一种用于口蹄疫疫苗146S含量检测的标准抗原及其制备方法和应用

摘要

本发明涉及一种用于口蹄疫疫苗146S含量检测的标准抗原制备方法，该方法使用二氯甲烷对口蹄疫病毒液进行抽提纯化，纯化效果能达到氯仿处理结果的水平，且与氯仿纯化试剂相比毒副作用更小，更易处理且对环境污染的风险性更低。

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于口蹄疫疫苗146S抗原含量检测的标准抗原、及其制备方法和应用，属于生物制品领域。

背景技术

口蹄疫(Foot-and-Mouth Disease，FMD)是由口蹄疫病毒引起的一种急性、热性、高度接触传染性的动物疫病，对各国的畜牧业有着巨大的危害。目前，口蹄疫的防控措施主要是以广泛的大面积免疫预防为主，配合以扑杀疫区内的病畜和易感动物并在周围10公里范围内进行环形预防注射。

我国生产的口蹄疫疫苗基本上都是常规灭活疫苗，其制造工艺主要是用转瓶单层传代细胞培养法或悬浮培养法生产制苗用抗原，用二乙烯亚胺(BEI)对病毒进行灭活，利用油佐剂乳化配制疫苗。由于常规口蹄疫灭活疫苗生产中疫苗效力检验的关键作用，同时常规口蹄疫灭活疫苗作为当前控制口蹄疫疫病的主要武器，其安全有效的质量是防控口蹄疫的重要保障，因此如何更好的加强疫苗质量控制和相应的检测技术的研究直接关系到口蹄疫疫病防控的成功。

146S病毒粒子是口蹄疫的主要免疫抗原，生产过程中这种病毒粒子的降解会导致疫苗免疫效力的下降。而传统的监测方法不能准确定量口蹄疫疫苗中146S的含量。近年来利用蔗糖密度梯度离心后定量口蹄疫病毒液中的146S含量作为检测口蹄疫抗原含量的方法正逐渐被业内专家接受并认可，但由于缺少一套稳定的标准抗原的制备和保存方法，同时使用常规的灭活口蹄疫疫苗形式保存的146S标准抗原当检测含量时必须破乳后再进行检测，而破乳环节会一定程度破坏口蹄疫抗原液中的抗原成分，造成检测不准确，导致不同机构和口蹄疫生产厂家的检测结果间往往差异较大。因此如何稳定地制备标准抗原和在不使用乳化剂的条件下实现标准抗原的稳定保存，以提高后续检测结果准确性，是急需解决的问题。

专利申请CN102998378A公开了一种定量检测口蹄疫抗原146S的方法，该检测方法没有阳性对照，其存在批间检测无法矫正的缺点。

专利申请CN104491855A公开了一种大规模制备口蹄疫全病毒颗粒疫苗的方法，其存在过程控制困难，批间重复不稳定的缺点，且其针对口蹄疫疫苗生产设计，只适用于大规模生产。

因此，现实生产中缺少一种针对用于口蹄疫疫苗146S含量检测的标准抗原的、小规模的制备方法，其可以在制备口蹄疫全病毒颗粒疫苗中作为阳性对照使用，且其使得产品批间差异小，保证制备过程中抗原含量批间重复性，从而使得结果稳定。

此外，在现有实验室纯化口蹄疫抗原过程，经常使用氯仿作为纯化试剂，其存在毒副作用大，存在对操作人员健康的不利影响和对操作安全设备的要求较高，且在后续处理时会污染环境，由于氯仿还属于公安部门的管制药品，生产企业采购、储藏、使用、管理都有极为严格的限制，经常会给抗原的制备带来不便。因此，需要提供一种使用替代的纯化试剂纯化口蹄疫抗原方法，以降低制备过程中试剂的毒性和腐蚀性，简化制备程序和保证操作安全。

发明内容

本发明涉及一种口蹄疫疫苗146S含量检测的标准抗原制备方法，所述方法在纯化过程中采用了二氯甲烷作为纯化试剂，纯化效果能达到氯仿处理结果的水平，且与氯仿纯化试剂相比毒副作用更小，更易处理且对环境污染的风险性更低。

