同时检测奶牛β‑酪蛋白不同变体型的一组专用引物及其试剂盒

摘要

本发明公开了同时检测奶牛β‑酪蛋白不同变体型的一组专用引物及其试剂盒，属于分子生物学检测技术领域。该方法基于牛β‑酪蛋白不同变体型的SNP位点信息，设计特异性引物进行多重PCR扩增出SNP位点所在片段，再在每个SNP位点一侧设计2条特异性检测探针，在另一侧设计1条与模板完全匹配的荧光标记探针，进行多重连接酶检测反应，当两侧的探针与目的DNA序列完全互补时链接反应才能进行，根据链接反应所产生的片段长度实现对SNP位点检测的目的。该检测方法操作便捷、通量高、成本低、准确性高，可以早期快速、准确的筛选纯合A2型奶牛，能够产生巨大的经济和社会效益。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术的分子生物学检测技术领域，具体涉及一种同时检测奶牛β-酪蛋白 A1、A2、A3、B、C、E、F、H1和I变体型的引物、方法及其试剂盒。

背景技术

鲜牛奶是仅次于人类母乳的营养成分最全面、营养价值最高的液体食品，它含有很多人体必需的氨基酸，被誉为“白色血液”。蛋白约占牛奶比重的3.4％，酪蛋白和乳清蛋白是牛奶的主要两种蛋白，其中，酪蛋白约占牛奶蛋白的80％，包括alpha s1，alpha s2，beta，kappa 四种类型，而beta酪蛋白(β酪蛋白)约占蛋白质总量的30％，是氨基酸的重要来源。β- 酪蛋白中含有209个氨基酸，而它至少含有13种不同的氨基酸组成，研究报道β-酪蛋白有 A1、A2、A3、B、C、D、E、F、H1、H2、I、G等遗传变体型。

牛奶对人体的生长发育非常重要，但有的人一喝牛奶就拉肚子。这是什么原因引起的呢？营养专家认为这是因为牛奶中含有乳糖，而有的人又缺乏消化乳糖的酶，该症状也被称为“乳糖不耐症”。但近些年，国内外研究证明A1、B和C等变体型β-酪蛋白是引起人喝牛奶后腹痛、拉肚子等症状的又一重要原因。通过蛋白氨基酸序列分析，发现其区别主要在于β-酪蛋白基因发生了一个碱基变化，从而导致相应位置氨基酸由脯氨酸变成组氨酸。由于该氨基酸的变化，导致牛奶在消化过程中消化酶可在其组氨酸处特异性水解，产生一种由七个氨基酸组成的肽段，被称为β-酪啡肽(BCM-7)。而A2和A3等变体型β酪蛋白此处氨基酸为脯氨酸，不能够被相关酶特异性水解，因此不能够形成BCM-7。现已发现，BCM-7能穿过胃肠壁进入血液循环，影响人的消化系统和免疫细胞，并与一些疾病有关，如Ⅰ型糖尿病、消化系统疾病、免疫功能紊乱、呼吸功能障碍和突然性婴儿死亡综合征等。

目前，新西兰A2有限公司掌握着A2型β-酪蛋白的筛选检测技术，并已在中国的京东和淘宝等大型互联网电商平台销售a2Platinum白金婴幼儿配方奶粉系列产品，也在积极拓展在北美及亚洲的其他国际市场。乳业是一个国家发达程度和食品消费水平的重要标志，未来乳业将更加注重质量型的发展，A2奶将会更多地受到消费者的青睐。因此，开展适合国内A2 型β-酪蛋白荷斯坦牛种质创新关键技术的研究，定向培育具有A2型的荷斯坦优质种子母牛和种公牛，加大A2奶的市场供应，对提升中国乳业行业发展具有重要的意义和推动作用。因此，有必要建立一种准确、快速、低成本区分不同变体型β-酪蛋白奶牛的方法。

