一种水相检测雌二醇的表面等离子体共振传感器芯片及其制备方法

摘要

本发明涉及一种水相检测雌二醇的表面等离子体共振传感器芯片及其制备方法，属于表面等离子体共振传感器芯片领域。本发明所提供的表面等离子体共振传感器芯片由玻璃基片、金膜层、自组装单分子层、链转移试剂分子层及分子印迹物薄膜层组成；其中链转移试剂分子层是通过偶联试剂将链转移试剂与自组装单分子层结合；分子印迹聚物薄膜层是利用紫外光引发在链转移试剂分子层表面接枝而成。本发明提供的方法有效的解决了分子印迹物薄膜在水环境中对目标分子结合力弱，同时该芯片制备过程中不需要添加额外的光引发剂或催化剂，制备过程简单可控。芯片的化学性质稳定，选择性好，易于保存可重复利用。

说明书

技术领域

本发明涉及一种水相检测雌二醇的表面等离子体共振传感器芯片及其制备方法，属于表面等离子体共振传感器(Surf_ace>

背景技术

雌二醇是一种甾体雌激素，是一种重要的性激素，能够促进和调节女性性器官及副性特征的正常发育。检测雌二醇水平对于诊断女性性早熟，协助判断和确定排卵期时间有重要的临床意义。目前，检测雌二醇的方法和设备有多种，如液相色谱仪Environ.Sci.Technol.46(2012)7128-7134，气质联用Anal.Bioanal.Chem.397(2010)1335-1345，酶联免疫法J.Enviro.Manage.124(2013)121-127等方法。这些方法具有准确和高灵敏度的特点，但是设备昂贵，制备样品过程复杂，耗时长。

SPR传感器是通过某种耦合方式利用入射光在金属和电介质的界面上激发表面等离子体波(Surface Plasmon Wave,即SPW)来实现信息转换的。SPW对界面介电常数的变化极其敏感。当样品与界面接触时，由于存在吸附或化学反应，界面处介质变化引起的介电常数发生变化，进而引起折射率发生变化。SPR具有快速、实时、无需标记等特点。传统SPR传感器主要应用于生物大分子领域，但是若果目标分子的分子量太小，浓度太低则很难被SPR传感器检测出来。针对传统SPR生物传感器的不足，科研工作者们将具有三维空间结构的分子印迹引入到了SPR传感器领域。利用分子印迹物的网状三维结构增加对目标小分子的吸附量从而增强SPR的响应信号，提高其灵敏度。

分子印迹物是一种人工合成的“智能”材料，对目标分子具有选择性吸附能力。传统的自由基聚合方式制备的分子印迹物，存在吸附量低、扩散慢、低传质速率等问题。特别是在水环境下对目标物检测，是目前分子印迹物制备面临的一个挑战。研究人员通过提高交联剂的含量增加分子印迹物的刚性，使分子印迹物中的印迹孔穴在水环境中保持良好的空间结构，但是这种高交联剂的方法通常导致制备分子印迹物在洗脱过程中难以将模板分子洗脱，形成足够多的印迹孔穴，使得传感器的灵敏度不够好。同时，交联剂过高目标分子进入分子印迹物与具有识别位点的孔穴结合也很难，导致传感器响应速度慢。此外，针对于分子印迹物薄膜来讲，交联剂过高通常导致薄膜变脆，容易从传感器表面脱落，芯片寿命短，可重复利用差。

可逆加成-断裂链转移聚合(Reversible Addition-Fragmentation ChainTransfer Polymerization，简称RAFT)，是活性/可控自由基聚合的一种。在RAFT反应中，通常加入双硫酯或三硫酯衍生物作为链转移试剂。转移试剂在聚合过程中与增长链自由基形成休眠体中间体，限制增长链自由基之间的不可逆双基终止副反应，使聚合反应得到有效的控制。有研究表明采用RAFT制备的分子印迹物其内部结构更趋于一致，从而改善其性能，通过选用适当的功能单体提高在水环境中吸附能力。

