一种多花梾木芽起源的愈伤组织的诱导方法

摘要

本发明公开了一种多花梾木芽起源的愈伤组织的诱导方法，包括：以多花梾木的芽为外植体，消毒后接种于培养基上进行光照培养；其中所述培养基的配方为：基础培养基+6‑BA0.2‑0.5mg/L+NAA 1‑2mg/L+蔗糖30‑40g/L+琼脂6‑9g/L。本发明探索出积极而有效的多花梾木茎组织培养新方法，对培养基、培养条件、消毒方法进行了优化，可在短时间内诱导获得大量的愈伤组织。

说明书

技术领域

本发明涉及组织培养，尤其涉及一种多花梾木芽起源的愈伤组织的诱导方法。

背景技术

多花梾木又称大花四照花，原产于北美洲东部，多花梾木四季景色各有不同，春天花瓣状苞片盛开，夏秋有色彩绚烂的叶片，花后有桔红色的浆果，是高档的景观植物和油料植物，市场前景广阔，我国尚处于引种阶段。多花梾木一般采用种子播种、扦插方法繁殖。通过对多花梾木器官组织培养，促进愈伤组织的形成，从而培育出更多的多花梾木的苗木，是多花梾木扩繁的重要途径。

由于多花梾木是新引进品种，国内有少数学者对于梾木属的其他植物进行组培的研究，但是繁殖系数比较低。

发明内容

发明目的：针对现有技术中的问题，本发明提供一种多花梾木芽起源的愈伤组织的诱导方法，以芽为外植体，在短时间内诱导获得大量的愈伤组织。

技术方案：本发明所述的多花梾木芽起源的愈伤组织的诱导方法，包括：以多花梾木的芽为外植体，消毒后接种于培养基上进行光照培养；其中所述培养基的配方为：基础培养基+6-BA 0.2-0.5mg/L+NAA 1-2mg/L+蔗糖30-40g/L+琼脂 6-9g/L。

所述外植体为多花梾木当年生的1-3cm的嫩芽。

所述消毒的方法包括：将外植体洗净后，先用70-75％酒精处理20-40s，无菌水清洗后再用0.1-0.2％升汞进行消毒处理，处理时间为3-6min，最后用无菌水冲洗干净，去除残余水分。

酒精处理的时间优选为30s，升汞的处理时间优选为4min。

培养基的配方优选为：基础培养基+6-BA 0.4-0.5mg/L+NAA 1.5-2mg/L+蔗糖 30-40g/L+琼脂6-9g/L。

进一步优选的，培养基的配方为：基础培养基+6-BA 0.5mg/L+NAA 2mg/L+ 蔗糖35g/L+琼脂7g/L。

所述的基础培养基为WPM。

所述光照培养的温度为23-27℃，光照时间为16-17h/d，光照度为 2000-2200lx。

有益效果：本发明探索出积极而有效的多花梾木茎组织培养新方法，对培养基、培养条件、消毒方法进行了优化，可在短时间内诱导获得大量的愈伤组织。

附图说明

图1为实施例1多花梾木芽外植体；

图2为实施例1正接种到培养基上的芽外植体；

图3为实施例1放在培养室内培养的接种苗；

图4为实施例1已形成大量愈伤组织的接种苗。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。

实施例1

1、外植体的整理

采集多花梾木当年生的1-3cm的嫩芽，放入白瓷缸中，用洗衣粉漂洗2min，再于流水下冲洗2h。将去掉了表面灰尘和泥土的外植体放在超净工作台上消毒处理。

2、消毒处理

先用75％酒精处理20～40s，然后用无菌水冲洗一次，再用0.1％升汞处理，处理时间为3-6min，再用无菌水冲洗3次，残留的水分用无菌纸吸取。

3、接种

将消毒完毕的芽置于无菌纸上，用消毒后的镊子和剪刀接种于培养基上，筛选不同的培养基WPM、MS、1/2MS、B5、N6，选用不同的6-BA和NAA的浓度：6-BA浓度分别为0、0.5、1、2mg/L，NAA的浓度分别是0、0.02、0.2、2mg/L，研究不同培养基不同激素不同浓度下对外植体形成愈伤组织的影响。每一处理接种30瓶，重复3次，每试管瓶放置1个外植体。

4、培养条件

所有的培养基均添加蔗糖35g/L，琼脂7g/L，调节pH值为5.8左右，在121℃高压下灭菌25min。将接种后的外植体置于培养室内，光照16h/d，光照度约为 2000lx，温度控制在(25±2)℃。