检测牛乳蛋白多态性的方法主要分为蛋白和分子水平进行分析。在蛋白水平检测方面，刘建新等人(高效液相色谱法分析中国荷斯坦奶牛乳蛋白多态性，《中国食品学报》第12卷第10期，2012年)报道了通过反向高效液相色谱法分析中国荷斯坦奶牛乳蛋白多态性的方法，并成功检测了牛乳中包括A1、A2、A3、B、C、D、E多种分型的β-CN，从而为比较不同地区奶牛的差异和牛乳的加工选择提供科学依据。在分子水平检测方面，中国发明专利CN105219839A和CN105018582A均公开了一种检测β-酪蛋白基因型的方法，是利用特异性引物进行PCR，扩增片段经限制性内切酶酶切后，经琼脂糖凝胶电泳的条带结果进行A1和 A2型的β-酪蛋白分型，发明人前期也研究过该类方法(CN105925717A)，发现该方法成本较高、假阳性率高(后期仍需要进行测序确认)、检测通量小，只能区分A1和A2两种β-酪蛋白型；而CN105018581A公布的一种基于测序法检测β-酪蛋白基因型的方法，该方法通过 PCR扩增基因部分序列片段，仍只能区分有限的几种β-酪蛋白基因型，DNA直接测序的方法虽然准确性好但其应用成本较高；中国发明专利CN105861671A公开的方法也只是针对A1 和A2两种β-酪蛋白型进行检测，同时需要利用质谱仪进行检测，检测过程复杂、成本较高。

发明内容

针对上述现有技术，发明人为了更准确、高效的评估奶牛的β-酪蛋白不同变体型，经过仔细的甄别筛选和大量的试验，得到了能够用于同时检测β-酪蛋白不同变体型(A1，A2， A3，B，C，E，F，H1，I)的一组专用高效引物及其试剂盒。所述检测方法及其试剂盒的特异性强、灵敏度高，能够快速、准确的检测不同β-酪蛋白变体型奶牛，而且可以一次实验同时检测几百份奶牛样品，通量高。

具体的，本发明涉及以下技术方案：

首先，本发明的目的之一在于提供同时检测奶牛β-酪蛋白不同变体型的一组专用引物，包括多重PCR扩增引物和多重连接酶检测反应探针，

所述多重PCR扩增引物的序列如SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:4所示；多重连接酶检测反应探针的序列SEQ ID NO:5-SEQ ID NO:28所示。

其次，本发明的目的之二在于提供同时检测奶牛β-酪蛋白不同变体型的专用试剂盒，所述试剂盒包括多重PCR扩增体系和多重连接酶检测反应体系，

多重PCR扩增体系包括上述多重PCR扩增引物混合溶液(Primer mix)；多重连接酶检测反应体系包括上述多重连接酶检测反应探针混合溶液(Probe mix)。

具体的，多重PCR扩增体系包括上述多重PCR扩增引物混合溶液(Primer mix)、dNTP、 Taq酶、Mg²⁺、PCR>2O；

多重连接酶检测反应体系包括上述多重连接酶检测反应探针混合溶液(Probemix)，Taq DNA ligase、ddH₂O、连接酶检测反应Buffer。

优选的，多重PCR扩增体系采用20μl反应体系，组成为：2μl Primer mix(0.5pM)、2μl dNTP(2mM/each)、0.2μl Taq酶(1μ)、0.6μl Mg²⁺(3mM)、2μl>2O；

多重连接酶检测反应体系采用10μl反应体系，组成为：1μl Buffer(1×)、1μlProbe mix (each)(2pmol/μl)、0.05μl Taq DNA ligase(2μ)、4μl ddH₂O。

