甘氨酸-氮氧自由基缀合物对缺血再灌注损伤的保护作用及其内在机制的研究

摘要

缺血再灌注损伤（Ischemic reperfusion injury,I/R）是临床上缺血性外伤和疾病所面临的一个重要威胁。针对缺血再灌注损伤，开发出有效的预防和治疗药物具有实际意义。目前普遍的观点认为缺血再灌注损伤的机理主要与过量氧自由基的产生、中性粒细胞介导的炎症和钙超载等因素相关。目前针对这些不同的机制均研发出了一些行之有效的药物，但是在临床上的效果都不甚理想。本课题从综合的观点出发，将具有抗氧化作用的氮氧自由基和具有抗炎症作用的甘氨酸缀合起来形成甘氨酸-氮氧自由基缀合物（GNN缀合物），通过大鼠双后肢缺血再灌注模型和肾缺血再灌注模型观察其对原位缺血组织和远端器官的保护作用，并通过建立体外脐静脉内皮细胞缺氧复氧模型来探讨起内在的分子机制。
　　第一部分：甘氨酸-氮氧自由基缀合物联合缺血后处理对大鼠双后肢缺血再灌注损伤的治疗作用
　　目的：
　　本部分实验通过对缺血组织后处理联合静脉注射GNN缀合物的方式来共同应对大鼠双后肢缺血再灌注损伤，进而在体内层面评估GNN缀合物联合缺血后处理在急性双后肢缺血再灌注损伤大鼠模型中对多器官损伤的治疗作用。
　　方法：
　　大鼠按随机原则分为五组：
　　（1）假手术组（6只）：该组进行常规的麻醉后，不予以缺血再灌注处理，7h后同其他组一起处理动物；
　　（2）缺血再灌注组（8只）：缺血3 h后，恢复供血4 h后处理动物；
　　（3）单纯缺血后处理组（8只）：缺血3 h，于终止缺血前15 min静脉注射PBS，终止缺血后，以2 min间隔反复阻断并恢复供血四个循环，然后恢复血供，4 h后处理动物；
　　（4）GNN干预组（8只）：缺血3 h，于恢复灌注前15 min以10mg/kg/min静脉注射GNN，然后恢复血供，4 h后处理动物；
　　（5）GNN合并缺血后处理组（8只）：缺血3 h，于恢复灌注前15 min静脉注射GNN，剂量同前，松解阻断后，以2 min间隔反复阻断并恢复供血四个循环，然后恢复血供，4 h后处理动物。
　　缺血再灌注处理方式：术前大鼠进行常规禁食12 h，仅给予饮水自由。使用戊巴比妥钠（40 mg/kg）行腹腔注射麻醉，电热毯维持体温于37℃，用止血带包扎大鼠双侧后肢根部，使后肢缺血3h后，撤除止血带，实现再灌注4h。各组恢复供血4h后，分别股静脉取血，分离血清，进行丙二醛（Malondialdehyde，MDA）、组织髓过氧化物酶（myeloperoxidase， MPO）活性、血清丙氨酸转氨酶（ALT），天冬氨酸转氨酶（AST），血尿素氮（BUN）及血肌酐（Cr）含量的测定；ELISA技术检测血清中肿瘤坏死因子α（TNF-α）水平；处死动物，分别收集肌肉、肺、肝、肾组织，分别进行肌肉和肺组织的湿重/干重（W/D）比例的测定；流式细胞术检测肌肉、肝、肾组织的细胞凋亡情况；部分肺组织匀浆，检测 MDA和MPO水平或活性。
　　结果：
　　1.GNN在体内后肢缺血再灌注模型中对各脏器细胞凋亡的保护作用:流式检测结果表明在大鼠后肢缺血再灌注模型的基础上，使用GNN干预后，肾脏和肌肉细胞的凋亡状况得到明显改善。
　　2.组织水肿程度:与假手术组相比（肌肉：4.02±0.26；肺：3.66±0.32），缺血再灌注发生后，肌肉和肺组织的W/D比值（肌肉：6.07±0.37；肺：5.73±0.38）均有所升高。单纯缺血后处理虽然可以一定程度上缓解肌肉和肺组织水肿（肌肉：5.42±0.41；肺：5.01±0.39），但是不具有统计学意义。而单一GNN治疗组（肌肉：4.86±0.38；肺：4.50±0.27）及GNN合并缺血后处理治疗组（肌肉：4.45±0.39；肺：4.02±0.34）均可以缓解水肿情况，且联合处理的效果更明显。
