荧光假单胞菌pf27在抗烟粉虱和防治马铃薯病害中的应用

摘要

本发明公开了荧光假单胞菌pf27在抗烟粉虱和防治马铃薯病害中的应用。本发明的荧光假单胞菌pf27或其菌剂或其发酵液或其代谢液对危害番茄、黄瓜等蔬菜及棉花等众多作物害虫的烟粉虱有很好的防治效果，又能够广谱、高效抑制马铃薯黑痣病、晚疫病和马铃薯疮痂病等主要的马铃薯病害。不仅可以提高农作物抗烟粉虱虫害的作用，也解决了农药残留和环境污染等问题，有利于促进环境保护及农业可持续发展，具有较好的应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及荧光假单胞菌pf27在抗烟粉虱和防治马铃薯病害中的应用。

背景技术

马铃薯是目前种植量较大的农作物，由于其生长适应性强、味道好和营养丰富等特点，种植范围较大，逐步被认定为继玉米、小麦、水稻之后的第四大主粮，人们对马铃薯的需求量也越来越大。马铃薯生长过程中容易出现一些病害，如晚疫病、早疫病、疮痂病和病毒病等多种病害，已经严重影响到马铃薯的生长情况，甚至会导致马铃薯块茎腐烂等。而农业害虫烟粉虱俗称小白蛾，是近年来新发生的一种虫害，严重危害番茄、黄瓜、辣椒等蔬菜及棉花等众多作物。目前，国内外对病虫害的防治多从农业防治和化学防治出发，防治效果不明显，而且造成了一定程度的环境污染。

生物防治由于其自身的优点开始受到越来越多的重视。假单胞菌通常具有植物促生作用，同时能够增强植物对于病原物和非生物胁迫的抗性，被称作植物促生细菌(Plantgrowth-promoting bacteria，PGPB)或植物根围促生细菌，荧光假单胞菌(Psedomonasfluorescens)作为一种重要的生防细菌，可通过抑制病原菌的发生、诱导系统抗性、产生植物激素和提高植物生长量来促进植株的生长发育，是微生物肥料和生防制剂生产中最常见也是最重要的菌种之一。石晶盈等(2011)研究发现铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)MGP3发酵液对采后番木瓜炭疽病和疫霉病的防治效果分别达到50％和71％，并且MGP3菌液可以显著降低除苗期外果实炭疽菌的潜伏侵染率和炭疽病的病情指数。韦巧婕等(2013)研究发现拮抗菌Bacillus sp.B与有机肥发酵混配使用对黄瓜枯萎病有显著的防治作用，发病率降低了66.7％，病情指数下降了67％，防治效果达到80.7％；而单纯使用有机肥发病率不仅不能降低，而且还有所上升。

因此，开发新的、更为高效和安全的微生物杀菌剂来控制病害的发生是提高社会生产总量的需要，同时更是农业安全可持续发展的需要，符合社会发展需求。

发明内容

本发明的一个目的是提供荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens或其菌剂或其发酵液或其代谢液或其菌悬液或其培养液的新用途。

本发明提供了荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens或其菌剂或其发酵液或其代谢液或其菌悬液或其培养液在防治马铃薯病害中的应用。

本发明还提供了荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens或其菌剂或其发酵液或其代谢液或其菌悬液或其培养液在制备防治马铃薯病害的产品中的应用。

本发明还提供了荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens或其菌剂或其发酵液或其代谢液或其菌悬液或其培养液在抗菌和/或抑菌中的应用。

本发明还提供了荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens或其菌剂或其发酵液或其代谢液或其菌悬液或其培养液在制备抗菌和/或抑菌的产品中的应用。

本发明还提供了荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens或其菌剂或其发酵液或其代谢液或其菌悬液或其培养液在防治农业害虫中的应用。

本发明还提供了荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens或其菌剂或其发酵液或其代谢液或其菌悬液或其培养液在制备防治农业害虫的产品中的应用。

上述应用中，所述农业害虫为烟粉虱Bemisia tabaci。

本发明还提供了荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens或其菌剂或其发酵液或其代谢液或其菌悬液或其培养液在提高植物对烟粉虱的抵抗能力中的应用。

