一种MiT家族易位性肾细胞癌的新融合基因及其检测引物和应用

摘要

本发明公开了一种MiT家族易位性肾细胞癌的新融合基因及其检测引物和应用。所述的基因为PRCC‑MITF融合基因，由PRCC外显子5和MITF外显子4融合形成。一种检测PRCC‑MITF易位性肿瘤的PCR引物,上游引物如SEQ ID NO.1所示，下游引物如SEQ ID NO.2所示。本发明针对高通量测序发现的新融合基因设计了特异性的PCR引物，扩大了原有检测手段的检测范围，应用于临床，可提高诊断MiT家族易位性肾细胞癌的检出率和准确率。为诊断分型及分子靶向治疗提供依据。

说明书

技术领域

本发明属于医学检验领域，涉及一种MiT家族易位性肾细胞癌的新融合基因及其检测引物和应用。

背景技术

2016年新版WHO肾脏肿瘤病理组织学分类新增了一种肾细胞癌类型：MiT家族易位性肾细胞癌。MiT家族是小眼畸形转录因子家族(microphthalmia-associated transcription factor family)的缩写，该家族成员包括MITF，TFE3、TFEB和TFEC基因。

目前已经发现的MiT家族易位性肾细胞癌包括Xp11.2易位/TFE3基因融合相关性肾细胞癌和t(6；11)(p21；q12)易位/TFEB基因融合相关性肾癌。MITF和TFEC基因易位的肿瘤在世界范围内暂无文献报道。

MiT家族易位性肾细胞癌致病机理清晰明确，MiT家族成员基因(TFE3/TFEB)的易位是其关键致病因素：这类肿瘤均涉及MiT家族成员基因同其它染色体易位及其所致形成融合基因，通过启动子变换从而高表达TFE3/TFEB融合蛋白，而TFE3/TFEB作为一个转录因子，通过与特异的DNA结构相结合，转录调控体内多种基因表达最终致病。目前至少有10种不同的易位伴侣和融合基因被报道，包括ASPL-TFE3、PRCC-TFE3、SFPQ-TFE3、NONO-TFE3、CLTC-TFE3、LUC7L3-TFE3、KHSRP-TFE3、PARP14-TFE3、DVL2-TFE3、RBM10-TFE3和MALAT1-TFEB等，每例肿瘤内仅存在单一的易位形式。

MiT家族易位性肾细胞癌是一罕见类型肿瘤，TFE3基因易位性肾癌约占所有肾细胞癌的1.6％-4％，TFEB基因易位性肾癌相对更加罕见。但该疾病以发病年龄轻为突出特征，占儿童肾细胞癌的40％，且造成极其沉重的家庭及社会负担。此外，有明确证据表明MiT家族易位性肾细胞癌的患者对血管内皮生长因子受体(vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR)或哺乳动物雷帕霉素(mammalian target of rapamycin，mTOR)分子靶向治疗敏感。另有研究表明，MET酪氨酸激酶为ASPL-TFE3融合基因的靶基因，并有望成为TFE3易位性肿瘤的治疗靶点。因此，精确诊断此类肿瘤显得十分重要。

本发明团队通过高通量测序技术，在一例形态学符合MiT家族易位性肾细胞癌特征的病例中检测出PRCC-MITF融合基因，该融合基因型为首次发现，国内外均无报道，且这是国际首次发现MITF基因易位相关性肾细胞癌。

目前高通量测序是唯一可以明确未知易位位点的检测手段，然而高通量测序费用高昂，检测周期长，检测平台稀缺，对样品质量要求高，不利于普及推广，对于大多数患者来说也不是首选检测手段。依赖以往经验，针对已知的融合位点设计特异性的PCR引物组合，对肿瘤组织中提取出的RNA逆转录之后进行PCR扩增并测序，检测融合基因具体易位位点，是最准确、便捷、经济的方法。因此，发现新的致病融合位点，进而设计PCR引物将有利于MiT家族易位性肾细胞癌检测准确度的进一步提高。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种MiT家族易位性肾细胞癌的新融合基因。

本发明的另一目的是提供该新融合基因的检测引物。

本发明的又一目的是提供引物的应用。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

一种PRCC-MITF融合基因，由PRCC外显子5和MITF外显子4融合形成。MITF、PRCC基因序列来自GeneBank，序列版本号GRCh38.p7,PRCC transcript_id＝"XM_005245313.1",MITF transcript_id＝"NM_198159.2""。

所述的MiT家族易位性肾细胞癌的新融合基因优选包含SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。

本发明所述的MiT家族易位性肾细胞癌的新融合基因在制备PRCC-MITF易位性肿瘤诊断试剂中的应用。

一种检测PRCC-MITF易位性肿瘤的PCR引物，为检测本发明所述的PRCC-MITF基因易位的PCR引物。所有能够检测本发明所述PRCC-MITF基因易位的引物对均在本发明的保护范围内。

针对本发明找到的新的融合基因，我们在PRCC的5号外显子和MITF的4号外显子内分别设计引物。遵循引物设计原则，引物最好在模板cDNA的保守区内设计，引物长度在15bp-30bp之间，引物GC含量在40％～60％之间，退火温度最好接近72℃，引物自身及引物之间不应存在互补序列，扩增条带单一特异。由于工作中经常需要在石蜡固定标本中开展工作，石蜡标本RNA碎裂严重，因此扩增产物不宜过长，需要控制在300bp以下。