目前，采用分子印迹技术制备薄膜用于SPR传感器已有报道(Talanta，141(2015)279-297)(专利：一种可用于水中检测的分子印迹传感芯片，CN103234940A)。该方法实现了在水相中对雌二醇分子的检测，但是其在酸性环境中响应值高，在中性水环境下响应值低。

发明内容

本发明的目的是提供一种水相检测雌二醇的表面等离子体共振传感器芯片及其制备方法，本发明有效的解决了分子印迹物薄膜在水相中对目标分子的吸附能力，灵敏度高，响应速度快，选择性好，且可以重复利用。该制备方法步骤少，生产成本低，更适合工业化生产，通用性更优越。

本发明的目的是通过如下技术方案实现的。

一种水相检测雌二醇的表面等离子体共振传感器芯片，依次由玻璃基片、金膜层、巯基乙胺单分子层、偶联到巯基乙胺的链转移试剂分子层和分子印迹物薄膜组成；所述巯基乙胺单分子层的末端为氨基，偶联到巯基乙胺的链转移试剂分子层的一端为羧基，用二环己基碳二亚胺通过化学耦合方法耦合。

所述的末端为氨基的巯基乙胺单分子层是通过将金膜浸泡在巯基乙胺溶液中自组装制得；

所述巯基乙胺溶液的溶剂为乙腈、乙醇、甲醇、正己烷或氯仿中的一种，巯基乙胺溶液的浓度为1-100mmol/L。

所述的4层采用的链转移试剂为S-1-十二烷基-S’-十二烷基-S’-(α，α’-二甲基-α”-乙酸)三硫代碳酸脂或S,S’-二(α，α’-二甲基-α”-乙酸)三硫代碳酸脂中的一种；

将链转移试剂溶于乙腈、乙醇、甲醇或二甲基亚砜中的一种，得到链转移试剂溶液；链转移试剂溶液的浓度为0.1-15mmol/L。

本发明的工作原理为：首先在金膜表面自组装巯基乙胺单分子层，通过氨基和羧基的偶联试剂将链转移试剂固定到金膜表面自组装的巯基乙胺单分子层上形成4层，然后加入含有链转移试剂的预聚合溶液。该链转移试剂在紫外光(365nm，3W/cm²)照射下发生C―S键断裂，形成以C为中心的活性基团。链转移试剂在这一过程中起到转移试剂和光引发剂的双重作用，进而引发聚合反应发生。

一种水相检测雌二醇的表面等离子体共振传感器芯片的制备方法，具体步骤如下：

步骤一、采用自组装技术，将新鲜蒸镀的镀金玻璃片浸入巯基乙胺溶液中，即将金膜层的一侧浸入巯基乙胺溶液中，浸泡时间不超过48h；此时得到含有玻璃基片、金膜层和巯基乙胺单分子层的三层芯片；

步骤二、将步骤一所得的三层芯片浸入含有链转移试剂和二环己基碳二亚胺的溶液中，使巯基乙胺上的氨基与链转移试剂上的羧基脱水偶联，此时，得到含有玻璃基片、金膜层、巯基乙胺单分子层、链转移试剂分子层的四层芯片；链转移试剂与二环己基碳二亚胺的摩尔浓度比为4：1、3：1、2：1、1：1、1：2、1：3或1：4中的一种；

步骤二所述链转移试剂和二环己基碳二亚胺的溶液的溶剂为乙腈、乙醇、甲醇、正己烷或氯仿中的一种。

步骤三、将步骤二所得的四层芯片装入SPR仪中，利用微量输送系统向流通池中注入溶剂，溶剂为乙腈、乙醇、甲醇或二甲基亚砜中的一种。扫描SPR曲线，然后在所需角度扫描动力学曲线，同时利用紫外灯进行照射，待曲线走平后向流通池中注满配制好的预聚合溶液，得到含有玻璃基片、金膜层、巯基乙胺单分子层、链转移试剂分子层和分子印迹物薄膜的五层芯片；洗脱后得到表面等离子体共振传感器芯片。通过记录和分析动力学曲线的变化来实时地观察分子印迹薄膜的形成情况。薄膜的厚度由入射光的强度、波长以及光聚合反应时间等条件来决定。

