法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2020-02-07
授权
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2017-12-22
实质审查的生效 IPC(主分类):G01N30/02 申请日:20170705
实质审查的生效
2017-11-28
公开
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技术领域
本发明涉及一种中成药的检测方法，具体涉及康媛颗粒指纹图谱的检测方法。
背景技术
指纹图谱是指某些复杂物质，比如中药，某种生物体或某种组织或细胞的 DNA，蛋白质经适当处理后，采用一定的分析手段，得到的能够标示其化学特征的色谱图或光谱图。中药指纹图谱是一种综合的，可量化的鉴定手段，它是建立在中药化学成分系统研究的基础上，主要用于评价中药材以及中药制剂质量的真实性、优良性和稳定性。中药及其制剂均为多组分复杂体系，因此评价其质量应采用与之相适应的，能提供丰富鉴别信息的检测方法，建立中药指纹图谱将能较为全面地反映中药及其制剂中所含化学成分的种类与数量，进而对药品质量进行整体描述和评价。
康媛颗粒是由黄芪、当归、白芍、枸杞子、香附(制)、柴胡、茯苓、续断、白术(炒)、陈皮、甘草制成的复方制剂(国药准字Z32020996)具有疏肝解郁，理气止痛，养血调经。用于经前期紧张综合症及原发性痛经，经前乳房胀痛，经来小腹疼痛。该制剂药材种类多，活性成分复杂，个别成分的定性定量分析难以全面反应药品的全面信息，为更有效地控制康媛颗粒的质量，本发明针对康媛颗粒药效成分建立了制剂的指纹图谱，对全面客观评价康媛颗粒的质量具有重要的意义。
发明内容
发明目的：本发明的目的是解决现有技术的不足，提供一种康媛颗粒的指纹图谱检测方法，该检测方法可以客观、全面、准确的评价康媛颗粒的质量，对控制康媛颗粒的质量和保证临床疗效具有重要意义。
技术方案：为了实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
一种康媛颗粒指纹图谱的检测方法，包括以下步骤：
步骤1、康媛颗粒供试品溶液的制备：
取不同批次的康媛颗粒，精密称定，置锥形瓶中，精密吸取石油醚溶液，超声脱脂，滤过后取滤渣加入甲醇溶液，称重，超声提取，冷却后称定重量，差异重量用甲醇溶液补足，取续滤液，得供试品溶液；
步骤2、对照品溶液的制备：
精密称定芍药苷对照品、阿魏酸对照品、甘草苷对照品和橙皮苷对照品，分置于不同的容量瓶中，加入甲醇溶液溶解并定容至刻度线，分别得到芍药苷对照品溶液、阿魏酸对照品溶液、甘草苷对照品溶液和橙皮苷对照品溶液；
步骤3、分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液，注入高效液相色谱仪，记录色谱图；
步骤4，将步骤3中获得的康媛颗粒供试品溶液的指纹图谱导出，并导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统；选择不同批次康媛颗粒的色谱图中均存在的色谱峰作为共有峰；用平均值计算法生成康媛颗粒的对照指纹图谱，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积；并根据对照品溶液色谱图的保留时间标注对照指纹图谱中峰的化学成分。
作为优选方案，以上所述的康媛颗粒指纹图谱的检测方法，步骤1康媛颗粒供试品溶液制备方法为：取10批次的康媛颗粒各17.0g，精密称定，置100mL 锥形瓶中，精密吸取20mL石油醚溶液，超声30min脱脂，滤过后取滤渣加入甲醇溶液20mL，称重，超声提取30min，冷却后称定重量，差异重量用甲醇溶液补足，取续滤液，得供试品溶液。