本发明还提供了荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens或其菌剂或其发酵液或其代谢液或其菌悬液或其培养液在制备提高植物对烟粉虱的抵抗能力的产品中的应用。

本发明的另一个目的是提供一种产品；所述产品具有如下1)-4)中任一种功能：

1)防治马铃薯病害；

2)抗菌和/或抑菌。

3)防治农业害虫；所述农业害虫具体为烟粉虱；

4)提高植物对烟粉虱的抵抗能力；

本发明提供的产品的活性成分为荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens或其菌剂或其发酵液或其代谢液或其菌悬液或其培养液；

上述应用或产品中，所述荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens为荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens pf27。

上述应用或产品中，所述马铃薯病害为马铃薯真菌病害、马铃薯卵菌病害和马铃薯细菌病害；

所述马铃薯真菌病害具体为马铃薯黑痣病；

所述马铃薯卵菌病害具体为马铃薯晚疫病；

所述马铃薯细菌病害具体为马铃薯疮痂病。

上述应用或产品中，所述菌为马铃薯黑痣病菌和/或马铃薯晚疫病菌和/或马铃薯疮痂病菌。所述马铃薯黑痣病菌具体为马铃薯黑痣病菌GS-3；所述马铃薯晚疫病菌具体为马铃薯晚疫病菌88069和T30-4；所述马铃薯疮痂病菌具体为马铃薯疮痂病菌4.1789、4.0076和4.1756。

本发明还有一个目的是提供一种防治马铃薯病害的方法。

本发明提供的防治马铃薯病害的方法包括用荧光假单胞菌Pseudomonasfluorescens pf27或其菌剂或其发酵液或其代谢液或其菌悬液或其培养液处理马铃薯幼苗的步骤。

本发明最后一个目的是提供一种防治农业害虫烟粉虱的方法。

本发明提供的防治农业害虫烟粉虱的方法包括用荧光假单胞菌Pseudomonasfluorescens pf27或其菌剂或其发酵液或其代谢液或其菌悬液或其培养液处理植物幼苗的步骤。

上述方法中，所述植物可为十字花科、葫芦科、豆科、茄科和锦葵科等植物；所述葫芦科植物具体可为黄瓜，所述茄科植物具体可为番茄、马铃薯和烟草；所述锦葵科植物具体可为棉花。

上述应用或产品或方法中，

所述pf27菌剂的制备方法如下：将荧光假单胞菌pf27接种于KB培养基中，在28℃，200rpm条件下振荡培养12-16h，然后4000rpm离心20min，弃上清液，收集菌体沉淀，再用灭菌水将所述菌体沉淀进行稀释，即得到pf27菌剂。

所述pf27发酵液的制备方法如下：将荧光假单胞菌pf27接种于KB培养液中，在28℃，200rpm条件下振荡培养12-16h，然后4000rpm离心20min，收集上清液，即得到pf27发酵液。

所述pf27代谢液的制备方法如下：将pf27发酵液经过0.22μm滤膜过滤(该步骤的目的是除菌)，收集滤液，即得到pf27代谢液。

本发明的荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens pf27的分类命名为荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens，该菌株已于2017年5月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.14105。

本发明通过对已有菌株的再次开发，筛选到对多寄主危害烟粉虱和马铃薯主要病害有防治效果的荧光假单胞菌pf27。通过实验证明：pf27菌剂处理番茄幼苗后能够诱导番茄植株对害虫烟粉虱的抗性，其抑制效果在产卵和幼虫发育方面均达到约50％，双向选择实验数据显示pf27对烟粉虱具有明显的驱虫效果。在对马铃薯的主要病害的抑菌效果中，pf27发酵液对马铃薯黑痣病GS-3的抑菌效果为82.56％，马铃薯晚疫病88069抑菌效果为47.33％，同时pf27代谢液对马铃薯疮痂病4.0076、4.1576和4.1789平均抑菌效果分别为49.74％、39.39％和45.47％，而大肠杆菌E.coli对这三个株系的细菌病害的平均抑菌率分别只有5.73％、17.37％和11.89％。上述结果充分说明pf27发酵液或代谢液对马铃薯主要病害具有广谱的抑菌效果。本发明的pf27菌剂或pf27发酵液或pf27代谢液作为一种生物源农药，具有广谱、高效和安全的优点，不仅避免了化学农药大量使用带来的残留和环境污染等问题，而且有利于促进环境保护及农业可持续发展，具有较好的应用前景。