优选的实施方案中，所述试剂盒还包括DNA提取试剂和/PCR产物纯化试剂。

进一步的，本发明的目的之三在于提供一种检测β-酪蛋白不同变体型(A1，A2，A3，B，C，E，F，H1，I)奶牛的方法，包括如下步骤：

(1)采用上述多重PCR扩增引物，对奶牛DNA进行多重PCR扩增；

(2)以多重PCR扩增产物为模板，利用上述多重连接酶检测反应探针，进行多重连接酶检测反应；

(3)检测不同SNP位点，获得β-酪蛋白变体型。

优选的，所述奶牛DNA可以从含有有核细胞的任何组织中得到，该组织优选为该奶牛的血液、精液、毛发或奶。

优选的实施方案中，步骤(1)中，利用特异性引物进行多重PCR扩增的步骤，如下：

所述多重PCR扩增采用20μl反应体系，组成为：1μl DNA(50ng/μl)、2μl Primermix (0.5pM)、2μl dNTP(2mM/each)、0.2μl Taq酶(1μ)、0.6μl Mg²⁺(3mM)、2μl>2O。

所述多重PCR扩增条件为：先95℃2min；接着94℃30s，59℃90s，65℃1min，此步40个循环；最后65℃10min。

步骤(2)中，以多重PCR扩增产物为模板，荧光探针引物进行多重连接酶检测反应，对SNP位点分型的步骤，如下：

所述多重连接酶检测反应扩增采用10μl反应体系，组成为：1μl Buffer(1×)、1μlProbe mix (each)(2pmol/μl)、0.05μl Taq DNA ligase(2μ)、4μl ddH₂O、4μl多重PCR产物。

所述多重连接酶检测反应的条件为：先95℃2min；接着94℃15s，50℃25s，此步40个循环。

步骤(3)中，通过测序仪(如ABI 3730测序仪)，扫描链接反应所产生的片段长度(电泳时存在少许的位移，最终SNP位点的大小与设计长度会有少许差异，根据软件提示进行调整)，应用Genemapper软件实现对SNP位点不同基因型检测的目的。

此外，本发明的目的之四在于提供一种生产β-酪蛋白A2牛奶的方法，步骤包括：

(1)根据前述检测方法，确定奶牛的β-酪蛋白变体型；

(2)选择只具有编码β-酪蛋白A2基因的奶牛；

(3)对筛选的奶牛进行挤奶。

优选的实施方案中，步骤(1)可以是针对奶牛胚胎、幼体或成体。在一个具体实施方案中，步骤(3)的挤奶之前还包括对奶牛进行繁育直至生产或/及形成所需要的生产种群的步骤。

优选的，在另一实施方案中，还包括步骤(4)的对奶进行加工制成奶制品。

在上述所有实施方案中，所述奶牛优选为中国荷斯坦奶牛。

本发明的有益效果：

本发明的检测方法可同时检测β-酪蛋白不同变体型(A1，A2，A3，B，C，E，F，H1， I)，并且可同时检测样品通量高、准确性高、费用低。而且开发出检测试剂盒，使操作更加简便、快捷，这一发明可以早期检测不同β-酪蛋白不同变体型的荷斯坦奶牛，消除A1、B 和C等变体型奶牛导致的养牛业损失，筛选出A2型荷斯坦种公牛和种子母牛。这一发明是奶牛分子遗传育种在生产实践上的一次很好应用，能够产生巨大的经济和社会效益。

附图说明

图1：多重PCR扩增产物的3％琼脂糖凝胶电泳图

图2：利用3730XL与Genemapper检测不同SNP位点图

具体实施方式

结合具体实例对本发明作进一步的说明，以下实例仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照试剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明公开了同时检测奶牛β-酪蛋白不同变体型的一组专用引物，包括多重PCR扩增引物和多重连接酶检测反应探针，

所述多重PCR扩增引物的序列如下表1所示：

表1

引物序列(5’-3’)序列编号GGAATCTATTACACGCATCAASEQ ID NO.1TTGCACTGACATTTATATTACCASEQ ID NO.2GCCCAGACACAGTCTCTAGTCSEQ ID NO.3TGAATGGGCATATCTCTCTGSEQ ID NO.4