本发明涉及一种口蹄疫疫苗146S含量检测的标准抗原制备方法，其使用超滤管浓缩抗原，其抗原损失率大大降低且批间差最小最稳定，为制备定量口蹄疫标准抗原提供了有利的含量稳定性保障。

本发明涉及口蹄疫疫苗146S含量检测的标准抗原制备方法，其使用的保护剂保证了口蹄疫抗原在常温不易降解，使得在后续使用中口蹄疫标准抗原无需处理可直接上样检测，减少了操作误差，保障了结果的稳定性。

本发明制备146S检测用标准抗原。为146S灭活疫苗的检测提供阳性对照，可以矫正批间检测差异。

1、本发明的专门针对检测用口蹄疫标准抗原的纯化方法，比生产制备方法平行性更好，生产的抗原更纯。

2、本发明的抗原保护剂可在常温条件下有效保护抗原，抗原保存方法创新。标准抗原不含佐剂，检测146S标准抗原时不用破乳，所以不会带来抗原损失，检测结果与抗原含量真实值接近。

附图说明

图1为含有4％明胶保护剂的O XJ 10-11F9株灭活抗原在4℃保存14天后HPLC测定146S抗原含量图；

图2为含有15％甘油保护剂的O XJ 10-11F9株灭活抗原在4℃保存14天后HPLC测定146S抗原含量图；

图3为含有10％蔗糖保护剂的O XJ 10-11F9株灭活抗原在4℃保存14天后HPLC测定146S抗原含量图；

图4为含有本发明保护剂的O XJ 10-11F9株灭活抗原在4℃保存14天后HPLC测定146S抗原含量图。

具体实施方式

以下，对本发明的实施方式进行说明。

本发明涉及一种用于口蹄疫疫苗146S含量检测的标准抗原制备方法，所述方法包括以下步骤：步骤(1)使用传代细胞接种口蹄疫病毒，培养口蹄疫病毒；步骤(2)对所述培养口蹄疫病毒进行浓缩；步骤(3)使用二氯甲烷对所述步骤(2)中所述浓缩后的口蹄疫病毒液进行抽提纯化，二氯甲烷浓度为4％-6％，室温下搅拌后静置过夜，离心，收集上清液；步骤(4)对所述步骤(3)纯化后的口蹄疫病毒上清液进行灭活；以及步骤(5)对所述步骤(4)灭活的口蹄疫病毒液超滤离心，收获超滤离心后的口蹄疫病毒沉淀，使用缓冲液回溶得到所述口蹄疫疫苗146S标准抗原。

由于氯仿具有较强毒性，在用于蛋白纯化时对操作安全设备要求较高，纯化后的废液需要进一步处理，且属于公安部门管制药品，本发明使用二氯甲烷替代氯仿进行蛋白纯化，降低了纯化过程对操作人员健康的不利影响和对操作安全设备的要求，当使用二氯甲烷用于口蹄疫抗原纯化，能够避免在纯化过程使用氯仿，毒性、挥发性、腐蚀性都低，因此对产品、设备、操作人员的损害都降低；还能保证生产中原料的正常供应，保障生产的持续进行。

作为本发明的一种实施方式，本发明所述的标准抗原制备方法中，所述步骤(3)使用浓度为4％的二氯甲烷进行抽提纯化。

本发明人发现，当使用4％的二氯甲烷代替2％的氯仿，纯化效果相当，其对杂蛋白的去除效率相近。

作为本发明的一种实施方式，本发明所述的标准抗原制备方法中，所述步骤(1)中口蹄疫病毒包括牛O型ONXC/92株、牛Asia1/JSL/GSZY/06株、Mya98-XJ-2010株或猪O型0/ZK/93株；所述传代细胞包括BHK-21细胞；感染复数MOI为0.05，培养24-28h收获病毒液，所述收获病毒液经冻融处理，并离心除去细胞碎片。