　　3.血清及肺组织匀浆MDA水平：缺血再灌注损伤过程中，血清（3.45±0.44 nmol/ml）及肺组织（84.50±3.70 nmol/g）中MDA的水平明显高于假手术组（血清：1.67±0.13 nmol/ml；肺组织：41.80±3.20 nmol/g）。但是单纯缺血后处理无法降低MDA水平（血清：2.96±0.57 nmol/ml；肺组织：70.40±4.20 nmol/g）。单纯GNN治疗（血清:2.28±0.38 nmol/ml；肺组织：60.30±3.50 nmol/g）与GNN联合缺血后处理组（血清:1.89±0.20 nmol/ml；肺组织：52.70±4.90 nmol/g）均可明显抑制MDA产生，且GNN联合缺血后处理组的效果更加明显。
　　4.组织氧化应激损伤的指标—MPO活性检测结果：缺血再灌注组大鼠肺组织MPO水平（19.30±1.91 U/g）显著高于假手术组大鼠（8.02±0.62 U/g）。单纯GNN治疗组大鼠（10.41±1.20 U/g）及GNN合并缺血后处理治疗组大鼠（9.33±1.31 U/g）较缺血再灌注损伤大鼠MPO活性明显降低，后者更加显著。
　　5.TNF-α检测结果：缺血再灌注组大鼠血清中TNF-α表达水平（130.62±5.71 pg/ml）显著高于假手术组（51.22±6.90pg/ml）。单纯GNN治疗组（85.81±9.12 pg/ml）及GNN合并缺血后处理治疗组（72.20±9.51 pg/ml）较缺血再灌注组的炎性细胞因子水平均显著下降。GNN合并缺血后处理虽然比单纯GNN治疗组TNF-α的表达水平低，但是它们之间没有统计学差异。
　　6.GNN联合缺血后处理能够改善大鼠的肝肾功能：缺血再灌注组大鼠血清AST及ALT（AST:63.60±13.41μM;ALT:110.41±43.92μM）水平显著高于假手术组大鼠（AST:147.31±21.30μM;ALT:302.32±54.30μM）；单纯GNN干预组大鼠（AST:92.21±23.62μM;ALT:203.90±43.92μM）及GNN合并缺血后处理（AST:78.74±16.81μM;ALT:177.32±33.61μM）均可有效降低 ALT及AST的水平，且联合处理组的效果显著优于单一的GNN干预组。缺血再灌注组（BUN:14.20±2.12 mM;Cr:62.31±2.43 mM）与假手术组（BUN:7.33±1.90 mM;Cr:34.92±2.51 mM）相比，血清BUN水平和Cr水平显著升高；单一GNN干预（BUN:9.91±2.52 mM;Cr:45.32±2.11 mM）及GNN合并缺血后处理治疗（BUN:8.73±1.60 mM;Cr:40.91±1.82 mM），均可显著降低血清BUN和Cr水平。
　　第二部分：甘氨酸-氮氧自由基缀合物干预对大鼠肾缺血再灌注损伤的保护作用
　　目的：
　　本部分实验旨在利用大鼠肾缺血再灌注模型研究GNN缀合物干预对肾I/R损伤的保护作用，以确定GNN缀合物在I/R损伤干预治疗中的有效性。
　　方法：
　　选取健康洁净级Wistar大鼠16只（雄性,月龄4月，体重250～300g），随机分为三组。
　　（1）假手术组（4只）：该组动物仅进行常规麻醉，不予以缺血再灌注处理；
　　（2）肾缺血再灌注组（6只）：动脉夹完全阻断肾脏血流1 h后恢复血供，3h后处理动物；
　　（3）缺血再灌注+GNN治疗组（6只）:动脉夹完全阻断肾脏血流1 h，在恢复血供前15 min以30 mg/kg的量腹腔注射GNN缀合物，恢复血供3 h后处理动物；收集血清，检测尿素氮水平；收集部分肾组织，分别检测MDA、GSH水平及MPO活性；部分肾组织制备冰冻切片，HE染色观察肾组织的形态变化。