附图说明

图1为基于16s rDNA序列构建的pf27系统发育树。

图2为微生物菌剂pf27对烟粉虱的抵抗能力。A为烟粉虱在番茄幼苗植株上产卵和发育到四龄幼虫的示意图；B为烟粉虱在对照番茄植株(Control)和pf27菌剂处理的番茄植株的双向选择示意图；C为烟粉虱在pf27菌剂处理和对照(Control)的番茄植株上产卵的数目统计。D为烟粉虱成虫对pf27菌剂处理和对照(Control)的番茄植株上双向选择的比率的统计。E为烟粉虱在pf27菌剂处理和对照(Control)的番茄植株单个叶片上发育到四龄幼虫的数目统计。F为自然条件下烟粉虱成虫在pf27菌剂处理和对照(Control)的马铃薯幼苗上的生长状态。注：*表示在0.05水平上差异显著，**表示在0.01水平上差异显著(同下)。

图3为马铃薯第4，5茎叶接种马铃薯黑痣病GS-3的发病情况统计，照片拍摄接种6天后。A为pf27菌剂处理组和对照组马铃薯叶片接种马铃薯黑痣病GS-3孢子悬浮液后的发病情况，其中，上图为对照组马铃薯叶片接种马铃薯黑痣病GS-3孢子悬浮液的发病情况；下图为pf27菌剂处理组马铃薯叶片接种GS-3孢子悬浮液发病情况。每个处理4个生物学重复，实验重复3次。B为pf27菌剂处理组和对照组马铃薯叶片接种马铃薯黑痣病GS-3发病的病斑面积统计，n＝12。

图4为马铃薯第4，5茎叶接种马铃薯晚疫病88069和T30-4的发病情况，照片拍摄接种6天后。A为马铃薯第4，5茎叶接种马铃薯晚疫病T30-4的发病情况，其中，上图为pf27菌剂处理组马铃薯叶片接种马铃薯晚疫病T30-4孢子悬浮液的发病情况；下图为对照组马铃薯叶片接种马铃薯晚疫病T30-4孢子悬浮液发病情况，每个处理4个生物学重复，实验重复3次。B为pf27菌剂处理组和对照组马铃薯叶片接种马铃薯晚疫病T30-4发病的病斑面积数据统计，n＝12。C为马铃薯第4，5茎叶接种马铃薯晚疫病88069的发病情况，其中，上图为pf27菌剂处理组马铃薯叶片接种马铃薯晚疫病88069孢子悬浮液的发病情况；下图为对照组马铃薯叶片接种马铃薯晚疫病88069孢子悬浮液发病情况，每个处理4个生物学重复，实验重复3次。D为pf27菌剂处理组和对照组马铃薯叶片接种马铃薯晚疫病88069发病的病斑面积，n＝12。

图5为微生物pf27发酵液对马铃薯黑痣病GS-3、马铃薯晚疫病T30-4和88069的抑菌示意图。

图6为pf27菌剂对马铃薯黑痣病GS-3、马铃薯晚疫病88069和T30-4的抑菌实验。A为pf27菌剂处理组和对照组平板接种马铃薯晚疫病88069和T30-4菌斑的生长情况，其中，左图为pf27菌剂处理组和对照组平板接种马铃薯晚疫病88069菌斑的生长情况，右图为pf27菌剂处理组和对照组平板接种马铃薯晚疫病T30-4菌斑生长情况。B为pf27菌剂处理组和对照组平板接种马铃薯黑痣病GS-3菌斑的生长情况。C为pf27菌剂对马铃薯晚疫病88069、T30-4和马铃薯黑痣病GS-3的抑制率的柱形图统计。每个处理4个生物学重复，实验重复3次。

图7为pf27代谢液对马铃薯疮痂病4.1789、4.0076和4.1756的抑菌实验。A为接种马铃薯疮痂病4.1789、4.0076和4.1756的实验组、对照组、空白组培养基中的菌斑生长情况。B为接种马铃薯疮痂病4.1789、4.0076和4.1756的实验组、对照组、空白组培养基中的抑制率的柱形图统计。每个处理4个生物学重复，实验重复3次。