口蹄疫病毒ONXC/92株、Asial/JSL/GSZY/06株，0/Mya98/XJ/2010和0/GX/09-7毒株均购自中国农业科学院兰州兽医研究所。本发明所述的标准抗原制备方法，可以应用本领域的公知的生产用毒株进行制备，包括但不限于牛O型ONXC/92株、牛Asia1/JSL/GSZY/06株、Mya98-XJ-2010株或猪O型0/ZK/93株；制备所用的传代细胞可以使用本领域公知的传代细胞或原代细胞，包括但不限于BHK-21细胞。

作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述的标准抗原制备方法中，所述步骤(1)中所述收获病毒液经冻融处理，7000rpm离心，10℃连续离心60min除去细胞碎片。

作为本发明的一种实施方式，本发明所述的标准抗原制备方法中，所述步骤(2)浓缩步骤用中空纤维超滤系统对所述步骤(1)中培养的口蹄疫病毒液进行超滤，中空纤维柱截留分子量为60kd-500kd，进行10倍超滤。

本发明的制备口蹄疫病毒标准抗原的方法，使用超滤膜纯化口蹄疫抗原浓缩纯化，该方法保证了损失率恒定，批间重复性好，解决了口蹄疫灭活疫苗检测标准抗原批间不稳定的问题。

作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述的标准抗原制备方法中，中空纤维柱为截留分子量80kd的PVDF。

作为本发明的一种实施方式，本发明所述的标准抗原制备方法中，所述步骤(3)加入二氯甲烷后在室温下搅拌4小时，所述静置过夜的病毒液经高速冷冻离心机4℃离心。

作为本发明的一种实施方式，本发明所述的标准抗原制备方法中，所述步骤(4)中使用1％二乙烯亚胺，于30℃灭活28小时，然后使用2％硫代硫酸钠进行37℃阻断2小时。

作为本发明的一种实施方式，本发明所述的标准抗原制备方法中，所述步骤(5)将所述阻断的口蹄疫病毒液样加入到100kd超滤离心管，4℃低速水平离心机离心，3500rpm离心40min。

作为本发明的一种实施方式，本发明所述的标准抗原制备方法中，所述缓冲液为含有保护剂的TEN缓冲液；所述保护剂由以下浓度的组分组成：海藻糖3-15g/L、pvp5-30g/L、硫脲5-60g/L、EDTA-Na₂10-100g/L、蔗糖40-120g/L、山梨醇50-300g/L。

本发明所述的标准抗原加入的保护剂保证了抗原稳定性，使用的保护剂能保证146S病毒粒子的完整性，使得146S病毒粒子不需要乳剂的形式保存，检测含量时不需要破乳后再进行检测，不会破坏抗原液中的抗原成分，保证了检测的准确性。

作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述的标准抗原制备方法中，所述保护剂由以下组分组成：海藻糖7.5g/L、聚乙烯吡咯烷酮10g/L、硫脲20g/L、EDTA20g/L、蔗糖60g/L、山梨醇100g/L。

本发明还涉及所述的标准抗原制备方法制备的用于口蹄疫疫苗146S含量检测的标准抗原。

本发明的标准抗原为制备的146S灭活疫苗的检测提供阳性对照，可以矫正批间检测差异，为不同生产商和不同检测机构之间的检测结果提供依据。

本发明还涉及所述的标准抗原在检测口蹄疫疫苗146S抗原含量中的应用。

本发明所述的标准抗原在用于检测口蹄疫疫苗146S抗原含量时，能使口蹄疫抗原146S检测批间检测可以矫正。

本发明标准抗原的制备方法与现有技术相比有创造性改变，二氯甲烷代替氯仿更安全，超滤膜使用使损失率稳定。本发明标准抗原中抗原保护剂的研制解决了口蹄疫抗原保存问题，与成品疫苗相比，保护剂保存的抗原可以直接检测无损失，成品疫苗破乳会造成抗原损失并且损失不恒定。

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

以下实施中使用ONXC/92株和Asia1/JSL/GSZY/06株进行具例说明本发明，然而，本发明的制备方法可以用于口蹄疫病毒其他毒株抗原的制备，这些毒株包括但不限于口蹄疫病毒A型、O型、亚I型、C型、SAT1-3型以及Asia1型血清型、和其亚型、拓扑型。