步骤三所述的预聚合溶液的构成为：雌二醇、功能单体、交联剂、致孔剂和链转移试剂；功能单体为丙烯酸、甲基丙烯酸、亚甲基丁二酸或甲基丙烯酸羟乙酯中的一种或两种；交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸酯、N,N-二甲基丙烯酰胺、N,N-亚甲基二丙烯酰胺、季戊四醇三丙烯酸酯、季戊四醇四丙烯酸酯、三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯或二乙烯基苯中的一种；致孔剂为二氯甲烷、氯仿、乙腈、甲醇、N,N-二甲基甲酰胺或二甲基亚砜中的一种；链转移试剂为S-1-十二烷基-S’-十二烷基-S’-(α，α’-二甲基-α”-乙酸)三硫代碳酸脂或S,S’-二(α，α’-二甲基-α”-乙酸)三硫代碳酸脂中的一种；雌二醇浓度1-50mM，功能单体浓度1-50mM、交联剂浓度1-1200mM和链转移试剂1-100mM。

步骤三所述溶剂包括：乙腈、乙醇、甲醇或二甲基亚砜。

有益效果

1、本发明的一种水相检测雌二醇的表面等离子体共振传感器芯片，检测环境pH7.4；

2、本发明的一种水相检测雌二醇的表面等离子体共振传感器芯片及其制备方法，制备过程中链转移试剂起到转移试剂和光引发剂的作用，因此无需额外的引发剂或催化剂。

3、本发明的一种水相检测雌二醇的表面等离子体共振传感器芯片及其制备方法，可以快速、方便地在金膜表面制备出纳米尺寸厚度的分子印迹薄膜；

4、本发明的一种水相检测雌二醇的表面等离子体共振传感器芯片及其制备方法，可以实时，动态、原位地监测分子印迹物薄膜5的生长变化情况，进而控制分子印迹物薄膜5的厚度，其精度在纳米级别；

5、本发明的一种水相检测雌二醇的表面等离子体共振传感器芯片及其制备方法，操作步骤简单，对试验条件要求不是很苛刻，无需除氧，氮气保护等繁琐的环节；

附图说明

图1为表面等离子体共振仪芯片结构示意图；

图2为具体实施例中所制得的传感器芯片成膜前后在乙腈溶液中的SPR角度曲线；

图3为具体实施例中传感器芯片洗脱前后在磷酸盐缓冲液(PBS pH7.4)中SPR角度曲线；

图4为具体实施例中吸附雌二醇前后SPR角度曲线。

其中，1-玻璃基片，2-金膜层，3-巯基乙胺单分子层，4-偶联到巯基乙胺的链转移试剂分子层，5-分子印迹物薄膜。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是本实施例只用于对本发明进行进一步的说明，不能理解为本发明保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述本发明的内容对本发明做出非本质的改进和调整。

实施例1

一种水相检测雌二醇的表面等离子体共振传感器芯片，如图1所示，依次由玻璃基片1、金膜层2、巯基乙胺单分子层3、偶联到巯基乙胺的链转移试剂分子层4和分子印迹物薄膜5组成；所述巯基乙胺单分子层3的末端为氨基，偶联到巯基乙胺的链转移试剂分子层4的一端为羧基，通过二环己基碳二亚胺，通过化学耦合方法耦合。

一种水相检测雌二醇的表面等离子体共振传感器芯片的制备方法，具体步骤如下：

(1)玻璃基片1清洗

将2.5×30cm的LASFN9玻璃基片1放入立式染色缸里，采用2％的去污剂水超声清洗15分钟，然后在二次蒸馏水中超声浸泡15分钟，最后用乙醇清洗2次，将载玻片用氮气吹干；之后在新制的Piranha溶液(H₂SO₄：30％H₂O₂＝3：1)中于60℃加热一个小时。再依次用蒸馏水、乙醇冲洗，用氮气吹干；

