一种用于文物检测的棉纤维素酶解产物偶联蛋白质的制备方法

摘要

本发明涉及文物检测领域，公开了一种用于文物检测的棉纤维素酶解产物偶联蛋白质的制备方法，先对棉纤维素脱脂，经乙酸和氢氧化钠处理除去木质素和半纤维素后，利用纤维素酶和β‑葡萄糖苷酶对纤维素进行酶解，再配制去离子水‑硫酸铵‑聚乙二醇‑400萃取液，将萃取后的上下层液相分别冷冻干燥，上层得到回收的酶，下层得到葡萄糖粉末，将葡萄糖粉末和牛血清蛋白溶于去离子水和溴化钾溶液，并在恒温恒湿箱中放置，然后冷冻干燥得到葡萄糖‑牛血清蛋白偶联物。利用本发明提供的方法得到的偶联大分子较稳定，以这种偶联大分子为完全抗原，对动物进行免疫注射，即可得到相对应的特异性抗体，为鉴定古代纺织品文物中的棉类织物提供了可行性。

说明书

技术领域

本发明涉及文物检测领域，尤其涉及一种用于文物检测的棉纤维素酶解产物偶联蛋白质的制备方法。

背景技术

近年来我国出土了大量纺织品文物，鉴定其所属种类对研究我国的历史文化具有重大意义。对于丝织品的鉴定目前已经出现了数种比较精确灵敏的方法，其中又以酶联免疫吸附测定、Western Blotting为代表，它们大多建立在抗原与对应的抗体之间会发生特异性结合这一免疫学基本知识上。由于蚕丝本身含有大量蛋白质，所以利用蚕丝丝素蛋白作为完全抗原对动物进行免疫注射，经过相应处理即可获得能与丝素蛋白特异性结合的抗体，利用这些抗体就可以检测古代纺织品中是否含有蚕丝。但是棉纤维的主要成分是纤维素，无法直接作为完全抗原来进行动物免疫，因此难以利用酶联免疫吸附测定、WesternBlotting等方法对古代纺织品文物中的棉织物进行鉴定。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种用于文物检测的棉纤维素酶解产物偶联蛋白质的制备方法。本发明通过一系列处理将棉纤维素的酶解产物葡萄糖与生物大分子偶联形成偶联大分子。以这种偶联大分子为完全抗原，对动物进行免疫注射，即可得到相对应的特异性抗体，本发明以开创性地将纤维素产物与蛋白偶联，为鉴定古代纺织品文物中的棉类织物提供了可行性。

本发明的具体技术方案为：一种用于文物检测的棉纤维素酶解产物偶联蛋白质的制备方法，以g、mL计，包括以下步骤：

1）取9-11 g棉纤维，研磨成粉，加入45-55 mL苯，20-30 mL乙醇浸泡处理，对纤维进行脱脂处理，处理结束后对混合溶液进行减压蒸发以回收苯和乙醇，脱脂后的棉纤维用去离子水冲洗，烘干后得到棉纤维粉末。

2）取4-6g烘干后的棉纤维粉末，加入180-220 mL的4-6wt%乙酸，在70-80 ℃的水浴中加热10-14 h后抽滤，取沉淀，用去离子水洗涤后加入180-220mL的7-9wt%的氢氧化钠，在70-80℃的水浴中加热10-14 h后抽滤，将沉淀用去离子水冲洗。

3）取步骤2）中所得沉淀，加入浓度为8-12wt%过氧化氢溶液，在40-50℃水浴中加热4-6h后抽滤，将沉淀用去离子水冲洗，烘干后得到纤维素粉末。

4）取2-3g纤维素粉末，加入70-80mL去离子水，称量0.4-0.6 g的纤维素酶和0.1-0.3 g的β-葡萄糖苷酶加入至溶液中后调节pH为4-5，进行酶解反应7-9h。

本发明利用复合酶对纤维素进行处理可以加快酶解的速度，缩短工艺流程，同时也能提高酶解的程度，增加产率。

5）移取8-12 mL聚乙二醇-400至烧杯中，接着加入4-6 mL去离子水，最后加入8-12mL预先配好的30wt%硫酸铵溶液，搅拌均匀后于1-5 ℃下储存，制得萃取液。

6）酶解反应结束后，在剩余溶液中加入20-30mL萃取液，搅拌混合均匀后置于1-5℃环境中7-9h，然后对溶液进行离心处理，离心后溶液分层，分别收集上下层液相进行真空冷冻干燥，上层有机相冻干后得到酶，可以重复利用，下层溶液冻干后得到葡萄糖粉末。

