEMPOs 9r,s)治疗组：小鼠(n＝8)在再灌注5分钟前接受大剂量注射药物 (TEMPOL 9r,s，30mg/kg，溶解于盐水中)，然后在整个再灌注期接受药物的连续输 注(TEMPOL或9r,s，10mg/kg/hr)。给组(1)和(2)中的动物施用盐水载体代替药物。 通过腹膜内注射戊巴比妥钠(80mg/kg)麻醉雄性Wistar小鼠。在整个实验中，借助于 加热垫将体温维持在37℃。通过中线切口进入腹膜腔进行剖腹手术。小肠轻轻暴露 在湿纱布上，随后使用微血管夹闭塞肠系膜上动脉45分钟，然后再灌注12小时。 根据小肠的肠系膜血管的苍白和无脉动来确认充分的阻塞。在再灌注期间缝合外科 切口。假手术的小鼠经受相同的手术方案，但没有经受夹死肠系膜动脉，并且在实 验期间保持麻醉。在每个指定的时间点，从每组中随机处死8只小鼠；收集血液样 品，收集肝脏，肾脏，肺，以及小肠的全厚度样品，用以进行进一步分析。将血液 样品以1000g离心10分钟，收集血清并储存在-80℃。

1.8脂质过氧化物(LPO)的测量

如前所述，通过丙二醛法测定肠中LPO的量。简言之，制备肠组织匀浆，并与 含有十二烷基硫酸钠，乙酸溶液和硫代巴比妥酸溶液的反应溶液在95℃下温育60 分钟。冷却至室温后，加入H₂O和正丁醇，剧烈振荡混合物，然后在3000g离心>

1.9血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的测定

促炎细胞因子TNF-α的血清水平被用作全身炎症的代表。使用市售ELISA试剂 盒和制造商推荐的方案(Jingmei BioTech Co.Ltd，中国)测定上清液中的血清TNF- α水平。其水平表示为pg/mL。

1.10生化测定

使用自动生物化学分析仪(东芝，日本)通过Jaffe反应的动力学测定丙氨酸氨基转移酶(ALT)，天冬氨酸转氨酶(AST)，血尿素氮(BUN)和肌酸酐(Cr)的血清水平。 组织学分析

在局部缺血/再灌注操作完成并安乐死后立即取出10mm长度的末端回肠条带。 通过中间胸骨切开术获取肺组织。然后使用低温恒温切片机(Leica CM1850UV临床 低温恒温器)在-30℃下切割冷冻组织切片(4-5mm)，分别用苏木精-曙红染色，改良 的三色染色和NADH染色，然后在明场(Olympus BX51)下观察。组织病理学评价研 究以双盲方式进行。

1.11统计分析

开始时用Origin程序采用双向方差分析接着进行Scheffé检验以测试组之间的差异。如果观察到差异，则使用Student’s t-test比较成对数据。数值表示为平均值±SE。如果p<0.05，则认为结果是显著的。

2、结果

2.1体内抗炎活性

我们采用二甲苯诱导的小鼠耳水肿试验法研究了吲哚-TEMPO缀合物9a-s的抗 炎性质(表1)。作为常见的炎症诱导剂，二甲苯可通过诱发急性炎症反应诱导耳朵 的严重水肿变化。该模型提供了快速、敏感并可靠地筛选抗炎剂的活体试验法。

表1化合物9a-s在二甲苯诱导的耳部水肿小鼠中的抗炎活性

吲哚环是具有抗炎和抗氧化作用的重要药效基团。由图1可见，吲哚衍生物(7f-s)的抗炎活性显著高于载体(CMC)的抗炎活性。有趣的是，将TEMPO基团引入吲哚 衍生物导致抗炎活性显著的改善。在一些情况下，这种趋势是显著的。例如，化合 物9f，i，j，p，r，s(剂量为0.10mmol/kg)表现为有效的抗炎剂，超过对照(阿司匹 林)的抗炎能力。其中，吲哚-双TEMPO 9r,s是最有效的抗炎剂，实现77-80％的炎 症抑制。看来，存在于缀合物中的TEMPO部分越多，炎症抑制越强。

