一种体外酶法催化肝素前体制备肝素的方法

摘要

本发明公开了一种体外酶法催化肝素前体制备肝素的方法，属生物医药领域。本发明提供了由纯生物酶法合成具有生物学功能的肝素五糖的方法。通过在基因的5’端融合麦芽糖融合蛋白或双亲短肽序列提高相应硫酸转移酶或变构酶的表达量及酶活，由此得到结构稳定、单一的凝血类药物。

说明书

技术领域

本发明涉及一种体外酶法催化肝素前体制备肝素的方法，属生物医药领域。

背景技术

肝素(heparin，HP)是由葡萄糖醛酸和N-乙酰葡萄糖胺以α1→4、β1→4糖苷键交替形成、并伴随葡萄糖醛酸一定程度变构化、硫酸化及N-乙酰葡萄糖胺硫酸化修饰的粘多糖。其中硫酸乙酰肝素(heparin sulfate，HS)是肝素的一种特殊形式。。HP和HS广泛存在于细胞表面和胞外基质中，对维持神经干细胞稳定、神经元迁移、神经突起延长、树突再生等方面作用明显，在临床上广泛用于抗凝血药物。目前临床上使用的HS从动物软骨组织中提取，但动物来源HS的硫酸化程度及硫酸化类型差异较大。此外，动物软骨组织中含有一定量的过硫酸软骨素，而过硫酸软骨素和肝素在理化性质方面较为相近，故在工业化大规模CS提取过程中，会参杂一定量的过硫酸软骨素，而降低临床药效，且容易引起过敏反应。这造成了2008年100多人死亡的临床医疗事件，由此导致美国限制由中国出口的肝素原料。

基于上述动物来源HS的限制，人们提出了酶法合成HS，此方法具有能得到专一性具有生物学活性的肝素五糖的优点。酶法合成HS可以由肝素前体经N-脱乙酰硫酸转移酶(NDST)、葡萄糖醛酸C5-变构酶(C5epi)、硫酸乙酰肝素2-硫酸转移酶(HS2ST)、硫酸乙酰肝素6-硫酸转移酶(HS6ST)及硫酸乙酰肝素3-硫酸转移酶(HS3ST)等5个酶硫酸化及变构化后形成。然而上述酶几乎均来源于动物，酶的制备成本较高。因此，目前实验室规模的HS并未完全采用生物酶法制备，而是主要是由化学酶法合成，例如以NaOH脱乙酰代替NDST中的脱乙酰功能，该过程引入化学试剂容易造成对其他硫酸转移酶类的活性的影响。

发明内容

为解决现有技术存在的上述缺陷，本发明提供了由纯生物酶法合成具有生物学功能的肝素五糖的方法。通过在基因的5’端融合麦芽糖融合蛋白或双亲短肽序列提高相应硫酸转移酶或变构酶的表达量及酶活，由此得到结构稳定、单一的凝血类药物。

本发明的第一个目的是提供一种制备具有生物学活性的肝素的方法，是以肝素前体为底物，在PAPS再生系统中通过肝素N-脱乙酰硫酸转移酶、硫酸乙酰肝素2-硫酸转移酶、硫酸乙酰肝素6-硫酸转移酶及硫酸乙酰肝素3-硫酸转移酶硫酸化并经葡萄糖醛酸C5-变构酶变构化肝素前体制备肝素。

在本发明的一种实施方式中，所述N-脱乙酰硫酸转移酶、葡萄糖醛酸C5-变构酶、硫酸乙酰肝素2-硫酸转移酶、硫酸乙酰肝素6-硫酸转移酶及硫酸乙酰肝素3-硫酸转移酶来源于动物。

在本发明的一种实施方式中，所述N-脱乙酰硫酸转移酶、葡萄糖醛酸C5-变构酶、硫酸乙酰肝素2-硫酸转移酶、硫酸乙酰肝素6-硫酸转移酶及硫酸乙酰肝素3-硫酸转移酶是由微生物异源表达并生产。

在本发明的一种实施方式中，编码肝素N-脱乙酰硫酸转移酶(NDST)的基因为GeneID：NP_077337.1所示基因。

在本发明的一种实施方式中，编码葡萄糖醛酸C5-变构酶(C5epi)的基因为GeneID：NP_056369.1所示基因。

在本发明的一种实施方式中，编码硫酸乙酰肝素2-硫酸转移酶(HS2ST)的基因为Gene ID：NP_989812.1所示基因。

在本发明的一种实施方式中，编码硫酸乙酰肝素6-硫酸转移酶(HS6ST)的基因为Gene ID：NP_989813.1所示基因。

在本发明的一种实施方式中，编码硫酸乙酰肝素3-硫酸转移酶(HS3ST)的基因为Gene ID：NP_034604.1所示基因。

在本发明的一种实施方式中，所述N-脱乙酰硫酸转移酶、葡萄糖醛酸C5-变构酶、硫酸乙酰肝素2-硫酸转移酶、硫酸乙酰肝素6-硫酸转移酶及硫酸乙酰肝素2-硫酸转移酶由微生物生产获得。