多重连接酶检测反应探针的序列如下表2所示：

表2

引物序列(5’-3’)序列编号TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGAAAATTGAGAAGTTTCAGAGTGSEQ ID NO.5TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGAAAATTGAGAAGTTTCAGAGTASEQ ID NO.6P-AGGAACAGCAGCAAACAGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-FAMSEQ ID NO.7TTTTTTTTTTTTTTTTATTACCTCTGTTTGCTGCTGTTTSEQ ID NO.8TTTTTTTTTTTTTTTTTTATTACCTCTGTTTGCTGCTGTTCSEQ ID NO.9P-CTCACTCTGAAACTTCTCAATTTTTTTTTTTTTTTTTT-FAMSEQ ID NO.10TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGATGTTTTGTGGGAGGCTGTTATSEQ ID NO.11TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGATGTTTTGTGGGAGGCTGTTAGSEQ ID NO.12P-GGATGGGTCCAGGGAAGGGATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-FAMSEQ ID NO.13TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTACTCCCATTACTTCAGGCTGAATSEQ ID NO.14TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTACTCCCATTACTTCAGGCTGAAGSEQ ID NO.15P-GAAAGGCGGCACCACCACAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-FAMSEQ ID NO.16TTTTTTTTTTTTTTTTTTTCCTTCACTTTGGAGACTCCCATSEQ ID NO.17TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCCTTCACTTTGGAGACTCCCAGSEQ ID NO.18P-TACTTCAGGCTGAAGGAAAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-FAMSEQ ID NO.19TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAGGAGGCTATGGCTCCTAAGCACSEQ ID NO.20TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAGGAGGCTATGGCTCCTAAGCAASEQ ID NO.21P-AAAGAAATGCCCTTCCCTAATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-FAMSEQ ID NO.22TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCATCAGTGAGAGTCAGGCTCTGGSEQ ID NO.23TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCATCAGTGAGAGTCAGGCTCTGCSEQ ID NO.24P-CTTTCAGTAAAGGGCTCAACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-FAMSEQ ID NO.25TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAGGAGGAAACATGACAGTTGGAASEQ ID NO.26TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAGGAGGAAACATGACAGTTGGAGSEQ ID NO.27P-GAAGAGGCTGGTGAGGCTGGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-FAMSEQ ID NO.28

本发明还公开了同时检测奶牛β-酪蛋白不同变体型的专用试剂盒，所述试剂盒包括多重 PCR扩增体系和多重连接酶检测反应体系，

多重PCR扩增体系包括上述多重PCR扩增引物混合溶液(Primer mix)；多重连接酶检测反应体系包括上述多重连接酶检测反应探针混合溶液(Probe mix)。

具体的，多重PCR扩增体系包括上述多重PCR扩增引物混合溶液(Primer mix)、dNTP、 Taq酶、Mg²⁺、PCR>2O；

多重连接酶检测反应体系包括上述多重连接酶检测反应探针混合溶液(Probemix)，Taq DNA ligase、ddH₂O、连接酶检测反应Buffer。

优选的，多重PCR扩增体系采用20μl反应体系，组成为：2μl Primer mix(0.5pM)、2μl dNTP(2mM/each)、0.2μl Taq酶(1μ)、0.6μl Mg²⁺(3mM)、2μl>2O；

多重连接酶检测反应体系采用10μl反应体系，组成为：1μl Buffer(1×)、1μlProbe mix (each)(2pmol/μl)、0.05μl Taq DNAligase(2μ)、4μl ddH₂O。

优选的实施方案中，所述试剂盒还包括DNA提取试剂和/PCR产物纯化试剂。

本发明建立了多重PCR联合多重连接酶检测反应来同时检测β-酪蛋白不同变体型(A1， A2，A3，B，C，E，F，H1，I)的方法，奶牛β-酪蛋白不同变体型不仅仅为A1/A2型，现有的检测方式也多把A3/H1/I突变型误归为A2型，把B/C/F误归为A1型，实际应用过程中对于定向培育具有A2型的荷斯坦优质种子母牛和种公牛造成了诸多干扰。发明人针对现有的检测方式，考虑β-酪蛋白不同变体型同一检测的可行性进行分析，提出了本发明。