纤维素酶解以后的产物为小分子葡萄糖，而纤维素酶和β-葡萄糖苷酶为生物大分子，本发明利用萃取对酶进行回收利用，回收得到的酶活性在90%以上，很大程度上节约了生产成本。

7）取0.15-0.25 g牛血清蛋白和0.8-1.2 g葡萄糖粉末溶于18-22mL去离子水中，搅拌均匀后进行真空冷冻干燥，冻干后所得粉末溶于25-35 mL饱和溴化钾溶液并在55-65℃，相对湿度60-70%的恒温恒湿箱中放置6-8天。

通过此方法可以将纤维素的酶解产物葡萄糖与牛血清蛋白偶联产生新的偶联大分子，且得到的偶联大分子较稳定。

8）对步骤7）中所得溶液进行真空冷冻干燥，最终获得葡萄糖-牛血清蛋白偶联物。

作为优选，步骤1）中，研磨时间为3-5min，浸泡时间为6-10h，烘干温度为45-55℃。

作为优选，步骤3）中，沉淀与过氧化氢溶液的料液质量比为1:25-35，烘干温度为45-55℃。

作为优选，步骤4）中，纤维素酶和β-葡萄糖苷酶的酶活为10000 u/g。

作为优选，步骤6）中，离心速率为10000-14000 r/min。

与现有技术对比，本发明的有益效果是：

1、本发明提供的方法可以通过将纤维素的酶解产物葡萄糖与牛血清蛋白偶联产生新的偶联大分子，且得到的偶联大分子较稳定，以这种偶联大分子为完全抗原，对动物进行免疫注射，即可得到相对应的特异性抗体，为鉴定古代纺织品文物中的棉类织物提供了可行性。

2、本发明利用复合酶对纤维素进行处理可以加快酶解的速度，缩短实验流程，同时也能提高酶解的程度，增加产率，然后利用萃取对酶进行回收利用，回收得到的酶活性在90%以上，很大程度上节约了生产成本。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的描述。

实施例1

1）取10 g棉纤维，研磨3分钟后置于烧杯中，加入45 mL苯，20 mL乙醇，浸泡6 h以对纤维进行脱脂处理，处理结束后对混合溶液进行减压蒸发以回收苯和乙醇，脱脂后的棉纤维用去离子水冲洗5次，于50 ℃的烘箱中烘干。

2）取5 g烘干后的棉纤维粉末，加入200 mL的4%乙酸，在75 ℃的水浴中加热12 h后抽滤，取沉淀，用去离子水洗涤5遍后加入200 mL的7%的氢氧化钠，在75 ℃的水浴中加热12 h后抽滤，将沉淀用去离子水冲洗5遍。

3）取步骤2中最后所得沉淀，加入料液质量比为1:30的8%过氧化氢，在45 ℃水浴中加热5 h后抽滤，将沉淀用去离子水冲洗5遍，在50 ℃烘箱中烘干，得到纤维素粉末。

4）取2.5 g步骤3中所得纤维素粉末，加入75 mL去离子水，准确称量0.4 g酶活为10000 u/g的纤维素酶和0.1 g酶活为10000 u/g的β-葡萄糖苷酶加入至溶液中后调节pH为4，进行酶解反应8 h。

5）取一个100 mL烧杯，用移液管移取8 mL聚乙二醇-400至烧杯中，接着加入5 mL去离子水，最后加入8 mL预先配好的30%硫酸铵溶液，搅拌均匀后于4 ℃下储存。

6）酶解反应结束后，在剩余溶液中加入25 mL步骤5中所配萃取液，搅拌混合均匀后置于4 ℃环境中8 h，然后将溶液在12000 r/min的转速下离，离心后溶液分层，分别收集上下层液相进行真空冷冻干燥，上层有机相冻干后得到酶，可以重复利用，下层溶液冻干后得到葡萄糖粉末。

7）取0.2 g牛血清蛋白和1 g步骤6中所得葡萄糖粉末溶于20 mL去离子水中，搅拌均匀后对溶液进行真空冷冻干燥，冻干后所得粉末溶于30 mL饱和溴化钾溶液并在60 ℃，相对湿度65%的恒温恒湿箱中放置7天。

8）对步骤7中所得溶液进行真空冷冻干燥，最终获得葡萄糖-牛血清蛋白偶联物。

实施例2

1）取10 g棉纤维，研磨4分钟后置于烧杯中，加入50 mL苯，25 mL乙醇，浸泡8 h以对纤维进行脱脂处理，处理结束后对混合溶液进行减压蒸发以回收苯和乙醇，脱脂后的棉纤维用去离子水冲洗5次，于50 ℃的烘箱中烘干。