接着，对化合物9f，i，j，p，r，s作了量效关系表征以获得更详细的药效学曲 线。施加0.02,0.05和0.10mmol/kg剂量的结果是，化合物9f，i，j，p，r，s产生剂 量依赖性抗炎反应(图2)。最有效的吲哚-双氮氧化合物(9r,s，剂量＝0.02mmol/kg) 优于阿司匹林。假设炎症过程导致下游抗氧化防御的损害，我们推测9a-s抗炎活性 的改善与TEMPO基团增强了的抗氧化性作用有关，进一步突显出较小的结构改变 可导致药物功效显著的协同改善。

2.2吲哚-TEMPO缀合物(9f，i，j，p，r，s)对髓过氧化物酶(MPO)活性的影响

髓过氧化物酶(MPO)活性是一种重要的炎症标志物。在二甲苯诱导的耳水肿模 型中，MPO活性由小鼠耳朵的水肿活检中的嗜中性粒细胞积累反映出来。我们观察 到二甲苯的施用显著增加耳朵中的MPO活性。然而，甚至在0.02mmol/kg的剂量 下，吲哚-TEMPO缀合物9f，i，j，p，r，s可显著降低已升高的MPO活性(图3)。 我们观察到由这些化合物抑制水肿和MPO活性之间的良好相关性。因此，我们提 出这些化合物的作用机制可能是下调发炎组织中各种细胞因子如IL-1b，IL-6和 TNF-α的表达(这些结果将在其它地方更详细地报道)。

2.3出血倾向的评价

常规的NSAID通常与几种显著的副作用相关，例如胃肠道出血，血小板功能 受损和出血时间延长。为了开发更安全的抗炎剂，评价这些新合成的吲哚TEMPO 缀合物对正常止血可能的有害影响导致出血并发症是重要的。因此，我们用啮齿动 物尾部出血测定法以估测与我们的吲哚-TEMPO缀合物(9a-s)相关的抗凝度。我们调 整皮肤出血时间实验方案，以评估这些化合物的抗凝血特性。结果证实，即使在高 剂量(0.50mmol/kg)下，我们的吲哚-TEMPO缀合物(9a-s)在所有评估时间点都不显著 延长小鼠的出血时间(表2)。

表2吲哚-TEMPO缀合物(9a-s)对小鼠尾部出血时间(X±SD)的影响

N＝10；NS＝Sahne.

2.4分子动力学模拟研究

化合物7a-s以及9a-s的分子动力学模拟结果如图13所示。

基于上述结果，我们提出吲哚-TEMPO缀合物可通过抑制嗜中性粒细胞浸润进 入炎症部位来发挥其抗炎活性。在该过程中，这些化合物的氮氧化物部分可以还原 成羟胺，羟胺可以作为有效的自由基清除剂(图4A)。氮氧化物基团的高可达性与这 些化合物的高功效有关。例如，对吲哚-TEMPO缀合物的模拟研究表明，化合物9b 的氮氧化物部分被埋在相邻的取代基之间，而化合物9p的氮氧化物部分从分子的 其余部分突出。这可以为相同系列中这两种类似物(9b：32.92％抑制；9p：63.14％ 抑制)之间观察到的抗炎活性差异提供一个说法。

抗氧化剂的自由基清除作用与选择的分子和生物化学参数相关，例如最高占据分子轨道(HOMO)能量，净电荷，以及羟胺与其自由基之间的形成热之差。在我们 目前的工作中，还研究了氮氧化物衍生物的键离解焓，形状指数和溶剂可达表面的 重要贡献。沿着这些思路，HOMO的电离能量可以用作抗氧化剂参与自由基清除能 力的量度。表征电子供应能力的HOMO能量适于表示自由基清除效率，是因为抑 制自氧化的过程可包括电子的转移与H原子提取的接合。较高的HOMO能量意味 着分子是良好的电子给体。因为氢原子的提取涉及电子转移，所以氮氧化物的 HOMO组成可以为其清除自由基活性的活性位点特性提供定性的见解。作为一般规 则，HOMO能量越高，化合物就抗氧化能力而言活性越高。例如，7r,s的HOMO 能量分别为-9.374eV，-9.485eV。相比之下，它们的对应物的HOMO能量，9r,s分 别是-5.888eV，-5.895eV(图4B)。理论上，吲哚-双TEMPO 9r,s应具有比它们各自 的母体化合物7r,s更高的自由基捕获电位。吲哚-TEMPO缀合物的高HOMO能量 突显出它们的电子供体电位和配位能力，表明它们可以用作金属离子配位剂并随之 作为离子催化氧化过程的抑制剂。