本发明的引物序列设计思路为：基于奶牛β-酪蛋白基因序列(参考序列：ENSBTAT00000003409)，结合β-酪蛋白不同变体型(A1，A2，A3，B，C，E，F，H1，I) 共发生的8个SNP位点(c.151 G>A、c.154 G>A、c.245 C>A、c.307 C>A、c.322 A>C、c.363 C>A、c.411 C>G、c.500 C>T)(不同SNP位点和β-酪蛋白不同变体型的关系，见下表3)，设计两对特异性引物(Primer mix)进行多重PCR扩增出8个SNP位点所在的目的DNA片段，再对每个SNP位点设计3条探针引物(Probe mix)，其中在SNP位点一侧设计2条特异性检测探针(每条探针的3’端与突变位点的一种基因型互补)，在另一侧设计一条与模板完全匹配的荧光标记探针，然后在连接酶的作用下，以扩增的多重PCR产物为模板，当两侧的探针与目的DNA序列完全互补时链接反应才能进行，最后通过ABI 3730XL测序仪，扫描链接反应所产生的片段长度，实现对不同SNP位点检测的目的。

多重PCR虽然现有存在多种SNP的检测技术，但引物设计仍是基因分型成功的关键因素。本发明中，多重PCR扩增的特异性、准确性和扩增效率是本发明面临的第一个难题。β-酪蛋白基因含有九个内含子，发明人设计扩增β-酪蛋白不同变体型(A1，A2，A3，B， C，E，F，H1，I)，首先需要满足扩增的覆盖度，在考虑常规引物设计原则(包括引物长度、引物的熔解温度、引物退火温度、GC含量、二级结构、3’末端稳定性)的基础上，发明人着重考虑两点指标要求：一是高灵敏度和特异性，二是扩增效率。发明人借助引物设计工具 (如Primer3)来辅助完成引物设计，对引物设计工具给出的前20对引物进行筛选(分两段序列分别设计引物，各取前10对引物序列)，并结合引物二聚体和发夹分析软件，分析该20 对引物的二级结构情况，筛选获得4对引物(β-酪蛋白外显子5-6的扩增引物2对，外显子7的扩增引物2对)，然后进行2×2交叉进行验证，仅有2对引物(如序列表1)可以同时扩增获得β-酪蛋白外显子5-6和外显子7(即覆盖β-酪蛋白不同变体型(A1，A2，A3，B，C， E，F，H1，I)区域)，发明人后续分析，造成多重PCR高灵敏度引物筛选的一个主要障碍，采用PCR扩增一直是潜在的错误扩增和引物二聚体的指数增长，在相同的反应混合物中通常使用较多的PCR引物，本发明引物配对，尤其是SEQ ID NO:2位于内含子6具有极佳的特异性，使得其限制引物二聚体和短期异常扩增。此外，由于多重PCR要求在同一反应体系中进行多个位点的特异性扩增，其并非单一PCR的简单混合，本发明除了对引物设计序列进行优化和筛选(减少引物互补和配对几率，降低错误扩增和引物二聚体增长)外，还对引物的浓度比例条件进行了摸索实验和优化，以达到各位点平衡和扩增效率的提升，试验中，发明人发现，将序列表1所示引物等量加入进行扩增，相对来说SEQ ID NO:1-2引物对扩增明显占优势，当其相对于SEQ ID NO:3-4引物对浓度比达到3:1时，419bp片段(SEQ ID NO:3 -4引物对扩增产物)丢失了，无法扩增获得；可有效扩增时，SEQ ID NO:1-2引物对与SE Q ID NO:3-4引物对浓度比范围1:2-1:1。

