阿斯巴甜在促进幼龄反刍动物小肠发育、增强小肠屏障功能中的应用

摘要

本发明公开了阿斯巴甜在促进动物小肠发育、增强小肠屏障功能中的应用；阿斯巴甜可以在幼龄反刍动物开食料中作为添加剂，通过甜味受体等一系列信号途径刺激GLP‑2的分泌，之后与GLP‑2R受体结合后，激活ERK1/2信号通路，从而促进紧密连接蛋白的表达，增强小肠上皮的屏障功能，通过调节幼龄反刍动物细胞周期蛋白和相关依赖性激酶的表达推动细胞周期进程促进小肠上皮的发育、增强小肠屏障功能，预防羔羊等幼龄反刍动物腹泻的发生，提高羔羊等幼龄反刍动物的成活率，有利于幼龄反刍动物断奶前期肠道健康，减弱断奶应激。

说明书

技术领域

本发明属于饲料添加剂领域，具体涉及阿斯巴甜在幼龄反刍动物开食料中促进动物小肠发育、增强小肠屏障功能的应用。

背景技术

出生后到断奶前是幼龄反刍动物消化道疾病高发阶段。以羔羊为例，相关调查显示，我国哺乳期羔羊的腹泻率约为50％，并且这些腹泻羔羊的死亡率高达20％，每年造成超过十亿元的经济损失。羔羊腹泻的发病原因非常复杂，母羊营养不良、羔羊补饲饲料质量差、应激及病原微生物感染等都可能是诱发羔羊腹泻的因素。目前都是通过应用抗生素可以治疗或减缓幼龄反刍动物断奶期间的腹泻情况，但是，随着抗生素的禁用以及抗生素残留问题，寻找一种更安全、有效和经济的方式是社会所需的。同时，近年来许多研究表明，幼龄动物尚未发育完善的肠道屏障功能也是导致动物易感甚至发生腹泻的重要因素。但是，到目前为止，尚无研究从防护肠道上皮屏障的角度来预防幼龄反刍动物腹泻的发生。因此，寻找相应的营养调控手段促进幼龄反刍动物肠道屏障功能的发育及完善对降低幼龄反刍动物腹泻风险具有重要意义。

阿斯巴甜分子式为：C₁₄H₁₈N₂O₅，结构式如下：

是一种天然功能性低聚糖，不致龋齿、甜味纯正、吸湿性低，没有发黏现象。不会引起血糖的明显升高，适合糖尿病患者食用。阿斯巴甜可用于糕点、饼干、面包、配制酒、雪糕、冰棍、饮料、糖果、用量按正常生产需要。在饲料方面，目前关于阿斯巴甜的使用都是在复合甜味剂方面的应用，没有关于对幼龄反刍动物肠道上皮防护的报道。

发明目的

发明内容：针对现有技术存在的问题，本发明提供阿斯巴甜在促进动物小肠发育、增强小肠屏障功能的应用。本发明提出了一种阿斯巴甜的新功能，可以在 幼龄反刍动物开食料中作为添加剂，从防护肠道上皮屏障的角度来预防羔羊等幼龄反刍动物腹泻的发生，促进动物小肠发育、增强小肠屏障功能。

技术方案：为了实现上述目的，如本发明所述的阿斯巴甜在促进幼龄反刍动物小肠发育、增强小肠屏障功能中的应用。

进一步地，所述阿斯巴甜在动物饲料中作为添加剂促进幼龄反刍动物小肠发育、增强小肠屏障功能中的应用。

其中，所述的饲料为开食料。

更进一步地，所述开食料中阿斯巴甜的添加量为开食料质量的0.08-0.16％。优选的添加量为开食料质量的0.08％。

作为优选，所述幼龄反刍动物为羔羊或犊牛。通常选用幼龄反刍动物为羔羊。

其中，所述的动物的生长阶段为出生后到断奶前。

本发明是所使用的的原料和仪器都是市售可得。

阿斯巴甜购自美国纽特公司

便携式pH计(HI 9024C；HANNA Instruments，美国)

血浆血糖试剂盒购自上海荣盛生物药业有限公司

GLP-2荧光酶免疫试剂盒购自德国Phoenix Europe GmbH

反转录试剂盒购自Takara公司

Q5Real-time PCR仪(Applied Biosystems，美国)。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：

本发明所使用的阿斯巴甜是一种经济有效的甜味剂，本发明提出了一种阿斯巴甜的新功能，可以在幼龄反刍动物开食料中作为添加剂，从防护肠道上皮屏障来预防羔羊等幼龄反刍动物腹泻的发生，提高羔羊等幼龄反刍动物的成活率；本发明所使用的阿斯巴甜可通过甜味受体等一系列信号途径刺激GLP-2的分泌，之后与GLP-2R受体结合后，激活ERK1/2信号通路，从而促进紧密连接蛋白的表达，增强小肠上皮的屏障功能，通过调节幼龄反刍动物细胞周期蛋白和相关依赖性激酶的表达推动细胞周期进程促进小肠上皮的发育、增强小肠屏障功能，有利于幼龄反刍动物断奶前期肠道健康，减弱断奶应激。