保藏说明

菌种名称：荧光假单胞菌

拉丁名：Pseudomonas fluorescens

菌株编号：pf27

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏机构简称：CGMCC

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏日期：2017年5月8日

保藏中心登记入册编号：CGMCC No.14105

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中所用培养基配方如下(液体培养基仅将固体培养基中的琼脂粉去除，且保持其他组分和浓度不变)：

MEA培养基(固体)：Malt extract 30g，Mycological peptone 5g，琼脂粉15g，pH5.4；

牛肉膏蛋白胨培养基(固体)：蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，琼脂粉12g，水1000mL，pH 7.2-7.4；

LB培养基(固体)：氯化钠10g，蛋白胨10g，酵母提取物5g，琼脂粉12g，水1000mL，pH7.0；

KB培养基(固体)：蛋白胨20g，K₂HPO₄>4>2O补足到1L，pH>

PDA培养基(固体)：去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂粉15g，水1000mL。

10％V8培养基(固体)：V8汁上清液(将超市内购买的V8汁4000rpm离心10min，收集上清液)100mL，CaCO₃>

下述实施例中的马铃薯黑痣病菌GS-3记载于如下文献：赵伟全等，2006，中国马铃薯疮痂病菌的鉴定，公众可从申请人处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的马铃薯晚疫病菌T30-4记载于如下文献：Sansome E等，Disploidyand chromosomal structural hybridity in Phytophthora infestans.Nature)；马铃薯晚疫病菌88069记载于如下文献：刘卫，马铃薯晚疫病抗性相关基因StBL-SLGPK的克隆和功能分析；公众可从申请人处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的马铃薯疮痂病菌4.0076购自中国农业微生物菌种保藏管理中心，菌种目录编号为ACCC40076；马铃薯疮痂病菌4.1756和4.1789购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号分别为CGMCC No.4.1756和CGMCC No.4.1789。

实施例1、pf27菌株的分离与鉴定

一、pf27菌株的分离

pf27分离自云南省普洱市疣粒野生稻区根际土壤(北纬22^。33’56”，100^。35’12”，海拔737米)。具体分离方法如下：将采自疣粒野生稻区的根际土壤，挑取根系，刮取根际土，称量5g，无菌条件下放进已准备好的灭菌三角瓶中，用灭菌水梯度稀释到10^-6倍，设置3个重复。将梯度稀释的土壤样品取200μL分别涂到MEA培养基、牛肉膏蛋白胨培养基、LB培养基和KB培养基平板上，分别在28℃，37℃培养箱中培养，每天观察菌落的生长状态，结果显示稀释为10^-5、10^-6倍时平板上基本上没有菌落长出，而稀释为10^-4倍时，平板上能长出单一的菌落，并挑取在KB培养基上长出单一的菌落，将其命名为pf27菌株，然后在KB液体培养基中扩大培养，做进一步的菌株鉴定。

二、pf27菌株的鉴定

1、pf27菌株的形态鉴定

pf27菌株在KB培养基上培养24h～48h后可形成橙色菌落，菌落状态呈圆形，表面光滑有凸起边缘整齐，较粘稠，易挑起。

2、pf27菌株的分子鉴定

提取pf27菌株的DNA，采用通用引物Eubac27F/Eubac1492R进行PCR扩增，得到含有pf27菌株16S rDNA保守区的PCR产物。引物序列如下：

Eubac27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；

Eubac1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’。

将PCR产物经TA克隆连接到pEASY-T3(购买自北京全式金生物有限公司)，以通用引物在英潍捷基公司测序。

测序结果表明：PCR产物的核苷酸序列如序列1所示。将测序所得序列与NCBI数据库进行blast比对后，通过MEGA5.1软件对pf27和其他代表22种不同假单胞菌种的荧光假单胞模式菌株进行系统发育分析，系统发育树如图1所示。

综合上述鉴定结果，确定pf27菌株的分类命名为荧光假单胞菌Pseudomonasfluorescens，该菌株已于2017年5月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC No.14105。