　　结果：
　　1.GNN缀合物可减弱肾组织因缺血再灌注带来的脂质过氧化反应：大鼠肾缺血再灌注损伤过程中，肾组织中 MDA的水平（72.11±4.11 nmol/g）明显高于假手术组（31.42±2.80 nmol/g）。GNN干预（36.51±2.42 nmol/g）后显著抑制MDA的产生。
　　2.GNN可以有效地维持自由基清除剂GSH的水平：缺血再灌注导致肾组织内的GSH水平明显降低（Sham假手术组：1.50±0.30μmol/g，缺血再灌注组：0.81±0.20μmol/g），GNN干预可以恢复GSH的含量（1.41±0.11μmol/g）。
　　3.GNN可有效降低缺血再灌注肾组织中MPO活性：肾缺血再灌注组大鼠肾组织MPO水平（15.21±0.82 U/g）显著高于假手术组大鼠（4.63±0.73 U/g），而GNN缀合物干预后MPO活性明显降低（5.71±0.52 U/g）。
　　4.GNN可有效改善缺血再灌注大鼠肾功能和肾组织损伤：肾缺血再灌注损伤组大鼠血清BUN水平（50.91±4.21 mg/dl）显著高于假手术组大鼠（14.52±2.30 mg/dl），；GNN缀合物干预可有效降低BUN水平（17.51±3.51 mg/dl）。
　　HE染色结果显示，缺血再灌注组的肾脏与假手术组相比较，发生严重的肾小管坏死和肾小球损伤。而缺血再灌注损伤+GNN治疗组的肾脏组织的损伤明显减轻。
　　第三部分甘氨酸-氮氧自由基缀合物对血管内皮细胞HUVEC缺氧复氧损伤的保护作用及内在机制的研究
　　目的：
　　为了系统性研究GNN缀合物对缺血再灌注损伤调节作用的内在细胞和分子机制，本部分通过体外实验检测该缀合物对人脐静脉内皮细胞（Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs）缺氧复氧过程中细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡、细胞自噬和线粒体形态与功能的调节作用，为后期分子信号通路的研究提供了实验基础。
　　方法：
　　1.HUVECs的分离与培养：取健康产妇正常足月分娩婴儿的脐带（15 cm），用I型胶原酶分离收集HUVECs，种于100μg/ml层黏连蛋白预包被的培养瓶中培养，VIII因子相关抗原鉴定为阳性。
　　2.构建体外的缺氧复氧模型：取3-6代的HUVEC细胞，分为正常对照组、缺氧复氧组（T8R4）、缺氧复氧联合GNN2μg/ml处理组（T8R4+D2）和缺氧复氧联合GNN5μg/ml处理组（T8R4+D5）。MTT、SRB实验检测细胞增殖情况，流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡的改变，激光共聚焦显微镜结合免疫荧光技术检测JC-1、细胞色素c（Cytochrome c）和自噬相关蛋白LC3在细胞内的分布，qPCR和Western blot方法检测细胞周期、凋亡和线粒体相关基因的变化，透射电镜观察细胞线粒体形态的变化。
　　结果：
　　1.甘氨酸-氮氧自由基缀合物可以恢复缺氧复氧对 HUVEC细胞增殖能力的抑制作用:缺氧复氧处理可以显著抑制HUVEC细胞的增殖水平，但当GNN缀合物干预缺氧复氧模型时，HUVEC细胞的增殖水平增加。