附图说明

图1为阿斯巴甜添加对羔羊体重变化的影响关系图；

图2为阿斯巴甜添加对羔羊小肠上皮细胞周期蛋白mRNA相对表达量的影响关系图；

图3为阿斯巴甜添加对羔羊小肠上皮紧密连接蛋白mRNA相对表达量的影响关系图；

图4为阿斯巴甜添加对羔羊小肠上皮GCG、GLP-2R、IGF-1及IGF-1RmRNA相对表达量的影响关系图。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明做进一步说明。

实施例1

试验选择12只体况良好，胎次一致，体重相近的新生羔羊(湖羊)，随机分为对照组和甜味剂(阿斯巴甜)处理组，每组6只。10日龄时，羔羊开始补饲开食料，每天早晨8点和下午5点各喂一次。14日龄时，开始在试验组羔羊开食料中添加开食料质量0.08％的阿斯巴甜，试验期间，羔羊跟随母羊自由哺乳和饮水，自由采食苜蓿和燕麦干草，每周监测羔羊体重变化。试验开始前，两组羔羊的体重没有显著差异(6.18±0.47vs.5.80±0.26kg，P＝0.504)。阿斯巴甜购自美国纽特公司。开食料依据湖羊开食料营养需要标准(NY/Y816-2004；中国农业部,2004)设计开食料配方，组成见表1。

表1试验开食料组成与营养水平

实施例2

实施例2采用是相同的开食料配合和试验方法，不同之处在于试验对象为体重相近的新生犊牛，处理组开食料中添加开食料质量0.16％的阿斯巴甜。

实施例3

试验期间每周监测实施例1的对照组和试验组羔羊体重变化，结果如图1所示。在整个试验期间两组羔羊体重无显著差异。

实施例4

取实施例1的羔羊42日龄时，早晨饲喂两小时后进行屠宰，屠宰前颈静脉采血，血液在1000g 4℃离心15min储存在-20℃用于血常规检测。屠宰后立即分离瘤胃和小肠并称重，收集有代表性的瘤胃内容物测定pH值，测定完pH值 后的瘤胃内容物四层纱布过滤收集瘤胃液，-20℃保存待测挥发性脂肪酸浓度。采集具有代表性的十二指肠、空肠和回肠组织在冰的磷酸缓冲溶液里清洗3次后，剪成0.5cm×0.5cm的小碎块装入冻存管置于液氮保存，用于后续RNA的提取。

实施例5

检测甜味剂阿斯巴甜添加对羔羊各器官重量的影响：

在羔羊42日龄时屠宰采样，羔羊屠宰后立即分离各器官并称重，结果如表2所示。

表2.甜味剂添加对羔羊各器官重量的影响

注：数据以平均值±标准误形式表示，_n＝5

由表2可知，甜味剂阿斯巴甜添加显著提高了羔羊空肠重和盲肠重，对瘤胃湿重、瘤胃干重、瓣胃湿重、瓣胃干重、十二指肠重、回肠重、结肠重及肝脏重无显著性影响。上述结果说明：甜味剂阿斯巴甜提高了空肠的重量，对小肠发育有促进作用。

实施例6

对实施例4的血液进行血常规检测以及瘤胃内容物测定pH值，考察甜味剂阿斯巴甜对羔羊瘤胃和血液参数的影响，结果如表3所示。

血常规分析的血浆血糖试剂盒购自上海荣盛生物药业有限公司；GLP-2荧光酶免疫试剂盒购自德国Phoenix Europe GmbH。血糖和GLP-2试剂盒的测量范围分别是3.89～6.11mmol/L和0-10000pg/ml。

瘤胃生理参数测定，用便携式pH计(HI 9024C；HANNA Instruments,美国)测定瘤胃pH值。气相色谱测定(GC-14B,岛津,日本；毛细管柱:30m×0.32 mm×0.25mm膜厚度)VFA浓度，参照秦为琳.(应用气相色谱测定瘤胃挥发性脂肪酸方法的研究改进.南京农业大学学报,1982(4):110-116)的方法(柱温＝110℃,汽化室温度＝180℃,检测器＝180℃)。

表3甜味剂添加对羔羊瘤胃参数和血液参数的影响

如表3所示，甜味剂添加对羔羊瘤胃丁酸浓度、其他挥发性脂肪酸浓度和血浆GLP-2浓度有升高的趋势；对瘤pH、总挥发性脂肪酸浓度、乙酸浓度、丙酸浓度、乙丙比和血浆葡萄糖浓度无显著性影响。上述结果说明：甜味剂阿斯巴甜促进了羔羊自身GLP-2的分泌。