实施例2、微生物pf27菌剂、微生物pf27发酵液和微生物pf27代谢液的制备

1、微生物pf27菌剂的制备

将实施例1中获得的荧光假单胞菌pf27接种于KB培养基中，在28℃，200rpm条件下振荡培养12-16h，然后4000rpm离心20min，弃上清液，收集菌体沉淀，再用灭菌水将菌体沉淀进行稀释，制成微生物pf27菌剂(菌剂pf27)，微生物pf27菌剂成品中pf27活菌总浓度为1×10⁹-1×10¹⁰CFU/mL。

2、微生物pf27发酵液的制备

将实施例1中获得的荧光假单胞菌pf27接种于KB培养液中，在28℃，200rpm条件下振荡培养12-16h，然后4000rpm离心20min，收集上清液，即为微生物pf27发酵液，微生物pf27发酵液成品中pf27活菌总浓度为1×10²-1×10³CFU/mL。

3、微生物pf27代谢液的制备

将步骤2中微生物pf27发酵液经过0.22μm滤膜过滤(该步骤的目的是除菌)，收集滤液，即为微生物pf27代谢液。

实施例3、微生物pf27菌剂对农业害虫烟粉虱的抵抗能力

一、实验方法

1、番茄植株

(1)将中杂9号番茄种子(中蔬种业科技(北京)有限公司生产)用3％NaClO溶液消毒10min后，用ddH₂O清洗6次，得到消毒后种子。然后将消毒后种子均匀铺在灭菌的蛭石泥炭土基质(蛭石和泥炭土按照1:1的比例混匀，121℃高压灭菌20min)中，在26℃，光照：黑暗(12h:12h)条件下培养种子萌发，待种子萌发生长到两片真叶时，分别移栽到均匀添加pf27菌剂的蛭石泥炭土基质(每kg蛭石泥炭土基质添加50mL>5CFU/mL)中和对照(以不添加任何菌剂作为对照，Control)的营养穴中。番茄苗移栽到育苗穴盘中(穴盘规格：上口直径9厘米，下口直径6厘米，高度8厘米)，放置在温室中生长(生长条件：光照时间12h，温度26℃，相对湿度50％)。

(2)将生长到5周左右的番茄植株的单个叶片放置在盎司的塑料杯中(底、高、口径大小为32mm×34mm×40mm，将塑料杯一侧开直径为5mm左右的开口，用于将烟粉虱置于杯中；另一侧从口径位置处开2mm左右的开口，用于放置叶柄)，然后将刚孵化的烟粉虱成虫(3头雌成虫和3头雄成虫)从开口处接种到单片番茄叶子，再用透气的医用胶带将其开口封住。10天后统计每个番茄叶片上的产卵量。每个处理8个生物学重复，实验重复3次。

(3)将生长到5周左右的番茄植株的单个叶片放置在盎司的塑料杯中，将16头雌成虫接种到单个番茄叶片上，经过2天的产卵时间，将全部的成虫移除，22天后统计每个番茄叶片上发育到4龄幼虫的数量。每个处理8个生物学重复，实验重复3次。

(4)将生长到5周左右的pf27菌剂处理组和对照组的番茄幼苗分别放置在120目的笼子(40cm×40mm×40mm)的两侧，然后将烟粉虱成虫在冰上冷冻2分钟，每次数100头烟粉虱成虫放置两株番茄之间，15分钟后统计两株番茄上的烟粉虱的数目，计算烟粉虱在两株番茄上的选择率。选择率的计算方法：统计100头烟粉虱中分别在pf27处理组和对照组植株上的烟粉虱数目，并且相加得选择的烟粉虱数目总和，计算pf27处理组和对照组植株上烟粉虱所占选择的总烟粉虱百分数。每个处理6个生物学重复，实验重复3次。

2、马铃薯植株

将购买自北京首航超市内的土豆放置在潮湿黑暗的环境中，经过一周后，挑选出芽一致的健康土豆的芽，用70％的酒精灭菌消毒刀片后将其切下。然后将幼芽分别移栽到均匀添加pf27菌剂的灭菌的蛭石泥炭土基质(每kg蛭石泥炭土基质添加50mL>5CFU/mL)和对照(以不添加任何菌剂作为对照，Control)的营养穴中，并置于塑料花盆(规格：上口直径为14厘米，下口直径为9.5厘米，高度为12.5厘米)内培养，表面覆盖一层保鲜膜保湿，待其长出子叶后将保鲜膜去掉，放置自然条件下生长，得到马铃薯幼苗。