表3

多重连接酶检测反应本发明对每个SNP位点在一侧设计2条特异性检测探针(每条探针的3’端与突变位点的一种基因型互补)，另一侧设计一条与模板完全匹配的荧光标记探针，以多重PCR扩增产物为模板，进行多重连接酶检测反应，然而由于本发明β-酪蛋白不同变体型(A1，A2，A3，B，C，E，F，H1，I)位点距离近，尤其是c.151 G>A和c.154 G>A、c.307 C>A和c.322 A>C，这对本发明一管同时检测8个β-酪蛋白不同变体型(A1，A2，A3， B，C，E，F，H1，I)位点造成了极大困难。发明人除了对荧光探针增加磷酸化位点增强其特异性、对检测探针与模板的配对碱基进行数量优化外，还引入了基因模板正义链和反义链交叉反向设计检测探针的策略。发明人进行分析发现，8个β-酪蛋白不同变体型(A1，A2， A3，B，C，E，F，H1，I)覆盖区域模板的正义链设计连接酶检测反应探针，其几个位点均极易形成不同引物聚合，影响一管同时检测的特异性，而根据反义链设计连接酶检测反应探针，其引物聚合度更低，进一步的，针对距离近位点(c.151 G>A和c.154 G>A、c.363 C>A) 的探针设计额外进行调整，最终形成了针对正义链设计c.151 G>A、c.363 C>A连接酶检测反应探针，针对反义链设计c.154 G>A、c.245 C>A、c.307 C>A、c.322 A>C、c.411 C>G、c.500 C>T连接酶检测反应探针，并最终通过实验验证确认，该策略特异性和扩增效率极好。

实施例1：检测不同变体型β-酪蛋白奶牛的方法构建

1.多重PCR扩增引物设计与条件优化

根据Ensembl数据库中β-酪蛋白基因序列(参考序列：ENSBTAT00000003409)，并结合β-酪蛋白不同变体型所含的SNP突变序列信息(c.151 G>A、c.154 G>A、c.245 C>A、c.307 C>A、c.322 A>C、c.363 C>A、c.411 C>G、c.500 C>T)，设计两对多重PCR扩增引物扩增SNP位点所在片段。具体如下：

(1)从荷斯坦牛血液、精液或毛囊中提取牛的DNA；

(2)采用两对引物对目的基因进行多重PCR扩增；

经试验优化筛选确定以下序列(表4)作为检测β-酪蛋白不同变体型奶牛的多重PCR扩增引物：

表4

对影响多重PCR扩增反应的几个条件进行优化，包括体系组成、试剂浓度、引物退火温度、反应时间、循环数等，观察其对检测结果的影响，确定最佳扩增反应体系和扩增条件。以下所述的多重PCR反应体系和条件进行反应的扩增效率和引物特异性最高。

结果表明最优的多重PCR扩增20μl反应体系为：1μl DNA(50ng/μl)、2μl Primermix (0.5pM)、2μl dNTP(2mM/each)、0.2μl Taq酶(1μ)、0.6μl Mg²⁺(3mM)、2μl>2O。

结果表明最优的多重PCR反应条件为：先95℃2min；接着94℃30s，59℃90s，65℃1min，此步40个循环；最后65℃10min。

2.多重连接酶检测反应探针引物设计与条件优化

经多重连接酶检测反应探针引物组合对目的基因进行扩增后，再针对每个SNP位点 (c.151 G>A、c.154 G>A、c.245 C>A、c.307 C>A、c.322 A>C、c.363 C>A、c.411 C>G、c.500 C>T)设计3条引物，包括在SNP位点一侧设计2条特异性检测探针(每条探针的3’端与突变位点的一种基因型互补)，在SNP的另一侧设计1条与模板完全匹配的荧光标记探针，探针序列的5端碱基磷酸化(P)，且3端带有6-羧基荧光素(FAM)报告基团，所述荧光标记探针引物的序列如下表5所示：