　　2.GNN缀合物无法逆转缺氧复氧对HUVEC细胞周期的抑制:与对照组相比，缺氧复氧可以明显地抑制细胞周期的进程，即G1期的比例显著增高，而S期+G2/M期的比例显著减少。但是当在缺氧复氧的基础上，用不同浓度的GNN缀合物干预，细胞周期并没有得到明显的改善。同时，缺氧复氧处理后，CCNB1、CCND1、CCNE1受到明显抑制，而p53的表达没有变化；当在缺氧复氧的基础上，用不同浓度的GNN缀合物处理细胞后，CCNB1、CCND1、CCNE1在mRNA水平和蛋白水平的表达并没有改变。
　　3.GNN缀合物显著缓解缺氧复氧对HUVEC细胞凋亡的促进作用，上调BCL2表达，降低Bax和BAD表达：与对照组相比，缺氧复氧可以明显地促进细胞凋亡的发生，包括细胞的早期凋亡和晚期凋亡。但是当在缺氧复氧的基础上，用不同浓度的GNN缀合物在复氧阶段前干预细胞，细胞凋亡率明显减少。
　　qPCR和Western blot结果显示，在缺氧复氧处理后，促凋亡基因Bax、BAD的表达明显升高，而抗凋亡基因BCL2的表达显著下调。GNN缀合物后，Bax和BAD升高明显受到抑制，而BCL2的表达出现回调（Fig.3C-3D）。而p53的表达水平无论是在mRNA水平还是在蛋白水平均未发生变化。
　　4.GNN缀合物能够恢复缺氧复氧对HUVEC细胞线粒体形态与功能的损伤：
　　1）与对照组相比，缺氧复氧可以明显地促进细胞线粒体膜电位的降低，JC-1绿色荧光的增多，但是缺氧复氧联合GNN缀合物处理后，JC-1绿色荧光明显减少。
　　2）Confocal检测了不同处理组细胞中细胞色素c的分布情况，结果显示，在正常的HUVEC细胞中，Cytochrome c染色集中在线粒体，而在缺氧复氧处理后，Cytochrome c则呈弥散分布。但是缺氧复氧联合GNN缀合物处理后，部分Cytochrome c又出现线粒体聚集。
　　3）qPCR结果显示，与正常对照相比，缺氧复氧处理后，DRP1的表达明显升高，而MFN1、MFN2和OPA1的表达明显降低，而联合GNN缀合物处理后，DRP1的升高受到明显抑制，而MFN1、MFN2和OPA1的表达得到恢复。
　　4）透射电镜结果显示，缺氧复氧会造成线粒体的非正常断裂，而联合GNN缀合物处理可以明显改善线粒体的断裂情况。
　　5.GNN缀合物明显抑制缺氧复氧造成HUVEC细胞自噬的发生：与正常对照组相比，缺氧复氧可以明显地促进细胞自噬的发生，LC3呈斑点状聚集，但是GNN缀合物干预后，LC-3呈弥散。
　　结论：
　　1.在体内，分别利用了双后肢缺血再灌注和肾脏缺血再灌注两个模型证明了GNN的保护作用。一方面，GNN可以清除机体内过量的自由基，减轻脂质过氧化反应，另一方面，GNN可以有效地减轻炎症反应，缓解缺血再灌注造成的局部和远端脏器损伤。该结果不但证明了多种细胞行为参与了GNN缀合物的保护作用，还证明了GNN缀合物在各种器官缺血再灌注损伤中的普适性，同时能够保护缺血再灌注损伤引发的多器官损伤。
　　2.GNN缀合物在体外具有显著的抗缺氧复氧所引起的HUVEC细胞的凋亡、线粒体功能丧失和自噬的发生。

目录

声明

英文缩写

引言

第一部分甘氨酸-氮氧自由基缀合物联合缺血后处理对大鼠双后肢缺血再灌注损伤的治疗作用

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

第二部分甘氨酸-氮氧自由基缀合物干预对大鼠肾缺血再灌注损伤的保护作用

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

第三部分甘氨酸-氮氧自由基缀合物对血管内皮细胞HUVEC缺氧复氧损伤的保护作用及内在机制的研究

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

结论

综述一:组织缺血再灌注损伤的临床症状与发生机制

综述二:药物干预在缺血再灌注损伤预防和治疗中的研究进展

致谢

个人简历