(2)自然条件下观察烟粉虱成虫在pf27菌剂处理下和对照的马铃薯幼苗上的生长状态及数量。每个处理6个生物学重复，实验重复3次。

二、抗虫效果统计

在解剖镜下统计烟粉虱在选择的叶片上的产卵量、发育到4龄幼虫的数量及烟粉虱在pf27菌剂处理组和对照组的番茄植株的选择率。

结果如图2所示。和对照组相比，微生物pf27菌剂处理组的番茄上烟粉虱成虫产卵量和发育到4龄幼虫的数量显著降低，产卵量减少约50.11％，发育到4龄幼虫的虫量约减少33.51％。烟粉虱在pf27菌剂处理组和对照组的番茄植株的双向选择实验数据显示：pf27菌剂处理组的番茄植株对烟粉虱具有明显的驱虫作用，pf27菌剂处理组和对照组的选择率分别是35.28％和64.72％，驱虫效果为29.44％。同时在自然状态下观察pf27菌剂处理组的马铃薯幼苗植株对烟粉虱的影响，发现微生物pf27菌剂处理的马铃薯幼苗上的烟粉虱数量显著少于对照组的烟粉虱数量。

实施例4、微生物pf27菌剂对马铃薯黑痣病GS-3的致病力的影响

一、实验方法

1、马铃薯幼苗的种植

将购买自北京首航超市内的土豆放置在潮湿黑暗的环境中，经过一周后，挑选出芽一致的健康土豆的芽，用70％的酒精灭菌消毒刀片后将其切下。然后将幼芽分别移栽到均匀添加菌剂pf27的灭菌的蛭石泥炭土基质(每kg蛭石泥炭土基质添加50mL>5CFU/mL)和对照(以不添加任何菌剂作为对照，Control)的营养穴中，并置于塑料花盆(规格：上口直径为14厘米，下口直径为9.5厘米，高度为12.5厘米)内培养，表面覆盖一层保鲜膜保湿，待其长出子叶后将保鲜膜去掉，放置自然条件下生长，得到马铃薯幼苗。

2、菌液配置

将马铃薯黑痣病菌GS-3接种到PDA培养基上，培养到能够在显微镜下观察到成熟孢子囊的马铃薯黑痣病GS-3，利用含有0.01％吐温20的蒸馏水冲洗培养皿，收集孢子，制成孢子浓度为1.0×10⁵CFU/ml的GS-3孢子悬浮液，然后在室温下静置2～3小时后用于接种。

3、人工接种及病情调查

接种时取4和5叶位的叶顶端10片单叶，将叶柄插在浓度为1％的固体琼脂培养基上平板内，每个平板内放置两片单叶，加2mL灭菌的蒸馏水到平板上以保湿，每个单叶片中心滴20μL GS-3孢子悬浮液在叶片的上表面，最后盖上培养皿盖，用透气的医用胶带封住，放置在温度为20℃，光照：黑暗(12h:12h)，湿度为60％的条件下培养。同时以不滴加任何菌液的0.01％吐温20作为对照。处理第6天调查病斑面积，病斑面积计算公式：S＝(病斑长度×病斑宽度)×π/4。每个处理4个生物学重复，实验重复3次。

二、抗病效果统计

结果如图3所示。和对照组相比，微生物pf27菌剂处理组的马铃薯黑痣病GS-3发病降低，病斑面积平均显著性降低约46.61％。说明微生物pf27菌剂对马铃薯黑痣病GS-3有显著的抗病效果。

实施例5、微生物pf27菌剂对马铃薯晚疫病T30-4和88069两种菌致病力的影响

一、实验方法

1、马铃薯幼苗的种植

同实施例4步骤一中的1。

2、菌液配置

将马铃薯晚疫病菌T30-4和88069分别接种到10％V8固体培养基上，20℃黑暗环境培养2～3天后切取大小均匀的菌丝块，置于20mL的10％V8液体培养基中，于20℃黑暗静置培养2～3天后将菌丝丛移入无菌的培养皿中，加入适量的灭菌纯水，于26℃光照静置12h左右，即可产生大量游动孢子囊；利用含有0.01％吐温20的蒸馏水冲洗培养皿，收集孢子，制成孢子浓度为1.0×10⁵CFU/ml的T30-4悬浮液和88069悬浮液，然后在室温下静置2～3小时后用于接种。