经过多次调试和验证，最终设计的引物序列为：PRCC-E5-F：TACAGTGGTGGCTACTATCCT(SEQ ID NO.1)；MITF-E4-R:CGCTCGTGAATGTGTGTT(SEQ ID NO.2)，理论扩增产物长162bp，扩增产物(融合基因)的全部序列如下：TACAGTGGTGGCTACTATCCTGCACAGGACCCGGCCCTGGTCCCCCCCCAGGAAATTGCCCCAGATGCCTCCTTCATCGATGACGAAGCAGGATTTTATAAGTTTGAAGAGCAAAACAGGGCAGAGAGCGAGTGCCCAGGCATGAACACACATTCACGAGCG(SEQ ID NO.3)。经实验验证，该引物可成功扩增出目的条带，条带单一、特异。

本发明所述的PCR引物在制备PRCC-MITF易位性肿瘤诊断试剂中的应用。

一种PRCC-MITF易位性肿瘤诊断试剂盒，包括本发明所述的PCR引物。

有益效果：

本发明针对高通量测序发现的新融合基因设计了特异性的PCR引物，扩大了原有检测手段的检测范围，应用于临床，可提高诊断MiT家族易位性肾细胞癌的检出率和准确率。为诊断分型及分子靶向治疗提供依据。根据我们的实验结果，该引物组合诊断的特异性和敏感性均达到了100％，且操作对象只需要在石蜡包埋组织切片上进行，时间仅为三个工作日。采用本发明提供的探针组合进行检测PRCC-MITF易位性肿瘤，不但方便、快速、可靠而且检出率高，可用于制备PRCC-MITF易位性肿瘤诊断试剂盒，为PRCC-MITF易位性肿瘤的快速准确的诊断提供了新的工具。

附图说明

图1：在已知PRCC-MITF融合型肿瘤中应用本发明引物组合进行验证，成功检出的PRCC-MITF融合基因测序图。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。

实施例1针对明确诊断的病例进行验证：

本发明团队通过高通量测序技术，在一例形态学符合MiT家族易位性肾细胞癌特征的病例中检测出PRCC-MITF融合基因,发现该基因由PRCC外显子5和MITF外显子4融合形成。对于这例高通量测序RNA-seq检测出PRCC exon5-MITF exon4新融合基因的病例，使用我们设计的引物进行验证。

一、RNA的提取：

严格按照RNeasy FFPE Kit操作说明进行提取。①脱蜡：将收集好的玻片进行二甲苯脱蜡，再用无水乙醇漂洗，风干后用手术刀片刮下来装入1.5ml EP管中；②酶解：加入150μl消化液,再加入10μl蛋白酶K，混匀，56℃酶解15min,80℃15min，冰上冷却；③加入16μl DNDNA酶缓冲液,再加入10μl DNase I,混匀，室温静置15mimin,12000rpm离心15min，取上清；④加入320μl结合液液再加入720μl无水乙醇，混匀，分2次转移至吸附柱中，8000rpm离心1min，，弃废液；⑤洗涤：加入500μl洗涤液,8000rpm离心1min；重复洗涤一次，弃废液，将吸附柱转移到一个新的2ml收集管中，12000rpm离心5min；⑥洗脱：将吸附柱转移到1.5ml的EP管中，加入100μl的洗脱液，室温静置1min,12000rpm离心1min，将收集好的洗脱液(即DNA提取液)进行浓度和纯度测定，-80℃保存存待用。

二、逆转录PCR RT-PCR

采用试剂盒(K1622，RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit，MBI)对RNA进行逆转录，方法详见试剂盒说明。PCR扩增引物为本专利PRCC-MITF融合基因引物组合。反应体系包括：0.125μl TaKaRa Ex Taq^TMHS液，2.5μl>2+plus)，2μl>

结果：使用本发明引物PCR后可见单一特异的电泳条带，对扩增产物进行测序，得到PRCCexon5-MITF exon4融合基因序列(图1)，证明本项目设计的引物组合可靠且敏感。

实施例2针对对照组病例进行检测

我们对30例诊断明确的对照组病例(包括10例透明细胞性肾细胞癌，5例乳头状肾细胞癌，5例嫌色细胞性肾细胞癌，5例TFE3易位相关性肾细胞癌和5例TFEB易位相关性肾癌，理论上均不存在MITF基因易位)使用本发明的引物组合进行检测，RNA提取、逆转录PCR和测序方法同上。

结果：使用本发明设计引物组合检测，未检测出PRCC-MITF融合基因，证明本项目设计的引物特异性高。

评价：本发明引物组合是对原有MiT家族易位性肾细胞癌融合基因引物的补充，扩展了MiT家族易位性肾细胞癌融合基因的类型，增加了RT-PCR方法诊断该肿瘤的检出率。

<110> 中国人民解放军南京军区南京总医院

<120> 一种MiT家族易位性肾细胞癌的新融合基因及其检测引物和应用

<160> 3

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物PRCC-E5-F

<400> 1

tacagtggtg gctactatcc t 21

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物MITF-E4-R

<400> 2

cgctcgtgaa tgtgtgtt 18

<210> 3

<211> 162

<212> DNA

<213> 人类

<220>

<223> PRCC-MITF融合基因片段

<400> 3

tacagtggtg gctactatcc tgcacaggac ccggccctgg tcccccccca ggaaattgcc 60

ccagatgcct ccttcatcga tgacgaagca ggattttata agtttgaaga gcaaaacagg 120

gcagagagcg agtgcccagg catgaacaca cattcacgag cg 162