作为优选方案，以上所述的康媛颗粒指纹图谱的检测方法，步骤2对照品溶液的制备：取一定量的芍药苷对照品、阿魏酸对照品、甘草苷对照品、橙皮苷对照品，精密称定，分别置于不同的容量瓶中，加入甲醇溶液溶解并定容至刻度线，分别制得浓度为0.2064mg/mL芍药苷对照品溶液、0.1242mg/mL阿魏酸对照品溶液、0.2695mg/mL甘草苷对照品溶液和0.1026mg/mL的橙皮苷对照品溶液。
作为优选方案，以上所述的康媛颗粒指纹图谱的检测方法，步骤3中，液相色谱条件为：色谱柱：色谱柱为YMC-Pack-ODS-A的C18色谱柱；流动相A为 0.05％磷酸水溶液，流动相B为乙腈，梯度洗脱，程序为0-10min，5％-10％B； 10-20min，10％-15％B；20-40min，15％-21％B；40-60min，21％-25％B；60-80 min，25％-30％B；检测波长：230nm；柱温：30℃；流速：0.6mL/min；进样量：10μL。
作为优选方案，以上所述的康媛颗粒指纹图谱的检测方法，指纹图谱中选择9个共有峰作为康媛颗粒指纹图谱的特征峰，以这9个特征峰的峰面积作为质量评价的变量指标，9个共有峰中芍药苷为6号峰，保留时间为42.167分钟、阿魏酸为7号峰，保留时间为49.589分钟、甘草苷为8号峰，保留时间为50.586 分钟、橙皮苷为9号峰，保留时间为62.633分钟。
有益效果：
1、本发明根据康媛颗粒中所含的活性成分，包括皂苷类、有机酸和黄酮类等化合物的结构性质特点，通过大量实验筛选出最佳的流动相组成，梯度洗脱程序、流速，检测波长、色谱柱，柱温等分析条件，经多次实验验证表明，本发明提供的康媛颗粒指纹图谱检测方法，可以全面、客观、准确的检测和评价康媛颗粒的质量，为保证临床疗效具有重要意义。
2、用本发明所提供的方法所建立的康媛颗粒指纹图谱，能有效地表征康媛颗粒片的质量，能客观体现各个构成指纹特征峰的前后顺序和相互关系，注重整体面貌特征，既可避免因测定个别化学成分而判定康媛颗粒质量的片面性，又可减少为质量达标而人为处理的可能性。
3、本发明提供的康媛颗粒指纹图谱的检测方法，具有方法简便、稳定性好、精密度高、重现性好等优点。
附图说明
图1为本发明所述的康媛颗粒的对照指纹图谱。
图2为本发明所述的康媛颗粒的10批次供试品指纹图谱。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例用到的仪器与试剂如下：
1.实验材料与仪器设备
1.1样品：本实验共收集了10批康媛颗粒样品，分别来自南京海昌中药集团(H1、H2、H3、H4、H5)和黑龙江济仁药业有限公司(J6、J7、J8、J9、 J10)。
1.2试剂与试药
对照品：芍药苷(批号：170109)、阿魏酸(批号：161204)、甘草苷(批号:161216)、橙皮苷(批号:161230)全部购于南京森贝伽生物科技有限公司。
试剂：石油醚(南京化学试剂有限公司)、分析甲醇(南京化学试剂有限公司)、磷酸(南京化学试剂有限公司)；色谱乙腈(美国天地公司)；自制双蒸水。
1.3实验仪器设备
Shimadzu LC-20AB高效液相色谱系统(日本岛津公司，包括在线脱气机、自动进样器、二极管阵列检测器、柱温箱)。BP121S电子分析天平 (SARTORIUS)；KQ5200DB型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。
实施例1一种康媛颗粒指纹图谱的检测方法，包括以下步骤：
步骤1、康媛颗粒供试品溶液的制备：
取以上10批康媛颗粒各17.0g，精密称定，置100mL锥形瓶中，精密吸取 20mL石油醚溶液，超声30min脱脂，滤过后加入甲醇溶液20mL，称重，超声提取30min，冷却后称定重量，差异重量用甲醇溶液补足，取续滤液即可得。
步骤2、参照峰溶液的制备：
取一定量的芍药苷对照品、阿魏酸对照品、甘草苷对照品、橙皮苷对照品，精密称定，分别置于不同的容量瓶中，加入甲醇溶液溶解并定容至刻度线，分别制得浓度为0.2064mg/mL芍药苷对照品溶液、0.1242mg/mL阿魏酸对照品溶液、0.2695mg/mL甘草苷对照品溶液和0.1026mg/mL的橙皮苷对照品溶液；