在本发明的一种实施方式中，所述NDST、C5epi、HS2ST、HS6ST及HS3ST分别是将NCBI中Gene ID：NP_077337.1、NP_056369.1、NP_989812.1、NP_989813.1或NP_034604.1的基因在5’端融合麦芽糖融合蛋白或双亲短肽核苷酸序列后，以pET系列载体为表达载体，在大肠杆菌中表达得到的。

在本发明的一种实施方式中，所述NDST、C5epi、HS2ST、HS6ST及HS3ST分别是将NCBI中Gene ID：NP_077337.1、NP_056369.1、NP_989812.1、NP_989813.1或NP_034604.1的基因在5’端融合麦芽糖融合蛋白或双亲短肽核苷酸序列后，以pPIC系列载体为表达载体在毕赤酵母中表达得到。

在本发明的一种实施方式中，所述pET系列载体包括但不限于pET20b、pET22b、pET26b、pET28a、pET32a。

在本发明的一种实施方式中，所述大肠杆菌包括E.coli BL21、E.coli JM109、E.coli DH5α、或E.coli TOP10。

在本发明的一种实施方式中，所述毕赤酵母包括P.pastoris JC233、P.pastorisJC234、P.pastoris JC247、P.pastoris JC248、P.pastoris GS190、P.pastoris JC235、P.pastoris JC236、P.pastoris JC237、P.pastoris JC252、P.pastoris JC251、P.pastoris JC239、P.pastoris GS115、P.pastoris JC240、P.pastoris JC241、P.pastoris JC242、P.pastoris JC220、P.pastoris JC221、P.pastoris JC222、P.pastoris JC223、P.pastoris JC224、P.pastoris JC225、P.pastoris JC226、P.pastoris JC254、P.pastoris JC255等。

在本发明的一种实施方式中，所述PAPS再生系统，是在1-200mM的pH 5-9的Tris-HCl溶液中，添加0.1-50mM对硝基苯磺酸(PNPS)、1-200μM 3’5’-二磷酸腺苷(PAP)、0.1-100μg ASST IV。

在本发明的一种实施方式中，所述酰基硫酸转移酶(aryl sulfotransferase,ASST IV)是将NCBI中Gene ID：83783的基因在5’端融合麦芽糖融合蛋白或双亲短肽核苷酸序列后以pET系列载体为表达载体，在大肠杆菌进行表达得到的。

在本发明的一种实施方式中，制备肝素时，向1mL PAPS再生系统中添加0.1-100μgNDST、C5epi、HS2ST、HS6ST及HS3ST。

在本发明的一种实施方式中，ASST IV的酶活为0.1-1000μmol/mg·蛋白，NDST、C5epi、HS2ST、HS6ST及HS3ST的酶活为0.1-10000nmol/mg·蛋白，。

在本发明的一种实施方式中，制备肝素时，酶催化反应温度为10-50℃。

在本发明的一种实施方式中，制备肝素时，酶促反应时间为1-50h。

在本发明的一种实施方式中，制备肝素时，酶促反应pH为5-9。

本发明的第二个目的是提供所述方法在制备肝素及含肝素的食品、药品中的应用。

有益效果：本发明首次采用纯微生物法发酵得到的硫酸转移酶及变构酶等整合肝素前体及ASST，酶活达到0.1-200μmol/mg，得到具有生物学活性的肝素及硫酸乙酰肝素，转化率达到20-80％，具有巨大的工业应用价值。

附图说明

图1重组表达ASST IV的SDS-PAGE图，其中M：200kDa Marker(对应条带大小分别为192，96，62，49，38，28，14，6，3kDa)；1：以pET系列空载体构建的重组菌株的胞内全细胞SDS-PAGE图谱；2：以pET系列载体构建的E.coli ASST重组菌株的胞内全细胞SDS-PAGE图谱；3：以pET系列载体构建的E.coli MBP-ASST重组菌株的胞内全细胞SDS-PAGE图谱；4：以pET系列载体构建的E.coli AP1-ASST重组菌株的胞内全细胞SDS-PAGE图谱；4：纯化后的AP1-ASSTSDS-PAGE图谱。