3、人工接种及病情调查

人工接种及病情调查同实施例4步骤一中的3。每个处理4个生物学重复，实验重复3次。

二、抗病效果统计

结果如图4所示。和对照组相比，微生物pf27菌剂处理组的马铃薯叶片上接种马铃薯晚疫病T30-4和88069病原菌后，病斑面积显著性降低，接种T30-4的病斑面积减少了53.85％，接种88069的病斑面积则减少了79.80％。说明微生物pf27菌剂对马铃薯晚疫病T30-4和88069有显著的抗病效果。

实施例6、微生物pf27发酵液对马铃薯黑痣病GS-3、马铃薯晚疫病T30-4和88069的抑菌率的影响

一、实验方法

1、将pf27发酵液按照1:50的比例加入到已经融化并冷却至50℃左右的PDA培养基中，充分混匀后铺制平板，得到含有pf27菌剂的PDA培养基。同时设置不加任何菌剂的培养基为对照。

将pf27发酵液按照1:50的比例加入到已经融化并冷却至50℃左右的10％V8培养基中，充分混匀后铺制平板，得到含有pf27菌剂的V8培养基。同时设置不加任何菌剂的培养基为对照。

2、抑菌实验

将PDA培养基上培养5天的马铃薯黑痣病GS-3病原真菌菌落边缘打取直径为6mm、生长均匀的菌碟，菌丝面向下，接种于含有pf27菌剂的PDA培养基的中央，于20℃恒温培养。每个处理4个生物学重复，实验重复3次。

分别将V8培养基上培养5天的马铃薯晚疫病T30-4和88069病原真菌菌落边缘打取直径为6mm、生长均匀的菌碟，菌丝面向下，接种于含有pf27菌剂的V8培养基的中央，于20℃恒温培养。每个处理4个生物学重复，实验重复3次。

接种后逐日观察，并用十字交叉方法测量各供试病原真菌在培养基平板上的直径，并按照下列公式计算抑菌率：抑菌率(％)＝(对照菌落直径-处理菌落直径)/(对照菌落直径-菌饼直径)×100％，菌饼直径为6mm。抑菌示意图如图5所示。

二、抑菌效果统计

结果如表1和图7所示。在对马铃薯的主要病害马铃薯黑痣病GS-3、马铃薯晚疫病88069和T30-4的抑菌效果中，pf27菌剂对马铃薯黑痣病GS-3的抑菌率为82.56％，马铃薯晚疫病88069的抑菌率为47.33％，马铃薯晚疫病T30-4的抑菌率约为10％。

表1、pf27对马铃薯黑痣病、马铃薯晚疫病和马铃薯疮痂病的抑菌率统计

实施例7、微生物pf27代谢液对马铃薯疮痂病4.0076、4.1756和4.1789的抑菌率的影响

一、实验方法

1、将pf27代谢液按照1:50的比例加入到冷却至40℃左右的LB固体培养基中，混匀后在灭菌的超净台中制备固体培养平板，待平板凝固后在平板中央用打孔器打一个直径为6mm左右的孔，得到实验组培养基。

将大肠杆菌E.coli DH5α在LB液体培养基中，37℃，200rpm振荡培养12-16h，然后4000rpm离心20min，收集上清液，并将其用孔径为0.22μm的滤膜过滤，收集滤液，得到DH5α代谢液；将DH5α代谢液按照1:50的比例加入到冷却至40℃左右的LB固体培养基中，混匀后在灭菌的超净台中制备固体培养平板，待平板凝固后在平板中央用打孔器打一个直径为6mm左右的孔，得到对照组培养基。

