肝素前体heparosan的化学酶法修饰及体外抗黏附作用初步研究

摘要

肝素(heparin，HP)是由葡萄糖醛酸(glucuronic acid，GlcA)或艾杜糖醛酸(iduronic acid，IdoA)与葡萄糖胺(glucosamine，GlcN)构成的二糖单元组成的一种糖胺聚糖(glycosaminoglycan，GAG)，其中二糖单元的不同位点存在不同程度的硫酸化修饰，导致肝素结构十分复杂。肝素是临床上重要的抗凝药物，临床实践还发现肝素能明显延长癌症患者的生存期，药理活性研究进一步证明肝素及其衍生物在动物体内具有显著的抗肿瘤转移作用，其主要机制是阻断肿瘤细胞黏附、抑制新生血管生成等。但动物源肝素存在较大的安全隐患，而且化学法脱硫酸化、乙酰化修饰可能导致肝素衍生物的工艺可靠性差、结构更为复杂。因此，迫切需要发展一种更加安全、可靠的制备肝素及其衍生物的新方法。大肠杆菌K5(Escherichia coli K5)产生的荚膜多糖是一种非硫酸化的GAG，二糖重复单元由GlcA与乙酰葡萄糖胺（acetyl glucosamine，GlcNAc）组成，因而被称为肝素前体（heparosan或N-acetylheparosan，NAH）。本课题通过发酵大肠杆菌K5制备肝素前体heparosan;然后采用化学处理与酶催化反应相结合的策略对其进行选择性修饰，以合成不同硫酸化修饰模式的肝素衍生物;最后测定得到的五种肝素衍生物体外对肿瘤细胞黏附人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)的影响，揭示肝素衍生物抑制肿瘤细胞黏附的构效关系，为研究非动物源抗肿瘤肝素类创新药物提供参考依据。
　　本学位论文取得的成果及结论包括以下几个方面:
　　1.Heparosan多糖的制备与表征
　　大肠杆菌K5在葡萄糖合成培养基中摇瓶发酵18h，发酵上清液经超滤浓缩、醇沉得胞外多糖粗品，粗品经强阴离子交换柱层析纯化得多糖精品，以每升发酵液制备的多糖纯品计，产量为105mg/L。双糖分析与核磁共振(NMR)测试表明制备的细菌胞外多糖的结构与肝素前体heparosan相同;凝胶渗透色谱(GPC)分析表明heparosan的纯度为98.2％，分子量为69.22kDa，制备规模达到克级。
　　2.非动物源肝素衍生物的制备与结构表征
　　Heparosan在碱性条件下彻底N-脱乙酰化，其后以三氧化硫-三甲胺复合物为硫酸基供体进行N-硫酸化(NS)修饰得到含N-硫酸化葡萄糖胺(GlcNS)的肝素衍生物（命名为NS-NAH），其肝素酶完全水解产物的双糖分析确定不饱和双糖ΔU-GlcNS的比例为97.9％，说明绝大多数GlcNAc被修饰为GlcNS。在C5异构化酶(C5-epi)和2-O-硫酸基转移酶(2-OST)的共同催化下，NS-NAH的GlcA残基一步转变为2-O-硫酸化艾杜糖醛酸(IdoA2S)，经Q Sepharose强阴离子交换柱层析纯化得到含IdoA2S的肝素衍生物（命名为I2S-NS-NAH），双糖分析证明其双糖ΔU2S-GlcNAc、ΔU2S-GlcNS的含量0.7％、90.4％，表明GlcA的转化率超过90％。在6-O硫酸基转移酶1和6-O硫酸基转移酶3(6-OST1/3)的催化下，I2S-NS-NAH的GlcN（GlcNS及GlcNAc）残基被6-O-硫酸化(6S)，离子交换柱层析纯化得到含GlcNS6S、GlcNAc6S的肝素衍生物(命名为6S-I2S-NS-NAH)，双糖分析表明其双糖ΔU-GlcNAc6S、ΔU-GlcNS6S和ΔU2S-GlcNS6S的含量为0.5％、13.5％、66.4％，表明GlcN的6S修饰率＞80％。NS-NAH经6-OST1/3两酶的催化修饰、离子交换柱层析纯化得到另一种6S修饰的肝素衍生物（命名为6S-NS-NAH），双糖分析确定其双糖ΔU-GlcNAc6S、ΔU-GlcNS6S含量为0.4％、87.4％，表明GlcN的6S修饰率达87.8％。此外，将6S-I2S-NS-NAH溶于0.5M NaOH并于-20℃静置3d、冻干使IdoA2S发生2-O-脱硫酸化，得到含IdoA的产物（命名为6S-I-NS-NAH），双糖分析表明90.5％的IdoA2S发生2-O-脱硫酸化。NMR鉴定了五种肝素衍生物的结构特征;GPC纯度分析表明除6S-I-NS-NAH外，其余四种肝素衍生物的纯度均达＞90％;衍生物的制备规模均达到百毫克级。
　　3.肝素衍生物的抗凝活性及对肿瘤细胞黏附的影响
　　运用抗FXa试剂盒测定heparosan及五种肝素衍生物的抗凝活性。实验证实全部样品的效价均不到对照品肝素钠的1％,因此合成的产物为非抗凝肝素衍生物。
　　参考文献从新生儿脐带中提取HUVECs并采用流式细胞技术进行鉴定。细胞毒性测定结果表明，浓度＜200μg/ml的heparosan及五种肝素衍生物对HUVECs与肿瘤细胞均无明显的细胞毒性(P＞0.05)。浓度为200μg/ml的五种肝素衍生物均对小鼠黑色素瘤细胞B16-F10展现出一定的细胞毒性(P＜0.05)，而heparosan则不能;对于人乳腺癌细胞MDA-MB-231，只有6S-I2S-NS-NAH、6S-I-NS-NAH展现出细胞毒性（P＜0.05）;而对HUVECs，只有I2S-NS-NAH表现出一定细胞毒性(P＜0.05)。
　　肿瘤细胞黏附HUVECs实验证实，在测试的低、中、高三个浓度下(50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml)，heparosan和NS-NAH均没有表现出明显的抗黏附作用;I2S-NS-NAH在高浓度下能抑制B16-F10黏附HUVECs作用，而中、高浓度的6S-I2S-NS-NAH、6S-I-NS-NAH、6S-NS-NAH均展现出抗黏附作用，对照品肝素钠在低中高浓度下均展现出抗黏附作用。中浓度的6S-I2S-NS-NAH具有明显的抗黏附作用（P＜0.05），I2S-NS-NAH则没有(P＞0.05);6S-NS-NAH在中、高浓度下均具明显的抗黏附作用(P＜0.05)，而NS-NAH均无作用(P＞0.05)，因此，6-O-硫酸化对肝素衍生物的抗黏附作用是非常关键的。不同浓度的6S-I2S-NS-NAH与6S-I-NS-NAH相比，抗黏附作用没有显著差异（P＞0.05），提示IdoA的2-O-硫酸化对抗黏附作用没有显著影响。此外，6S-NS-NAH与6S-I-NS-NAH的抗黏附作用也没有显著差异(P＞0.05)，二者主要区别在于糖醛酸的不同，说明GlcA与IdoA对肝素衍生物的抗黏附作用影响不大。与其他衍生物比较，以heparosan为原料合成肝素衍生物6S-NS-NAH的工艺简单、产率高，值得进一步研究和开发。