图2重组表达NDST、C5epi、HS2ST、HS6ST及HS3ST的SDS-PAGE图，其中M：Marker；1：以pPET系列载体空载转化形成的重组菌的胞外上清SDS-PAGE图谱；2：以pPET系列载体构建的表达AP1-NDST的重组菌株的胞外上清SDS-PAGE图谱；3：以pPET系列载体构建的表达AP1-C5epi的重组菌株的胞外上清SDS-PAGE图谱；4：以pPET系列载体构建的表达AP1-HS2ST的重组菌株的胞外上清SDS-PAGE图谱；5：以pPET系列载体构建的表达AP1-HS6ST的重组菌株的胞外上清SDS-PAGE图谱；6：以pPET系列载体构建的表达AP1-HS3ST的重组菌株的胞外上清SDS-PAGE图谱。

图3重组表达NDST、C5epi、HS2ST、HS6ST及HS3ST的Western blot图谱，其中M：Marker；1：以pPIC系列载体构建的表达MBP-NDST的重组菌株的胞外上清SDS-PAGE图谱；2：以pPIC系列载体构建的表达MBP-C5epi的重组菌株的胞外上清SDS-PAGE图谱；3：以pPIC系列载体构建的表达MBP-HS2ST的重组菌株的胞外上清SDS-PAGE图谱；4：以pPIC系列载体构建的表达MBP-HS6ST的重组菌株的胞外上清SDS-PAGE图谱，5：以pPIC系列载体构建的表达MBP-HS3ST的重组菌株的胞外上清SDS-PAGE图谱，6：以pPIC系列载体空载转化形成的重组菌的胞外上清SDS-PAGE图谱。

图4NDST、C5epi、HS2ST、HS6ST及HS3ST酶活，其中，C5epi和HS2ST的酶活以HS2ST催化过程中形成的对硝基苯酚(PNP)来表征。

图5肝素二糖单位质谱图，其中，OS(GlcNAc-GlcUA)，NS(GlcNS-GlcUA)，2S(GlcNAc-IdoUA2S)，NS6S(GlcNS6S-IdoUA)，NS2S(GlcNS6S-IdoUA2S)，Tri(GlcNS6S3S-IdoUA2S)

具体实施方式

具体实施方式中涉及的缩写及其对应中文含义：

ASST IV：酰基硫酸转移酶IV，编码该酶的基因序列参见NCBI中Gene ID：83783。

NDST：肝素N-脱乙酰硫酸转移酶，编码该酶的基因序列参见NCBI中Gene ID：NP_077337.1。

C5epi：葡萄糖醛酸C5-变构酶，编码该酶的基因序列参见NCBI中Gene ID：NP_056369.1。

HS2ST：硫酸乙酰肝素2-硫酸转移酶，编码该酶的基因序列参见NCBI中Gene ID：NP_989812.1。

HS6ST：硫酸乙酰肝素6-硫酸转移酶，编码该酶的基因序列参见NCBI中Gene ID：NP_989813.1。

HS3ST：硫酸乙酰肝素3-硫酸转移酶，编码该酶的基因序列参见NCBI中Gene ID：NP_034604.1。

HS：硫酸乙酰肝素；HP：肝素；PNPS：对硝基苯磺酸；PNP：对硝基苯酚；PAP：3’5’-二磷酸腺苷；

NDST的酶活测定方法：以肝素前体为原料，构建催化反应体系，包括20mM Tris-HCl(pH7.0)，3mM PNPS，20μM PAP，10mg ASST IV，5mg/mL肝素前体及20μg NDST，37℃，反应20h后100℃加热5min终止反应后在400nm波长下测定吸光值。

C5epi和HS2ST的酶活测定方法：以脱乙酰硫酸化肝素前体为原料，构建催化反应体系，包括20mM Tris-HCl(pH7.0)，3mM PNPS，20μM PAP，10mg ASST IV，5mg/mL脱乙酰硫酸化肝素，20μg C5epi及20μg HS2ST，37℃，反应20h后100℃加热5min终止反应后在400nm波长下测定吸光值。

HS6ST的酶活测定方法：以非硫酸化肝素为原料，构建催化反应体系，包括20mMTris-HCl(pH7.0)，3mM PNPS，20μM PAP，10mg ASST IV，5mg/mL非硫酸化肝素及20μgHS6ST，37℃，反应20h后100℃加热5min终止反应后在400nm波长下测定吸光值。

HS3ST的酶活测定方法：以肝素为原料，构建催化反应体系，包括20mM Tris-HCl(pH7.0)，3mM PNPS，20μM PAP，10mg ASST IV，5mg/mL肝素及20μg HS3ST，37℃，反应20h后100℃加热5min终止反应后在400nm波长下测定吸光值。

产物得率的计算公式：Y＝10^-3*(18.83*(A_C-A_{ASST>)+0.38)；其中，AC为NDST酶活测定时的吸光值；AASST>为对照吸光值。}

HS的检测：LC的检测条件如下：流动相A(4mM乙酸)，流动相B(4mM乙酸，70％甲醇/水溶液)，柱子：C18Reverse phase column，0.3mm*250mm，洗脱条件见表1。MS的条件如下：雾化载气速度0.75L/min，雾化温度140℃，干燥载气N₂速度1.2L/min，阴离子模式扫描M/Z范围40-2000，得到特征峰(图5)。