5、结果与分析

5.1通过比较不同消毒处理时间，确定最佳的消毒处理，进一步筛选出无菌苗。

表1不同的消毒处理方式对外植体保存率的影响

表1数据表示75％酒精处理30s、0.1％升汞处理4min消毒效果最好，可以更好的筛选出无菌苗，提高成活率。

5.2通过分析以下数据多花梾木芽起源在此方案下可快速形成愈伤组织，且为以后提供无菌苗打好基础。表2是在接种后1个半月对组培过程中愈伤组织形成的大小的统计数据，单位为cm。

表2各培养基及激素试验条件下芽起源愈伤组织生长情况表

表2为4月23日到5月19日愈伤组织生长状况，从表中可以看出，仅培养 26d愈伤组织生长量最大的达￠1.4cm，愈伤组织形成速度很快，为后期进一步进行芽分化培养打下良好的基础。

5.3筛选出多花梾木在愈伤组织形成过程中最合适的培养基；

表3不同的培养基对形成愈伤组织效果的影响

结果

Dumcan^a，b

已显示同类子集中的组均值。

基于观测到的均值。

误差项为均值方(错误)＝.093。

a.使用调和均值样本大小＝16.000。

b.Alpha＝.05。

表3数据分析可知几种基本培养基差异不显著，

但是WPM培养基与其他的培养基相比较而言，效果是最好的(根据SPSS24软件进行分析得出对培养基进行比对的表3，从表中可以得出五种培养基之间区别不明显，但不明显不代表没区别，从优选的角度来看，表3中的数值也清晰的说明WPM的作用要优于其他培养基。)。为了优化方案，可将WPM培养基作为中最合适的培养基。

5.4筛选出多花梾木在愈伤组织形成过程中最合适的6-BA浓度；

表4数据分析可知浓度为0mg/L和0.5mg/L水平间有差异，0mg/L和 1.0mg/L，2.0mg/L相互间差异不明显，1.0mg/L，2.0mg/L，0.5mg/L相互间差异不明显，浓度为0.5mg/L与0mg/L的有较大差异，浓度为0.5mg/L的6-BA对多花梾木芽的愈伤组织效果最好。

表4不同浓度的6-BA对形成愈伤组织效果的影响

结果

Duncan^a，b

已显示同类子集中的组均值。

基于观测到的均值。

误差项为均值方(错误)＝.093。

a.使用调和均值样本大小＝20.000。

b.Alpha＝.05。

5.5筛选出多花梾木在愈伤组织形成过程中最合适的NAA浓度；

图3数据分析可得，0.2mg/L，2mg/L比0mg/L，0.02mg/L影响更加显著， 0.2mg/L和2mg/L之间无明显差异，但2mg/L对多花梾木芽起源愈伤组织的形成更加有优势。(根据SPSS24软件进行分析得出对NAA各浓度进行比对结果如表5中所述，子集1中NAA浓度中0mg/L、0.02mg/L两者不明显，子集2中 0.2mg/L、2mg/L之间表现不明显，但表中仍然表明了2mg/L是明显优于0mg/L 的，且在子集2中0.2mg/L、2mg/L之间，从数值上2mg/L也优于0.2mg/L，所以从优化的角度来看，培养基中采用NAA2mg/L比较妥当。)

表5不同浓度的NAA对初代培养效果

结果

Duncan^a，b

已显示同类子集中的组均值。

基于观测到的均值。

误差项为均值方(错误)＝093。

a.使用调和均值样本大小＝20.000。

b.Alpha＝.05。

5.6筛选出多花梾木芽在愈伤组织形成过程中最合适的激素比例

表6不同激素对愈伤组织的形成影响

主体间效应的检验

因变量：结果

a.R方＝.510(调整R方＝.439)

表6为主体间效应的检验，NAA的Sig值小于0.05，NAA比6-BA对愈伤组织的形成影响更加显著。从而可知NAA对多花梾木芽起源形成愈伤组织更加有优势。

通过以上比较，我们可以得出结论，比例为WPM+0.5mg/L 6-BA+2mg/L NAA，蔗糖35g/L，琼脂7g/L的培养基对于多花梾木的芽的愈伤组织的快速形成最为有利。

本试验对促进多花梾木芽愈伤组织形成的基本培养基、6-BA浓度、NAA浓度进行了筛选，优化组培方案，可快速形成愈伤组织，获得无菌苗。初步得出了最适的初代培养基为WPM+0.5mg/L 6-BA+2mg/L NAA，蔗糖35g/L，琼脂7g/。在接种过程中，用75％酒精处理30s，然后用无菌水冲洗一次，再用配制0.1％的升汞将外植体浸泡4min，用无菌水冲洗3次。