表5

3.对影响多重连接酶检测反应的条件进行优化，包括体系组成、试剂浓度、温度、时间、循环数等，观察其对检测结果的影响，确定最佳扩增反应体系和扩增条件。优化多重连接酶检测反应扩增体系和扩增条件后，然后在连接酶的作用下，当两侧的探针与目的DNA序列完全互补时链接反应才能进行，取1μl多重连接酶检测反应产物与0.6μl ABI GS-500ROX 荧光标记分子量标准和10μl hidi上样液混合，95℃加热变性2分钟，冰中骤冷通过ABI 3730 测序仪，扫描链接反应所产生的片段长度，应用Genemapper软件实现对SNP位点不同基因型检测的目的。优化的多重连接酶检测反应扩增体系和扩增条件，如下：

优化的多重连接酶检测反应扩增采用10μl反应体系，组成为：1μl Buffer(1×)、1μl Probe mix(each)(2pmol/μl)、0.05μl Taq DNA ligase(2μ)、4μl ddH₂O、4μl多重PCR产物。

优化的多重连接酶检测反应的条件为：先95℃2min；接着94℃15s，50℃25s，此步40个循环。

实施例2：用于检测不同变体型β-酪蛋白奶牛的试剂盒

试剂盒的组成包括：Primer mix、Probe mix(each)、Taq酶、Taq DNA ligase、dNTP、 Mg²⁺、Buffer、ddH₂O。

多重PCR引物组为实施例1中筛选优化得到的，其序列为表1所示；

多重连接酶检测反应探针引物组为实施例1中筛选优化得到的，其序列为表2所示；

采用该试剂盒进行临床检测的检测方法为：

(1)从荷斯坦牛血液、精液或毛囊中提取牛的DNA；

(2)采用两对引物对目的基因进行多重PCR扩增；

多重PCR扩增采用20μl反应体系，组成为：1μl DNA(50ng/μl)、2μl Primer mix(0.5pM)、 2μl dNTP(2mM/each)、0.2μl Taq酶(1μ)、0.6μl Mg²⁺(3mM)、2μl>2O。

多重PCR扩增的条件为：先95℃2min；接着94℃30s，59℃90s，65℃1min，此步 40个循环；最后65℃10min。

(3)对PCR扩增产物进行多重连接酶检测反应；

多重连接酶检测反应扩增采用10μl反应体系，组成为：1μl Buffer(1×)、1μlProbe mix (each)(2pmol/μl)、0.05μl Taq DNAligase(2μ)、4μl ddH₂O、4μl多重PCR产物。

多重连接酶检测反应条件为：先95℃2min；接着94℃15s，50℃25s，此步40个循环。

(4)检测反应在Taq DNA ligase作用下，当两侧的探针与目的DNA序列完全互补时链接反应才能进行，否则连接反应不能进行，通过ABI 3730XL测序仪，扫描链接反应所产生的片段长度，应用Genemapper软件实现对SNP位点不同基因型检测的目的。

实施例3：试剂盒的特异性和重复性检测

以经过直接测序鉴定的β-酪蛋白不同变体型奶牛为检测对象，采用实施例2的试剂盒进行检测，都能够特异性检出不同变体型，进一步通过测序确认，其准确率达100％。表明本发明试剂盒中的引物、反应体系、反应条件及检测方法准确、有效、特异性强。

以已知不同变体型β-酪蛋白奶牛为检测对象，采用本发明的试剂盒进行多次重复试验，重复性检测的结果均一致，表明本发明的试剂盒具有稳定性。

为验证试剂盒检测灵敏度，本发明将β-酪蛋白基因5-6号外显子和内含子、7号外显子 (共约1.9kb)构建到T载体上，利用本发明试剂盒进行检测，当DNA大于10⁴拷贝数/ml时，均可以检测到突变，这说明本发明的引物和探针的特异性和灵敏度极高。

实施例4：奶牛临床样本的检测

采用本发明实施例2的试剂盒检测104头荷斯坦奶牛。

根据上述发明的试剂盒，利用如下步骤检测不同变体型β-酪蛋白奶牛。

(1)提取104头牛的荷斯坦牛血液DNA；

(2)多重PCR反应体系：1μl DNA(50ng/μl)、2μl Primer mix(0.5pM)、2μl dNTP(2mM/each)、0.2μl Taq酶(1μ)、0.6μl Mg²⁺(3mM)、2μl>2O。多重PCR扩增条件为：先95℃2min；接着94℃30s，59℃90s，65℃1min，此步40个循环；最后65℃10min。