表1 HPLC洗脱条件

实施例1 PAPS再生系统的配制

PAPS再生系统组分为：PNPS的浓度为3mM，PAP的浓度为20μM，ASST IV 10mg/L，以1-200mM的pH 5-9的Tris-HCl为基底液。加入1-100mg/L C4ST或C6ST作为软骨素硫酸化的硫酸基供体。

实施例2 工具酶ASST IV、C4ST、C6ST的制备

(1)重组大肠杆菌的摇瓶表达

以诱导性载体pET系列载体pET26b为载体，分别构建pET26b-ASST IV、pET26b-NDST、pET26b-C5epi，pET26b-HS2ST、pET26b-HS6ST、pET26b-HS3ST，转化大肠杆菌得到转化子。以未连接基因的pET系列载体pET26b转化大肠杆菌得到的转化子作为对照。

挑取以pET系列载体构建的重组菌株单菌落于3mL LB培养基(加入终浓度为50μg/mL的氨苄青霉素)中，37℃，200rpm培养过夜。按1％(V/V)的比例转接50mLTB培养基(加入终浓度为50μg/mL的氨苄青霉素)，37℃，200rpm培养2h至OD_600nm大约在0.6-0.8，加入终浓度为0.1mM的IPTG，诱导48h。将上述培养物于8000rpm，4℃离心5min收集菌体，用预冷的Tris-HCl(pH>

从图1可以看出，以pET26b载体构建的重组菌株的胞内全细胞有明显的ASST IV条带。从图2可以看出，以pET26b载体构建的分别表达NDST、C5epi、HS2ST、HS6ST及HS3ST的重组菌株的胞外上清中出现了相应目的条带，而对照中无相应条带。

(2)重组毕赤酵母的摇瓶表达

以诱导性启动子pPIC系列载体构建pPIC9K-mbp-ASST IV、pPIC9K-mbp-NDST、pPIC9K-mbp-C5epi，pPIC9K-mbp-HS2ST、pPIC9K-mbp-HS6ST、pPIC9K-mbp-HS3ST，转化毕赤酵母得到转化子；以pPIC9K转化毕赤酵母得到转化子，作为对照。挑取以pPIC系列载体构建重组菌株单菌落于3mLYPD培养基中，30℃，200rpm培养过夜。按1％(V/V)的比例转接50mLBMMY培养基(加入终浓度为0.5g/L的甲醇)中，20℃，200rpm诱导5d。将上述培养物于8000rpm，4℃离心5min收集上清，即为粗酶液(图3)。

从图3可以看出，以pPIC系列载体构建的重组菌株实现了酶的分泌表达，而以对照中无相应的条带。

(3)ASST-IV、NDST、C5epi、HS2ST、HS6ST及HS3ST工具酶的纯化

用Buffer A(20mM Tris-HCl，0.5M NaCl，20mM咪唑，pH 7.4)平衡Ni-NTA AgaroseFast Flow柱子后，将粗酶液透过0.22μm滤膜后，上清液以3mL/min的速度通过Ni-NTAAgarose Fast Flow柱子，结合10min后，Buffer B(20mM Tris-HCl，0.5M NaCl，500mM咪唑，pH 7.4)洗脱收集酶活性部分，浓缩，冷冻干燥，测算酶活(图4)。如图4所示，大肠杆菌表达的NDST、C5epi、HS2ST、HS6ST、HS3ST的酶活分别为18、25、142、113、169U/L，毕赤酵母表达的NDST、C5epi、HS2ST、HS6ST、HS3ST的酶活分别为1420、1935、2892、2038、2788U/L。

实施例3 HS的制备

以肝素前体为原料，构建催化反应体系，包括20mM Tris-HCl(pH7.0)，3mM PNPS，20μM PAP，10mg ASST IV(酶活单位0.1-100nmol/min·mg·protein)，5mg/mL肝素前体及20μg NDST、C5epi、HS2ST、HS6ST及HS3ST(酶活单位0.1-100pmol/min·mg·protein)，37℃，反应20h后100℃加热5min终止反应。

向终止反应后的反应液中加入肝素裂解酶I、II、III，37℃，反应5-20h后100℃加热5min终止反应，透过0.22μm的滤膜后进行LC-MS检测。结果如图5所示，NDST的转化率为55.88％，C5epi偶联HS2ST的转化率为65.23％，HS6ST的转化率为78.02％，HS3ST的转化率为78.98％，最终合成的具有生物学活性的五糖单位的转化率为22.06％，产量为1.1mg/mL。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。