(2)制备金膜层2

将清洗好的玻璃基片1进行真空蒸镀99.99％的金，真空度为1×10^-5以上，蒸镀速率为厚度为50nm。

(3)制备巯基乙胺单分子层3

将含有玻璃基片1、金膜2的芯片立即浸入1mM的巯基乙胺的乙醇溶液，浸泡24小时，得到含有玻璃基片1、金膜2、巯基乙胺单分子层3的芯片；

(4)制备偶联到巯基乙胺的链转移试剂分子层4

将含有玻璃基片1、金膜2、巯基乙胺单分子层3的芯片取出后，无水乙醇清洗三次，氮气吹干；取S-1-十二烷基-S’-十二烷基-S’-(α，α’-二甲基-α”-乙酸)三硫代碳酸脂0.0146g溶于20mL乙腈溶液中，超声至全部溶解；之后在该溶液中加入二环己基碳二亚胺0.0165g，超声至全部溶解，将含有玻璃基片1、金膜2、巯基乙胺单分子层3的芯片置于该溶液，在室温条件下，静置反应24小时得到含有玻璃基片1、金膜2、巯基乙胺单分子层3、链转移试剂修饰的层4。

(5)制备分子印迹物薄膜5

将在(4)中得到的有玻璃基片1、金膜2、巯基乙胺单分子层3、链转移试剂修饰的层4的芯片装入SPR仪中，利用微量输送系统向流通池中注入乙腈溶剂，扫描SPR曲线，共振角度为58.49°，然后在共振角69°处扫描动力学曲线，同时利用UV-LED点光源(λ＝365nm，3W/cm²)进行照射，待曲线走平后向流通池中注入一定量的、已配制好的预聚合溶液。溶液的组成为：雌二醇(27.2mg)，功能单体(34μL甲基丙烯酸)，交联剂(285μL二甲基丙烯酸乙二醇酯)以及链转移试剂(S-1-十二烷基-S’-十二烷基-S’-(α，α’-二甲基-α”-乙酸)三硫代碳酸脂15mg)的乙腈溶液(4mL)。当光强达到纯溶剂中SPR曲线谱图中的最低光强时立即停止光照，并且利用乙腈冲洗分子印迹物薄膜，动力学曲线不再变化后，扫描SPR曲线，共振角度为68.85°，第一层聚合后共振角增加10.36°，实际得到共振角度与预测目标角度0.15°，如图2所示；第二层分子印迹物薄膜制备与第一层分子印迹物薄膜制备过程相似，其溶液组成：雌二醇(27.2mg)，功能单体(34μL甲基丙烯酸)，交联剂(330μL二甲基丙烯酸乙二醇酯)及链转移试剂(S-1-十二烷基-S’-十二烷基-S’-(α，α’-二甲基-α”-乙酸)三硫代碳酸脂15mg)的乙腈溶液(4mL)。根据第一层实际得到的角度，第二层拟增加1.5°，故将SPR监测位置设定到70.35°。同样观测反射光强变化至最低点时停止光照，得到共振角度为70.34°，如图2所示。与拟增加角度相差0.01°。结果表明通过SPR能够有效的控制分子印迹物薄膜的厚度。此时，得到的芯片含有玻璃基片1、金膜2、巯基乙胺单分子层3、链转移试剂修饰的层4、分子印迹物薄膜5的芯片。

(5)芯片的洗脱

洗脱前需要通10-15min的PBS(pH7.4)缓冲溶液，使分子印迹物薄膜5内外溶液环境达到平衡。洗脱前在PBS缓冲溶液进行SPR角度扫描，得到洗脱前共振角度为70.04°，如图3所示。共振角度在PBS(pH7.4)溶液中略有减小，这是由于PBS(pH7.4)与乙腈的折射率不同导致的。洗脱溶液是由PBS(pH7.4)与乙酸混合制备，两者体积比为9：1。洗脱时间约为30min，洗脱结束在PBS(pH7.4)环境下进行SPR角度扫描，共振角为69.44°，洗脱前后共振角移动0.6°，如图3所示。

(6)芯片的吸附

用制备所得的传感器芯片检测雌二醇样品，样品由PBS(pH7.4)配制而成，浓度为10^-12mol/L。同时监测吸附动力学，每次大约吸附17分钟，吸附结束后进行SPR角度扫描，共振角角度为69.55°，角度增加0.11°，如图4所示。

以上所述的具体描述，对发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。