2.5吲哚-TEMPO缀合物在模拟缺血/再灌注(sI/R)细胞模型中的保护作用

接下来，我们审视了这些化合物在模拟I/R细胞模型中保护细胞免受I/R诱导 死亡的能力。在我们的分析中，在流通过程中对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)进行模 拟I/R损伤。在模拟缺血期间，没有观察到显著的细胞死亡。在细胞暴露于模拟缺 血之后3小时再灌注，细胞死亡超过80％。这些细胞的相差图像显示再灌注期间细 胞肿胀和膜不规则的证据(图像未显示)。为了检查吲哚-TEMPO衍生物的效果，在 模拟缺血之前对细胞补充不同的吲哚-TEMPO衍生物24小时，然后再灌注3小时。 细胞存活率结果示于图5。与单独的模拟I/R相比，用吲哚-TEMPO衍生物预温育 后，活细胞数显著增加。然而，与对照细胞相比，仅在再灌注期间给予吲哚-TEMPO 衍生物没有产生显著的保护(图5)。我们得出结论，这些化合物保护I/R诱导的细胞 免于死亡。

2.6线粒体氧化损伤的减轻

为了监测缺血期间线粒体中的活性氧(ROS)生成，用MitoProbe标记HUVEC细 胞。MitoProbe是一类新的荧光染料，其对线粒体O₂^-·的检测是高度敏感的。通过>2^-·水平增加～2倍。如所预测，模拟缺血后>2^-·水平升高5～6倍。这些数据突显增加的线粒体氧化应激与>2^-·水平，这可以从MitoProbe>

2.7线粒体细胞色素c释放的抑制

细胞色素c从膜间隙释放到胞液中是线粒体凋亡激活中的初始事件。因此，我 们接下来采用免疫荧光法确定吲哚-TEMPO缀合物是否可以抑制细胞色素c的释 放。在基线条件下，对细胞色素c免疫染色的HUVEC细胞显示了荧光的点状图案。 代表性的图像如图7所示。

在模拟缺血期间，未检测到显示弥漫性细胞色素c染色的细胞显著增加。在sI/R期间，线粒体O₂^-·水平显著增加，显示弥漫性荧光模式的细胞数也显著增加。这些>2^-·并将细胞色素c保留在细胞器内。如图7所示，>2^-·的过量产生促成线粒体片段化和细胞色素c释放，这些>

2.8小鼠肠缺血再灌注损伤

随后我们将注意力转向肠道损伤模式。肠缺血再灌注(I/R)损伤是成熟的全身炎症动物模型，并且可导致多器官衰竭以及严重的病态。由于吲哚-双TEMPO 9r,s的 优良的抗炎和抗氧化活性，我们试图阐明这些化合物可否进一步减轻肠I/R损伤小 鼠模型中的缺血-再灌注损伤。

2.9小肠的组织学分析

我们使用各种(苏木精和伊红(H与E))染色来评估结构改变；烟酰胺腺嘌呤二 核苷酸(NADH)心肌黄酶染色来评估组织代谢状态；以及改进的三色染色来区分细 胞与结缔组织，以估测吲哚-TEMPO类似物的组织学效应。在经受肠I/R损伤模型 的小鼠群中，我们观察到绒毛的缩短，绒毛上皮的损失和显著的粘膜嗜中性粒细胞 浸润(图8A中的顶行)。相同受试鼠中改进的三色染色显示了从绒毛上皮的剥离到明 显的淤血(图8B的顶行)的各种粘膜损伤，这在NADH染色的组织(图8C中的顶行) 中也是明显的。这些组织学异常(绒毛的缩短，裸露的绒毛，粘膜溃疡和隐窝的存在) 是肠I/R损伤的特征。用吲哚双TEMPOs(9r,s)干预会显著减轻这种组织损伤，显示 仅轻微剥离的绒毛尖端和保存良好的腺体结构(图8A-C的底行)。