(3)多重连接酶检测反应体系：1μl Buffer(1×)、1μl Probe mix(each)(2pmol/μl)、0.05μl Taq DNA ligase(2μ)、4μl ddH₂O、4μl多重PCR产物。多重连接酶检测反应条件为：先95℃>

(4)检测反应完成后，通过ABI 3730XL测序仪，扫描链接反应所产生的片段长度，检测β-酪蛋白的不同变体型。

基因分型与结果分析：不同变体型β-酪蛋白奶牛的分型结果，结果如下表6和图2所示。

总共对104头荷斯坦奶牛进行了检测，其中27头A2/A2型、45头A2/A1型、1头A2/A3、4头A2/B、1头A2/F、8头A2/I、10头A1/A1、1头A1/A3、2头A1/B、5头A1/I。

表6牛β-酪蛋白分型结果

。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东省农业科学院奶牛研究中心

<120> 同时检测奶牛β-酪蛋白不同变体型的一组专用引物及其试剂盒

<130> 2017

<160> 28

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ggaatctatt acacgcatca a 21

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ttgcactgac atttatatta cca 23

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gcccagacac agtctctagt c 21

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tgaatgggca tatctctctg 20

<210> 5

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tttttttttt tttttttttt ttttttgaaa attgagaagt ttcagagtg 49

<210> 6

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tttttttttt tttttttttt ttttttttga aaattgagaa gtttcagagt a 51

<210> 7

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

P-aggaacagca gcaaacagag tttttttttt tttttttttt tttttttt-FAM 48

<210> 8

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

tttttttttt ttttttatta cctctgtttg ctgctgttt 39

<210> 9

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

tttttttttt ttttttttat tacctctgtt tgctgctgtt c 41

<210> 10

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

P-ctcactctga aacttctcaa tttttttttt tttttttt-FAM 38

<210> 11

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

tttttttttt tttttttttt tttttttttt gatgttttgt gggaggctgt tat 53

<210> 12

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

tttttttttt tttttttttt tttttttttt ttgatgtttt gtgggaggct gttag 55

<210> 13

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

P-ggatgggtcc agggaaggga tttttttttt tttttttttt tttttttttt tt-FAM 52

<210> 14

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

tttttttttt tttttttttt actcccatta cttcaggctg aat 43

<210> 15

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

tttttttttt tttttttttt ttactcccat tacttcaggc tgaag 45

<210> 16

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

P-gaaaggcggc accaccacag tttttttttt tttttttttt tt-FAM 42

<210> 17

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

tttttttttt tttttttttc cttcactttg gagactccca t 41

<210> 18

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

tttttttttt tttttttttt tccttcactt tggagactcc cag 43

<210> 19

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

P-tacttcaggc tgaaggaaag tttttttttt tttttttttt-FAM 40

<210> 20

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

tttttttttt tttttttttt ttaggaggct atggctccta agcac 45

<210> 21

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

tttttttttt tttttttttt ttttaggagg ctatggctcc taagcaa 47

<210> 22

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

P-aaagaaatgc ccttccctaa tttttttttt tttttttttt tttt-FAM 44

<210> 23

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

tttttttttt tttttttttt ttttcatcag tgagagtcag gctctgg 47

<210> 24

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

tttttttttt tttttttttt ttttttcatc agtgagagtc aggctctgc 49

<210> 25

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

P-ctttcagtaa agggctcaac tttttttttt tttttttttt tttttt-FAM 46

<210> 26

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

tttttttttt tttttttttt ttttttttag gaggaaacat gacagttgga a 51

<210> 27

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

tttttttttt tttttttttt tttttttttt aggaggaaac atgacagttg gag 53

<210> 28

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

P-gaagaggctg gtgaggctgg tttttttttt tttttttttt tttttttttt-FAM 50