实施例1使用二氯甲烷代替氯仿用于蛋白抗原纯化实验以及使用浓度的确定

本实施例旨在确定二氯甲烷代替氯仿用于蛋白抗原纯化及确定二氯甲烷工作浓度。

1.1试剂和实验器材

试剂和材料：氯仿、二氯甲烷

实验器材：考马斯亮蓝、磁力搅拌器、低温高速离心机、紫外分光光度仪、液相色谱仪、离心管、注射器。

1.2病毒液的制备

BHK21悬浮培养直到细胞密度达4.5×10⁶/ml，接种ONXC/92株口蹄疫病毒，感染复数为MOI0.05。培养28h收获病毒液，7000rpm，10℃连续离心60min，除去细胞碎片，收获病毒的细胞培养液。

1.3使用氯仿和不同浓度的二氯甲烷去除杂蛋白以及二氯甲烷工作浓度的确定

分别取6组，每组50ml的病毒液样品于100ml试剂瓶中，按表1编号加入各自对应的纯化试剂和加入量，室温下搅拌混匀4h，4℃静置过夜。分别吸取上清样10ml，编号为H1-H6，留样待测。

表1各纯化组编号和加入试剂最终浓度、加入量

将上述静置过夜的处理液于7000rpm，4℃离心15min。分别收集上清液编号1-6。将上清液1-6加入1％二乙烯亚胺，30℃灭活28小时后用2％硫代硫酸钠37℃进行阻断2小时，使用分光光度法检测146S含量。

将上清液H1-H6加入1％二乙烯亚胺，30℃灭活28小时后2％硫代硫酸钠37℃进行阻断2小时,检测蛋白含量。处理后灭活病毒液作为实验样品参照《中国兽药典》(2010年版三部)附录中Lowry法测定总蛋白含量，核酸含量测定参照《中国兽药典》(2010年版三部)附录中分光光度计法测定标准测定。两组上清液的检测结果见表2。

表2使用试剂纯化前蛋白含量和纯化后146S含量测定结果

从表2的测定结果可见，使用4％～6％二氯甲烷的纯化试剂对病毒液中146S含量影响小，与生产中使用的2％氯仿的纯化试剂的效果相当，其对杂蛋白的去除效率与2％氯仿较接近。且二氯甲烷毒性和腐蚀性均低，减少了生产操作过程对生产人员健康的不利影响，以及对产品、设备的腐蚀，并减少后续的废液处理步骤，降低了生产成本。

因此，选择使用终浓度4％的二氯甲烷作为后续标准抗原制备中的纯化试剂。

实施例2口蹄疫标准抗原保护剂组分的优化

BHK21悬浮培养至到细胞密度达到高于4.5×10⁶/ml，接种ONXC/92株口蹄疫病毒，感染复数为MOI0.05。培养28h收获病毒液，7000rpm，10℃连续离心60min，除去细胞碎片，收获病毒的细胞培养液。

用截留分子量为80kd的PVDF中空纤维浓缩当浓缩液体积为原液1/10体积时,收集中空纤维超滤系统的浓缩液。

向口蹄疫病毒离心上清液中加入抽提试剂分析纯二氯甲烷，使抽提试剂终浓度为4％，室温下搅拌4小时后静置过夜。将静置过夜的病毒液经高速冷冻离心机4℃离心，收集上清液，合并上清液。

上清液加入1％二乙烯亚胺，30℃灭活28小时后2％硫代硫酸钠进行37℃阻断2小时，制成阻断样。

将阻断样加入到100kd超滤离心管，4℃低速水平离心机离心，3500rpm离心40min，弃掉上清液。

保护剂各组分物质根据各自溶解特性分别溶解在的TEN缓冲液中，所得溶液于25℃混合，调节PH值至7.2，使各组保护剂中不同组分含量如表3所示，并加入至100kd超滤离心管5ml充分溶解标准抗原即得最后的标准抗原。