实施例7

甜味剂阿斯巴甜添加对羔羊小肠上皮mRN相对表达量的影响。

RNA的提取和cDNA的合成：提取实施例4得到小肠上皮总RNA，使用NanoDrop分光光度计检测RNA的浓度和纯度。所有样品的吸收比例(260/280nm)都在1.8～2.0之间，证明RNA纯度较高。用1.4％的琼脂糖胶检测RNA的完整性。将所有的RNA浓度调整到1μg/μL，置于-80℃冰箱保存备用。利用购自Takara公司含基因组RNA酶的反转录试剂盒进行cDNA的合成。

引物的合成和实时定量PCR：利用Q5Real-time PCR仪(Applied Biosystems，美国)对目的基因及内参基因GAPDH、18S rRNA进行定量，GAPDH引物序列参照Wang等(Wang A,Gu Z,Heid B,et al.Identification and characterization of the bovine Gprotein-coupled receptor GPR41and GPR43genes 1[J].Journal of Dairy Science,2009,92(6):2696-2705.)，实时定量PCR分析所用引物采用Primer 5.0软件自行设计，由上海捷瑞生物工程有限公司合成，引物SQE ID NO.1-36，如表4所 示。SYBR购自Takara公司，反应条件为：95℃30s预变性，95℃5s，60℃30s，重复40个循环，95℃，15s；60℃，1min；95，15s。反应体积20μL：10.4ul SYBR，10umol/L上下游引物各0.4ul，2ul样品cDNA以及6.8ul无菌水。所有样品设3个重复。目的基因的相对表达量以管家基因GAPDH作为内参进行校正，数据分析采用2^-△△CT的方法。

表4扩增引物序列

结果以平均值±标准误(means±SE)进行表示。数据采用SPSS 20.0中的独立样本t检验进行显著性分析。采用GraphPad Prism 6.01(www.graphpad.com)软件分析目的基因的mRNA表达量。P<0.05表示差异显著。

甜味剂阿斯巴甜添加对羔羊小肠上皮细胞周期蛋白mRNA相对表达量的影响：细胞周期的推进主要受细胞周期蛋白(cyclins)及其相关的激酶(CDKs)的调控，所以cyclins和CDKs的表达情况会影响细胞周期进程。如图2所示，甜味剂阿斯巴甜添加显著提高了羔羊十二指肠Cyclin D1、CDK1和CDK6的mRNA表达量；空肠CyclinA、Cyclin B1、CDK1和CDK6的mRNA表达量；回肠Cyclin A、Cyclin D1和CDK4的mRNA表达量。以上结果表明：阿斯巴甜添加促进羔羊自身合成的GLP-2促进了小肠上皮细胞周期蛋白和相关依赖性激酶的mRNA表达，一定程度上推动了细胞周期进程，促进了小肠上皮的增殖。

甜味剂阿斯巴甜添加对羔羊小肠上皮紧密连接蛋白mRNA相对表达量的影响：上皮屏障的完整主要是通过细胞和细胞间的连接蛋白及细胞和基质间锚定骨架蛋白的粘着斑复合体来维持。结果如图3所示，阿斯巴甜添加显著提高了羔羊十二指Claudin-4和ZO-1的mRNA表达量；空肠Claudin-1、Occludin和ZO-1的mRNA表达量；回肠Claudin-4和Occludin的mRNA表达量。Claudin家族蛋白是最主要的跨膜蛋白，其主要功能是封闭细胞与细胞的间隙。Occludin是一种直接与claudins和actin作用的跨膜蛋白。Zo-1是一种外周蛋白，对于紧密连接的分布和维持起到非常关键的作用。上述结果表明：阿斯巴甜添加促进羔羊自身分泌的GLP-2促进了小肠紧密连接蛋白的mRNA表达量，有利于羔羊小肠屏障功能的发育，维持肠道健康。

甜味剂阿斯巴甜添加对羔羊小肠上皮GCG、GLP-2R、IGF-1及IGF-1RmRNA相对表达量的影响：如图4所示，与对照组相比，阿斯巴甜添加显著升高了十二指肠GCG和IGF-1；空肠GCG、IGF-1、IGF-1R和GLP-2R；回肠GCG和IGF-1的mRNA表达量。上述研究结果表明：阿斯巴甜添加促进了羔羊小肠上皮GLP-2受体的表达，同时促进了IGF-1和IGF-1受体的表达，暗示GLP-2是通过IGF-1信号通路调控细胞周期进程，促进了小肠上皮的增殖。同时采用实施例2犊牛为实验对象，结果与上述实施例结果类似。

SEQUENCE LISTING

<110> 南京农业大学

<120> 阿斯巴甜在促进幼龄反刍动物小肠发育、增强小肠屏障功能的应用

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