目录

声明

摘要

符号说明

第一章 前言

1．肝素及其衍生物

1．1 肝素概述

1．2 肝素及其衍生物的抗肿瘤作用

1．3 肝素及其衍生物的制备

2．Heparosan

2．1 Heparosan概述

2．2 Heparosan的制备

2．3 Heparosan的应用

3．本课题研究的目的与意义

3．1 前期研究基础

3．2 本课题拟解决的问题

第二章 Heparosan的制备

1．实验材料

1．1 菌株

1．2 培养基

1．3 实验试剂与耗材

1．4 实验仪器

2．实验方法

2．1 Heparosan的提取与纯化

2．2 Heparosan的表征

3．结果与分析

3．2 Heparosan的表征

4 讨论

5 本章小结

第三章 非动物源肝素衍生物的制备与结构鉴定

1．1 实验材料

1．2 实验方法

1．3 结果与分析

2．I2S-NS-NAH的制备与表征

2．1 实验材料

2．2 实验方法

2．3 结果与分析

3．6S-12S-NS-NAH的制备与表征

3．1 实验材料

3．2 实验方法

3．3 结果与分析

4．6S-NS-NAH的制备与表征

4．1 实验材料

4．2 实验方法

4．3 结果与分析

5．6S-I-NS-NAH的制备与表征

5．1 实验材料

5．2 实验方法

5．3 结果与分析

6．讨论

7．本章小结

第四章 Heparosan及肝素衍生物对肿瘤细胞黏附的影响

1．实验材料

1．1 实验试剂与耗材

1．2 实验细胞

1．3 实验仪器

2．实验方法

2．1 抗凝活性的测定

2．2 HUVECs的提取、培养与鉴定

2．3 细胞毒性的测定

3．1 抗凝活性的测定

3．2 人脐静脉内皮细胞的鉴定

3．3 细胞毒性的测定

3．4 肿瘤细胞黏附内皮细胞实验

4．讨论

5．本章小结

第五章 总结与展望

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间学术成果