加入不同保护剂的标准抗原分别在4℃、25℃和37℃条件下放置一定时间后检测标准抗原146S含量。不同组分的保护剂组成、处理条件和最后的标准抗原146S含量结果见表3。结果显示第一组的保护剂对于抗原成分在不同处理条件下的保护效果均最优。

表3不同组分的保护剂、处理条件和最后的标准抗原146S含量检测结果

因此，确定标准抗原146S使用的保护剂最佳组成为：海藻糖7.5g/L、聚乙烯吡咯烷酮10g/L、硫脲20g/L、EDTA 20g/L、蔗糖60g/L、山梨醇100g/L。其能在4℃条件下可以在近一年的时间将抗原含量保持在一定的水平，即便在室温也可以将在40天内将抗原含量保持在稳定的水平。

实施例3口蹄疫ONXC/92株和Asia1/JSL/GSZY/06株灭活二价疫苗146S含量检测的标准抗原的制备

3.1标准抗原的制备

BHK21悬浮培养直到细胞密度达4.5×10⁶/ml,分别接种ONXC/92株和Asia1/JSL/GSZY/06株口蹄疫病毒，感染复数为MOI0.05。培养28h收获病毒液，7000rpm，10℃连续离心60min，除去细胞碎片，分别收获病毒的细胞培养液。

用截留分子量为80kd的PVDF中空纤维柱浓缩，当浓缩液体积为原液1/10体积时,收集中空纤维超滤系统的浓缩液。

向口蹄疫病毒离心上清液中加入抽提试剂分析纯二氯甲烷，使抽提试剂中二氯甲烷终浓度为4％，室温下搅拌4小时后静置过夜。将静置过夜的病毒液经高速冷冻离心机4℃离心，收集上清液，合并上清液。

上清液加入1％二乙烯亚胺，30℃灭活28小时后2％硫代硫酸钠进行37℃阻断2小时，制成阻断样。

将阻断样加入到100kd超滤离心管，4℃低速水平离心机离心，3500rpm离心40min，弃掉上清液，得到标准抗原。

按照实施例2确定的保护剂组分，将保护剂各组分物质根据各自溶解特性分别溶解在的TEN缓冲液中，所得溶液于25℃混合，调节PH值至7.2，使各单一保护剂组分含量实施例2所确定的，并加入至100kd超滤离心管5ml充分溶解标准抗原即得。

3.2二价疫苗的制备

将3.1中所制备的ONXC/92株和Asia1/JSL/GSZY/06株标准抗原按照1:1的体积比混合均匀。3.3标准抗原中成分的检测结果

3.3.1标准抗原纯化后蛋白含量及核酸含量的比较

取处理前病毒与处理后灭活病毒液作为实验样品参照《中国兽药典》(2010年版三部)附录中Lowry法测定总蛋白含量、核酸含量测定参照《中国兽药典》(2010年版三部)附录中分光光度计法测定标准测定，测定结果见表4：

表4抗原纯化后蛋白含量及核酸含量的比较

3.3.2抗原纯化前后内毒素含量比较

抗原处理前后采用动态浊度法测定内毒素含量，结果显示内毒素去除效果显著，内毒素含量结果见表5：

表5抗原纯化前后内毒素含量

抗原液内毒素含量(EU/ml)ONXC/92病毒原液83.6ONXC/92病毒原液纯化抗原5.6Asia1/JSL/GSZY/0679.2Asia1/JSL/GSZY/06纯化抗原6.2二价灭活纯化抗原5.8

3.3.3 BHK21宿主蛋白检测

参照专利检测方法CN103792366B《口蹄疫疫苗宿主蛋白双抗夹心酶联免疫检测试剂盒及其使用方法》测定抗原处理前后BHK21蛋白残留情况。检测结果见表6，结果显示，经过处理后BHK21宿主蛋白含量大大减少。

表6抗原纯化前后BHK21宿主蛋白检测

抗原液BHK21宿主蛋白含量(ug/ml)ONXC/92病毒原液768ONXC/92病毒原液纯化抗原118Asia1/JSL/GSZY/06688Asia1/JSL/GSZY/06纯化抗原82二价灭活纯化抗原92