肠粘膜损伤评价如下：0级，正常粘膜，1级：轻度上皮脱离；2级：中度上 皮脱离；3级：大规模上皮脱离；4级：裸露绒毛，5级：溃疡。

2.10吲哚-TEMPO缀合物(9r,s)对脂质过氧化的影响

自由基形成和炎症在肠I/R损伤中的作用促使我们研究吲哚-TEMPO缀合物在 肠缺血/再灌注损伤中的潜在有益的效果。因此，我们量化小鼠组织中的肠脂质过氧 化物(LPO)(图8D)，这揭示了LPO水平与I/R损伤的局部炎症反应严重程度之间直 接的关系。与假手术的小鼠在相同的时间点相比，在用盐水+I/R损伤处理的小鼠中， 肠组织中的LPO水平显著增加。在再灌注诱导的损伤3小时后出现412.4±63.7nmol /μg组织的最大LPO积累。相反，在灌注之前和连续灌注期间施用TEMPOL或9r,s， 导致在所有测试时间点LPO的显著减少(图8D)。细胞膜磷脂在I/R损伤期间也易于 过氧化，导致LPO产生。我们的研究提示，在再灌注之前和期间给以TEMPOL或 9r,s干预，可能导致大大减少LPO在肠中产生，这表明9r,s的保护性能至少部分 是源于其自由基清除能力。此外，肠I/R损伤通过刺激炎症细胞因子和趋化因子的 产生而促进炎症反应。

2.11吲哚-TEMPO缀合物(9r,s)对血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)浓度的作用

由于TNF-α是一个由缺血/再灌注诱导的局部和远程器官损伤的关键介质，我 们接下来评估其水平(图8E)。在再灌注完成时，经受肠I/R损伤的小鼠组中血清 TNF-α水平显著增加(62.9±8.7pg/mL对比8.7±2.3pg/mL(假手术组，p<0.01)。该效应 因采用TEMPOL(25.2±5.2pg/mL)，9r(21.7±4.7pg/mL)或9s(19.0±3.8pg/mL)而减轻(在 所有的情况下p<0.01)。

2.12肾组织的组织学分析

肠I/R损伤诱导在近端小管中空泡化的严重肾小管坏死(图9A-C)，包括肾小管 扩张和坏死，管状结构的解体，以及刷毛边界的损失导致的管腔淤血。在相同组织 中的改进的三色染色显示伴随血管系统红细胞浸润的，间质组织中的肾小管水肿， 细胞浸润和基质扩增(图9B)。此外，在取自肠I/R鼠群的NADH染色组织中观察到 Bowman's胶囊中的破裂(图9C)。在肾组织中，在没有干预的情况下，用吲哚-双 TEMPO(9r,s)给药显著减少肾小管坏死。大多数肾小管是完整的，具有正常的刷状 缘。总体而言，肾组织中的组织学变化相当温和，尽管在施用吲哚-双TEMPOs(9r,s) 的动物组中可以时有时无地看到近端小管的肾小管扩张和空泡化。用改良的三色染 色评价胶原纤维显示，与I/R损伤相关的肾小管周围胶原的广泛损失被吲哚-双 TEMPO(9r,s)减弱。盐水组肾脏的平均组织学评分为8.5±2.5，显著高于假手术组 (0.60±0.2，p<0.001)，而吲哚-双TEMPO缀合物的平均组织学评分(9r,s)显著降低 (4.3±1.7，p<0.01)。

基于肾小管损伤的严重程度，包括细胞肿胀，空泡化，肾小管坏死，肾小管内 铸形成，管状扩张和刷状缘的丧失，肾损伤分级如下：0级：正常组织学；1-2级： 轻度损伤；3～4级：中度损伤；5～6级：严重伤害。

2.12吲哚-双TEMPOs(9r,s)对血尿素氮(BUN)和肌酐(Cr)的影响

我们通过定量血尿素氮(BUN)和肌酐(Cr)间接评估吲哚-双TEMPOs对肾功能的 影响。在再灌注后3小时，经受I/R损伤的小鼠组中BUN水平显著增加(图9D)。 在吲哚-双TEMPOs(9r,s)处理的动物组中，BUN也在再灌注后3小时增加并达到峰 值，但是绝对BUN水平显著低于经受I/R损伤的动物组中观察到的水平(p<0.01)。 血清Cr水平也观察到可比的结果(图9E)。

2.13肝组织的组织学分析

在肝组织中，肠I/R损伤后的组织学改变包括水肿，肝细胞空泡化和炎症浸润。 染色切片的仔细检查显示严重的窦性充血，出血，变粗的中央静脉，内皮下水肿和 带有核周空泡化的变性肝细胞。用吲哚-双TEMPOs(9r,s)干预减轻这种损害，显示 只有轻微的窦性扩张和中央静脉变粗，而大多数肝细胞看起来正常。盐水组小鼠肝 脏的组织学评分显著大于假手术组(p<0.001)，吲哚-双TEMPOs(9r,s)的给药显著降 低与肠I/R相关的组织学评分的增加。虽然肝细胞变化仍然可见，我们发现吲哚-双 TEMPOs干预下有清楚和一致的组织学改进(图10A-C)。