同时在LB固体培养基中央用打孔器打一个直径为6mm左右的孔，得到空白组培养基。

2、将马铃薯疮痂病病菌4.0076、4.1756和4.1789分别接种到LB液体培养基中，在28℃，200rpm条件下振荡培养12-16h后，分别获得马铃薯疮痂病病原菌液4.0076，4.1756和4.1789。取20μL的马铃薯疮痂病病原菌液4.0076，4.1756和4.1789分别加入到步骤1制备的实验组培养基、对照组培养基和空白组培养基的6mm孔内，逐日观察，并统计抑菌率。抑菌率(％)＝(空白组菌落直径-处理组菌落直径)/(空白组菌落直径-菌饼直径)×100％。处理组分别为实验组和对照组。菌饼直径为6mm。

二、抑菌效果统计

结果如表1和图7所示。pf27代谢液对马铃薯的主要病害马铃薯疮痂病的4.0076、4.1576和4.1789平均抑菌率分别达到了49.74％、39.39％和45.47％，而大肠杆菌E.coliDH5α对马铃薯疮痂病的4.0076、4.1576和4.1789的平均抑菌率分别只有5.73％、17.37％和11.89％。说明pf27代谢液对马铃薯三个细菌病害具有很好的抑菌效果。

综上所述，pf27菌剂或pf27发酵液或pf27代谢液对马铃薯主要病害具有广谱的抑菌效果。

序列表

<110>中国科学院微生物研究所

<120>荧光假单胞菌pf27在抗烟粉虱和防治马铃薯病害中的应用

<160>1

<210>1

<211>1508bp

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

agagtttgat cctggctcag attgaacgct ggcggcaggc ctaacacatg caagtcgagc 60

ggtagagaga agcttgcttc tcttgagagc ggcggacggg tgagtaatgc ctaggaatct 120

gcctggtagt gggggataac gttcggaaac gaacgctaat accgcatacg tcctacggga 180

gaaagcaggg gaccttcggg ccttgcgcta tcagatgagc ctaggtcgga ttagctagtt 240

ggtgaggtaa tggctcacca aggcgacgat ccgtaactgg tctgagagga tgatcagtca 300

cactggaact gagacacggt ccagactcct acgggaggca gcagtgggga aaattggaca 360

atgggcgaaa gcctgatcca gccatgccgc gtgtgtgaag aaggtcttcg gattgtaaag 420

cactttaagt tgggaggaag ggcagttacc taatacgtga ttgttttgac gttaccgaca 480

gaataagcac cggctaactc tgtgccagca gccgcggtaa tacagagggt gcaagcgtta 540

atcggaatta ctgggcgtaa agcgcgcgta ggtggtttgt taagtaggat gtgaaatccc 600

cgggctcaac ctgggaactg cattcaaaac tgactgacta gagtatggta gagggtggtg 660

gaatttcctg tgtagcggtg aaatgcgtag atataggaag gaacaccagt ggcgaaggcg 720

accacctgga ctaatactga cactgaggtg cgaaagcgtg gggagcaaac aggattgata 780

ccctggtagt ccacgccgta aacgatgtca actagccgtt ggaagccttg agcttttagt 840

ggcgcagcta acgcattaag ttgaccgcct ggggagtacg gccgcaaggt taaaactcaa 900

atgaattgac gggggcccgc acaagcggtg gagcatgtgg tttaattcga agcaacgcga 960

agaaccttac caggccttga catccaatga actttctaga gatagattgg tgccttcggg 1020

aacattgaga caggtgctgc atggctgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg ttgggttaag 1080

tcccgtaacg agcgcaaccc ttgtccttag ttaccagcac gtaatggtgg gcatctaagg 1140

agactgccgg tgacaaaccg gaggaaggtg gggatgacgt caagtcatca tggcccttac 1200

ggcctgggct acacacgtgc tacaatggtc ggtacagagg gttgccaagc cgcgaggtgg 1260

agctaatccc ataaaaccga tcgtagtccg gatcgcagtc tgcaactcga ctgcgtgaag 1320

tcggaatcgc tagtaatcgc gaatcagaat gtcgcggtga atacgttccc gggccttgta 1380

cacaccgccc gtcacaccat gggagtgggt tgcaccagaa gtagctagtc taaccttcgg 1440

gaggacggtt accacggtgt gattcatgac tggggtgaag tcgtaacaag gtaaccaagg 1500

gcgatccc 1508