3.3.4抗原纯化后安全性检验

使用豚鼠、小白鼠、仔猪作为实验动物参照《中国兽药典》(2010年版三部)猪口蹄疫(O型)灭活疫苗安全检验方法检验纯化抗原安全性。安全性检验结果见表7，结果显示，本发明方法制备的抗原安全性好。

表7纯化后抗原安全性检验

3.3.5标准抗原含量平行性检验

同批抗原经三次独立平行测定146S含量，检验标准抗原含量是否多次检测结果平行。检验方法参照专利CN1029988378A方法检测。含量平行性检验结果见表8，结果显示，本发明方法制备的抗原含量平行性好。

表8标准抗原含量平行性检验

实施例4口蹄疫标准抗原稳定性检测

4.1口蹄疫O型和Asia1型灭活二价疫苗146S含量检测的标准抗原的制备

制备方法同实施例3中3.1的制备方法。

4.2结果检测

通过安全性检测、不同冻融次数后抗原稳定性对比、保护剂用量抗原稳定效果对比综合评判加入保护剂后抗原稳定性的效果。

4.2.1抗原纯化后安全性检验:

使用豚鼠、小白鼠、仔猪作为实验动物参照《中国兽药典》(2010年版三部)猪口蹄疫(O型)灭活疫苗安全检验方法检验纯化抗原安全性。结果见表9，结果显示，本发明方法制备的标准抗原对不同实验动物安全性均好。

表9标准抗原安全性检验

4.2.2不同冻融次数后抗原稳定性对比

标准抗原于-70℃冰箱中存放，然后于室温至完全融化为一次冻融，连续冻融十次，检测不同冻融次数后146S含量，结果见表10，结果显示，本发明方法制备的标准抗原经不同冻融次数后(10次以内)抗原稳定性均能保证。

表10不同冻融次数后抗原稳定性比较

4.2.3保护剂用量抗原稳定效果对比

使用实施例2中确定的抗原保护剂的含量为基准，不同保护剂用量、在37℃，24h后测定146S含量，结果见表11，结果显示，本发明方法制备的标准抗原在1～5倍量的保护剂用量范围内抗原稳定性均能保证。

表11保护剂用量抗原稳定效果对比

实施例5抗原保护剂保护效果对比实验

本实施例旨在对照本领域常规抗原保护剂，说明本发明抗原保护剂对口蹄疫146S抗原保护效果。

5.1实验材料和试剂、仪器

实验材料：口蹄疫OXJ 10-11F9株病毒液阻断样

仪器：LC600UV检测系统、超速离心机

试剂：15％明胶溶液、75％甘油、45％的蔗糖溶液、本发明实施例2制备的保护剂(组分：海藻糖7.5g/L、聚乙烯吡咯烷酮10g/L、硫脲20g/L、EDTA 20g/L、蔗糖60g/L、山梨醇100g/L)

5.2实验步骤

按照15％明胶溶液、75％甘油、45％的蔗糖溶液的不同保护剂组成成分和含量配制各保护剂溶液，高压灭菌备用。

在口蹄疫OXJ 10-11F9株病毒原液阻断样加入不同的保护剂，如表12中的相应浓度，制成含不同保护剂的抗原样品。

表12不同保护剂组成成分和含量

将按照上述步骤制备的1～4号样品置于4℃冰箱中保存14天。

将保存的1～4号样品分别混匀后，取2.5ml上样。

配平离心管，35000rpm，10℃蔗糖密度梯度离心3h，使用HPLC测定146S峰。

计算峰面积，测定各样品中146S含量。各样品HPLC测定146S含量图谱见图1～4，从图1～3中可见，样品1～3编号峰型破坏无法计算含量，而样品4中146S峰型完整，具体数据和计算含量见表13：

表13样品1～4(本发明保护剂保存抗原)HPLC含量测定

因此，本发明保护剂能长时间将标准抗原中146S保持病毒粒子形态，维持稳定的含量。

以上所述仅是本发明的优选实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽然本发明已以优选实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。