将肝组织损伤的严重程度分级如下：0级：正常组织学；1级：轻度损伤，包 括细胞质空泡化至局灶性核固缩；2级：中度至重度损伤，具有广泛的核固缩，细 胞质嗜酸性粒细胞增多和细胞间边界丧失；3级：严重坏死，伴有肝细胞索破碎， 出血和嗜中性粒细胞浸润。

2.14吲哚-双TEMPOs(9r,s)对肝酶(丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST))血清水平的影响

与假手术小鼠相比，肠I/R损伤导致血清ALT和AST水平的显著升高，与肝 细胞损伤一致。在所测试的所有时间点，用选择的吲哚-双TEMPO(9r,s)干预显著减 轻了对血清肝酶的这种影响(图10D和E)。

2.15肺组织的组织学分析

将我们的评价从肾和肠组织转移到肺组织，我们发现I/R损伤导致固有层的崩溃，出血，间质细胞性和肺结构破坏的加重(图11A-C)，伴随着在肺泡空间的细胞 浸润。我们发现在肺毛细血管和间质组织中间质增厚和嗜中性粒细胞浸润在以9s 干预后得到显著改善。虽然从I/R组和吲哚-双TEMPOs(9r,s)组经对肺作NADH染 色都显示阳性，但药物治疗组中的差异染色结果显著降低，这表明经吲哚-双 TEMPOs(9r,s)干预，组织存活力有了改善。

肺损伤分级如下：0级：诊断无变化；1级：轻度至中度间质充血；2级：中度 血管周围水肿形成和肺结构的部分损伤；3级：肺的结构完全破坏。

3、讨论

活性氧(ROS)的过度产生会促进急性炎症。在炎症部位，增加的自由基产生与 嗜中性粒细胞NADPH氧化酶的激活和/或各种氧化还原系统的解偶联有关。通过增 强自由基清除能力改善细胞内反应可以促进ROS和抗氧化防御系统之间的平衡的 维持。在本研究中，吲哚衍生物7a-s与氮氧化物部分的结合增强了吲哚-TEMPO缀 合物(9a-s)的抗炎作用。我们进一步确定吲哚-TEMPO缀合物9f，i，j，p，r，s能够 显著减弱二甲苯诱导小鼠的耳炎症，证实其潜在的抗炎活性(图1)。这些化合物还可 以显著抑制由二甲苯诱导升高了的MPO活性。有报道称，发炎组织中MPO活性增 加和嗜中性粒细胞积累之间有直接联系。因此，我们提出这些吲哚-TEMPO缀合物 的抗炎活性或涉及嗜中性粒细胞浸润的抑制和白细胞运动的减少。在炎症部位，增 加的自由基活性与嗜中性粒细胞NADPH氧化酶的活化和/或各种氧化还原系统的解 偶联有关。炎症通常导致抗氧化防御系统的损伤。因此，我们进一步假设新合成的 吲哚-TEMPO缀合物对抗炎活性的改善可与氮氧化物部分的自由基清除能力相关。

据报道，TEMPOL可通过抑制过渡金属铁的催化作用清除细胞内超氧化物阴离 子并防止形成羟基自由基。NSAIDs诱导的血小板功能失调的临床效应包括出血增 加，持久的手术出血和患者出现严重或危及生命的出血风险加大。为了开发更安全 的抗炎剂，评估我们的新型吲哚-TEMPO缀合物在正常的止血过程中是否存在会导 致倾向于出血并发症的有害影响是要紧的。在所有测试时间点，用高剂量 (0.50mmol/kg)的我们的新抗炎药(9a-s)治疗并没有显著延长小鼠的出血时间(表1)。 显然，这些新合成的吲哚-TEMPO缀合物相与对照药物阿司匹林比较表现出良好的 药理学特征。