步骤3、分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液，注入高效液相色谱仪，记录色谱图；色谱条件为：色谱柱：色谱柱采用YMC-Pack-ODS-AC18(250mm×4.6 mm,5μm)；流动相A(0.05％磷酸水溶液)-B(乙腈)，梯度洗脱，程序为0-10min， 5％-10％B；10-20min，10％-15％B；20-40min，15％-21％B；40-60min，21％-25％ B；60-80min，25％-30％B；检测波长：230nm；柱温：30℃；流速：0.6mL/min；进样量：10μL。
步骤4，将步骤3中获得的康媛颗粒供试品溶液的指纹图谱导出，并导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统；选择不同批次康媛颗粒的色谱图中均存在的色谱峰作为共有峰；用平均值计算法生成康媛颗粒的对照指纹图谱，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积；在康媛颗粒的指纹图谱上选择了9个共有峰作为康媛颗粒指纹图谱的特征峰，以这9个特征峰的峰面积作为质量评价的变量指标。同时，采用对照品对照法对指纹图谱中主要特征峰进行标定，结果4个特征峰被鉴定，分别为芍药苷、阿魏酸、甘草苷、橙皮苷，色谱图见图1。因为康媛颗粒色谱图中显示，芍药苷含量较高，故将芍药苷作为康媛颗粒的参比峰(S)。以S峰的保留时间和峰面积为1，将其它各特征峰的保留时间和峰面积与同一图谱中S峰的保留时间和峰面积作比值，计算其他各特征峰的相对保留时间和相对峰面积值，结果见表1和表2。
表1康媛颗粒共有峰相对保留时间
表2康媛颗粒共有峰相对峰面积
将10个批次的康媛颗粒的HPLC数据导出为AIA格式，导入国家药典委员会“中药指纹图谱相似度评价系统2004版”，生成标准指纹图谱，并选择9个色谱峰为特征峰，进行指纹图谱相似度评价。10个样品的指纹图谱共有模式见图2，相似度评价结果见表3。根据指纹图谱相似度评价结果显示，不同批次的康媛颗粒具有一定的差异，研究结果显示，指纹图谱相似度分析可以用于区分不同批次的康媛颗粒，可以用于康媛颗粒的质量控制。
表3不同批次康媛颗粒指纹图谱相似度
方法学考察
1、精密度试验
精密吸取实施例1下的对照品溶液，按实施例1下色谱条件连续进样6次，其主要共有峰相对保留时间的RSD均小于0.35％；相对峰面积RSD均小于 1.99％，表明仪器的精密度良好。具体实验结果见表4和表5。
表4相对保留时间
表5相对峰面积
2、稳定性试验
取同一供试品溶液，分别在0h、2h、4h、8h、12h、24h进样进行测定，其主要共有峰相对保留时间的RSD均小于0.89％；相对峰面积RSD均小于2.76％，结果表明：供试品溶液在24h内稳定。具体实验结果见表6和表7。
表6相对保留时间
表7相对峰面积
3、重复性试验
精密称取同一批样品17.0g，共6份，按照实施例1下方法制备供试品溶液，以实施例1下的色谱条件进样。其主要共有峰相对保留时间的RSD均小于 0.80％；相对峰面积RSD均小于2.97％，表明方法的重复性良好。具体实验结果见表8和表9。
表8相对保留时间
表9相对峰面积
以上实验结果表明，本发明提供的康媛颗粒指纹图谱检测方法，稳定性好，精密度高，重复性好，能全面客观评价康媛颗粒的质量，为保证临床疗效具有重要的意义。
以上实施例仅为本发明的示例性实施例，不用于限制本发明，本发明的保护范围由权利要求书限定。本领域技术人员可以在本发明的实质和保护范围内，对本发明做出各种修改或等同替换，这种修改或等同替换也应视为落在本发明的保护范围内。
机译： 基于餐饮染料酒石酸的新型指纹图谱检测方法
机译： 用碳纳米颗粒指纹图谱的方法
机译： 用碳纳米颗粒指纹图谱的方法