2）取5 g烘干后的棉纤维粉末，加入200 mL的5%乙酸，在75 ℃的水浴中加热12 h后抽滤，取沉淀，用去离子水洗涤5遍后加入200 mL的8%的氢氧化钠，在75 ℃的水浴中加热12 h后抽滤，将沉淀用去离子水冲洗5遍。

3）取步骤2中最后所得沉淀，加入料液质量比为1:30的10%过氧化氢，在45 ℃水浴中加热5 h后抽滤，将沉淀用去离子水冲洗5遍，在50 ℃烘箱中烘干，得到纤维素粉末。

4.）取2.5 g步骤3中所得纤维素粉末，加入75 mL去离子水，准确称量0.5 g酶活为10000 u/g的纤维素酶和0.2 g酶活为10000 u/g的β-葡萄糖苷酶加入至溶液中后调节pH为4.5，进行酶解反应8 h。

5）取一个100 mL烧杯，用移液管移取10 mL聚乙二醇-400至烧杯中，接着加入5 mL去离子水，最后加入10 mL预先配好的30%硫酸铵溶液，搅拌均匀后于4 ℃下储存。

6）酶解反应结束后，在剩余溶液中加入25 mL步骤5中所配萃取液，搅拌混合均匀后置于4 ℃环境中8 h，然后将溶液在12000 r/min的转速下离，离心后溶液分层，分别收集上下层液相进行真空冷冻干燥，上层有机相冻干后得到酶，可以重复利用，下层溶液冻干后得到葡萄糖粉末。

7）取0.2 g牛血清蛋白和1 g步骤6中所得葡萄糖粉末溶于20 mL去离子水中，搅拌均匀后对溶液进行真空冷冻干燥，冻干后所得粉末溶于30 mL饱和溴化钾溶液并在60 ℃，相对湿度65%的恒温恒湿箱中放置7天。

8）对步骤7中所得溶液进行真空冷冻干燥，最终获得葡萄糖-牛血清蛋白偶联物。

实施例3

1）取10 g棉纤维，研磨5分钟后置于烧杯中，加入55 mL苯， 30 mL乙醇，浸泡10 h以对纤维进行脱脂处理，处理结束后对混合溶液进行减压蒸发以回收苯和乙醇，脱脂后的棉纤维用去离子水冲洗5次，于50 ℃的烘箱中烘干。

2）取5 g烘干后的棉纤维粉末，加入200 mL的6%乙酸，在75 ℃的水浴中加热12 h后抽滤，取沉淀，用去离子水洗涤5遍后加入200 mL的9%的氢氧化钠，在75 ℃的水浴中加热12 h后抽滤，将沉淀用去离子水冲洗5遍。

3）取步骤2中最后所得沉淀，加入料液质量比为1:30的12%过氧化氢，在45 ℃水浴中加热5 h后抽滤，将沉淀用去离子水冲洗5遍，在50 ℃烘箱中烘干，得到纤维素粉末。

4）取2.5 g步骤3中所得纤维素粉末，加入75 mL去离子水，准确称量0.6 g酶活为10000 u/g的纤维素酶和0.3 g酶活为10000 u/g的β-葡萄糖苷酶加入至溶液中后调节pH为5，进行酶解反应8 h。

5）取一个100 mL烧杯，用移液管移取12 mL聚乙二醇-400至烧杯中，接着加入5 mL去离子水，最后加入12 mL预先配好的30%硫酸铵溶液，搅拌均匀后于4 ℃下储存。

6）酶解反应结束后，在剩余溶液中加入25 mL步骤5中所配萃取液，搅拌混合均匀后置于4 ℃环境中8 h，然后将溶液在12000 r/min的转速下离，离心后溶液分层，分别收集上下层液相进行真空冷冻干燥，上层有机相冻干后得到酶，可以重复利用，下层溶液冻干后得到葡萄糖粉末。

7）取0.2 g牛血清蛋白和1 g步骤6中所得葡萄糖粉末溶于20 mL去离子水中，搅拌均匀后对溶液进行真空冷冻干燥，冻干后所得粉末溶于30 mL饱和溴化钾溶液并在60 ℃，相对湿度65%的恒温恒湿箱中放置7天。

8）对步骤7中所得溶液进行真空冷冻干燥，最终获得葡萄糖-牛血清蛋白偶联物。本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。