考虑到化合物(9r,s)广泛的抗炎和抗氧化活性，我们随后表征了挑选出来的吲哚-TEMPOL化合物品种(9r,s)在肠I/R损伤动物模型中的作用，综合评估了肠，肝肾， 血液和抗氧化防御系统(表3)。I/R损伤诱导的肠的广泛损伤，其特征在于普遍的肠 粘膜组织学损伤的标志，裸露绒毛，固有层崩解，存在暴露的毛细血管以及中性粒 细胞/巨噬细胞的浸润(图10A-C)。施用化合物9r,s显著减轻了这种损伤。源自I/R 损伤组中的动物的肾组织表现出广泛的肾小管坏死，加上与近端小管中的空泡化以 及肾小管内铸形成。这些组织学变化包括管状结构变性，尿小管扩张，蛋白质碎片， 肿胀，坏死与腔内淤血，所有症状伴随有刷状缘的损失(图11A-C)。此外，在I/R后 1.5,3和12小时，施用TEMPOL或9r，显著减弱I/R损伤引起的血尿素氮的升高。

在肝组织中，I/R损伤导致严重的窦性充血和出血，伴有具有核周空泡化的增 大的肝细胞(图10A-C)。肝组织的组织学分析显示I/R处理组中的细胞死亡和炎症浸 润，用化合物9r,s处理后再一次得到减轻。此外，关于肝组织，我们发现AST和 ALT的水平在I/R损伤后1.5,3和12小时施用TEMPOL或9r,s后正常化。

肺组织的组织学分析显示I/R组的小鼠中的严重肺泡萎缩，肺泡内出血和肺泡 几何形状的变坏。这些组织学变化在9r,s+I/R组中少得多。我们发现吲哚-双 TEMPOs 9r,s显著减轻急性肺损伤的严重性，并抑制肠I/R损伤后肺部的细胞凋亡。

表3.吲哚-双TEMPOs(9r,s)干预在经受肠缺血/再灌注损伤的小鼠中造成的不同效 果

系统测量的结果吲哚-双TEMPOs肠结构,形态,LPO++(改良)肝结构,形态,AST,ALT++(改良)肾结构,形态,BUN,Cr++(改良)肺结构,形态++(改良)抗氧化防御LPO,TNF-,细胞因子,自由基+++(改良)

将我们的注意力转向抗氧化防御，我们发现在经受I/R损伤的小鼠的肠组织中 的LPO显著增加，而施用TEMPOL或吲哚-双TEMPO(9r,s)显著改善了这一变化(表 3)，这最有可能通过自由基清除导致。当我们评价炎症细胞因子和趋化因子的产生 时，发现了相似的结果。我们的研究结果表明由I/R损伤诱导的炎症损伤表现为全 身性，因为TNF-α(参与I/R损伤的主要炎症介质)的急剧增加通过施用TEMPOL或 吲哚-双TEMPO(9r,s)得到了改善。

在吲哚-TEMPO缀合物在I/R细胞模型中的抗氧化活性的研究中，我们发现模 拟的I/R诱导的细胞死亡可以被这些化合物减弱。并且，这些化合物可以显著减弱 线粒体氧化损伤。此外，这些化合物可以显著减少由模拟I/R产生的线粒体细胞色 素c释放。然而，我们还没有阐明这些化合物减少线粒体细胞色素c释放到胞液中 的确切机制。吲哚TEMPO缀合物的自由基清除活性可通过抑制线粒体ROS产生而 有助于这种保护作用。所提出的吲哚-TEMPO缀合物与细胞色素c相互作用的机制 显示在图12中。另一种可能性是这些化合物可以修饰Bcl-2家族成员蛋白表达或功 能，来负责保持线粒体膜完整性。

在我们目前的研究中，小鼠用吲哚-TEMPO小鼠治疗，在再灌注前5分钟接受 吲哚-TEMPO的推注，然后在整个再灌注期间接受吲哚TEMPO的连续输注。在类 似的研究中，在缺血期之前总是施用治疗性处理。我们的治疗策略可能适合于发生 胃肠道并发症的高风险的患者。特别是对于经历腹主动脉手术和心脏手术的患者可 以考虑这种治疗选择。目前，我们不知道吲哚-TEMPO缀合物在再灌注后应用时是 否仍然保护。由于促炎因子在肠缺血再灌注期间发挥重要作用，所以吲哚-TEMPO 缀合物的双重功能(抗氧化剂和抗炎活性以及局部和远端器官的改善)应该能够通过 施用即使在损伤后缓解再灌注损伤。在我们目前的研究中，应用I/R的严重模型来 模拟急性肠系膜I/R的临床上的并发症。

可以合理地预测，在连续输注低剂量的吲哚-TEMPO时，在某些临床适应症(即 在不太严重的缺血性损伤下)将获得更好的保护。

以上实施例只为说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离 本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属 于本发明的范围。