一种基于代谢组学分析的用于抗氧化衰老药物筛选的大鼠模型的构建方法

摘要

本发明公开了一种基于代谢组学分析的用于抗氧化衰老药物筛选的大鼠模型的构建方法。采用LC‑MS谱对采集的尿样检测分析；采用PCA、PLS‑DA及OPLS‑DA等技术对正常对照组、模型组、阳性对照组、鞣花酸高剂量组、中剂量组、低剂量组六组大鼠尿液代谢物进行聚类分析，筛选出潜在的生物标志物；运用KEGG数据库进行信号通路分析，用HMDB数据库对代谢产物分子注释、相关的酶或转运蛋白及其相关性质进行分析，Met PA网络软件对代谢产物路径进行可视化作图，构建鞣花酸改善D‑型半乳糖致衰老大鼠尿液代谢组学的代谢通路，为抗氧化衰老药物新药的筛选、评价和研发提供代谢组学方法思路。

说明书

技术领域

本发明属于代谢组学分析技术领域，具体涉及一种基于代谢组学分析的用于抗氧化衰老药物筛选的大鼠模型的构建方法。

背景技术

衰老是一种受遗传、环境条件、生活方式等多种复杂因素影响的生物学过程^[1]。自由基衰老学说认为机体细胞代谢产生的自由基引起的氧化损伤是加速机体衰老的关键因素；随着衰老的加剧，机体各种生理功能也随之下降，表现为精神不振、健忘、形寒肢冷、纳差少眠、腰膝无力、气短乏力，甚则面浮肿等，对人体的身体健康和生活质量也是极为不利的^[2]。衰老虽不可逆转，但可以缓解。大量研究表明，补充抗氧化剂则可以起到清除自由基，减缓衰老的作用^[3]。然而，现阶段对衰老及其防治措施的研究还远远不够，因此抗氧化衰老药物的筛选及其开发研究仍然是当前众多学者备受关注的重点课题之一。

目前，D-半乳糖亚急性损伤模型是研究衰老机制、筛选抗氧化衰老药物常用的动物模型，利用连续注射D-半乳糖的方法，使动物在短期内发生氧化/抗氧化功能失调，人为复制出过氧化衰老损伤动物模型。但在保健食品抗氧化功能评价中，该模型的复制存在D-半乳糖染毒剂量、染毒途径、染毒时间及脏器指标选择不明和评价时间较长等缺点，另外加上实验大鼠个体之间差异，所以这种用于筛选和评价抗氧化衰老药物的大鼠模型所实施得到的结果往往缺乏一定的准确性和可信性^[4]。为全面系统科学地筛选和开发抗氧化衰老新药，因此，一种具有统一、量化、特异性强、快速、科学而全面等特点的用于筛选和评价抗氧化衰老药物的大鼠模型的方法亟待构建^[5]。

代谢组学是继蛋白组学之后发展起来的一种全新的组学技术，利用高分离效率、高灵敏度及低检测限的先进分析仪器，以生物体内的小分子内源性代谢物的动态变化规律从整体来阐明机体生理病理变化趋势，在定性、定量分析研究疾病进展规律和药效关系等方面具有广泛的应用^[6]。近年来研究发现，诸如代谢性疾病和恶性肿瘤等疾病发生发展过程中，机体基础生化代谢均发生了明显变化，代谢组学为复杂疾病的筛检和早期诊断提供崭新的技术方法。

参考文献

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发明内容

为了解决现有用于抗氧化衰老药物筛选的大鼠模型的构建及评价方法存在准确性低、成本高、系统性差等技术问题，本发明提供了一种基于代谢组学分析的用于抗氧化衰老药物筛选的大鼠模型的构建方法。

本发明通过以下技术方案实现：

本发明的第一方面，提供一种关于鞣花酸对D-型半乳糖致衰老大鼠干预的尿液代谢组学生物标志物的筛选及代谢通路分析的试验方法，包括以下步骤：

1)将实验动物分成正常组(空白组)、模型组、阳性对照组、高剂量组、中剂量组和低剂量组，进行注射、灌胃处理并收集尿液样本；

2)制备尿液样本并获得LC-MS谱的数据；

3)采用统计学的方法，进行LC-MS数据处理与模式识别，寻找出鞣花酸对D-型半乳糖致衰老大鼠干预的尿液代谢组学生物标志物；

4)运用代谢组学相关数据库和网络软件，构建生物标志物的代谢通路并进行分析。

步骤1)中，动物处理及样品收集的的具体方法为：将48只SD大鼠于SPF级环境中适应性饲养一周，随机分为6组，即空白对照组、模型组、阳性对照组、高剂量组、中剂量组和低剂量组，每组8只。模型组、阳性对照组及鞣花酸给药组按100mg·kg-1·d-1剂量颈部皮下注射D-型半乳糖溶液一次，在此基础之上，阳性对照组每天灌胃给予150mg·kg-1的维生素E；高、中、低剂量的给药组分别灌胃给予150、100、50mg·kg-1·d-1的鞣花酸；正常组与模型组则均给予同等体积的生理盐水。各组大鼠每天按同一时间给予灌胃一次，连续灌胃8周，每周收集各组大鼠24h尿液，直到实验结束。

步骤2)中，尿液样本的制备和LC-MS数据获取的具体方法为：用代谢笼收集6组大鼠尿液，于-70℃低温下储存，检测时，取尿样于冰上融化，在1.5×104r·min-1，4℃下离心5min，取上清液0.5ml加入甲醇0.5ml，涡旋混匀，置4℃下静置3h，于3×104r·min-1，离心10min，取上清液，经0.22μm微孔滤膜过滤后用于LC-MS分析；LC-MS条件，液相条件为PHENOMEX QC MIX870色谱柱(50×4.6mm,2.6μm)，进样量1μl，柱温40℃，运行30min。流动相A乙腈，流动相B为0.1％甲酸，流速为2ml·min-1，洗脱条件见表1；质谱条件为正离子模式毛细管电压4000V；雾化器压力为40psi；干燥气流速：10L·min-1，干燥气温度：350℃，采用全扫描，质量扫描范围m/z 100～1500。

表1色谱梯度条件

步骤3)中，LC-MS数据处理和生物标志物筛选的具体方法为：采用MarkerView1.2.1软件对LC/ESI-MSn获得的原始质谱数据信息进行峰匹配、峰提取及数据导出等处理；将上述得到的数据导入SIMCIAP-12.0软件进行主成分分析。采用无监督模式识别的主成分分析法(PCA)、有监督模式识别的偏最小二乘法(PLS-DA)及正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)判别分析，通过得分图(Scores Plot)比较各组样本组间的差异，以R2X、R2Y、Q2等参数值来评价模型质量，其中R2X、R2Y越接近1表示模型越稳定，Q2>0.5表示预测率高；根据PLS-DA模型得到的变量权重值(VIP)，将VIP值大于1的变量作为生物标志物的候选变量，为了验证多维统计中找到的候选变量是否在单位统计上具有显著差别，实验中采用T检验，其中P<0.05有显著性差异；结合载荷图和筛选候选变量，通过这些变量所代表的化合物的质谱信息，在METLIN、HMDB、KEGG、PubChem等数据库中进行搜索、匹配和推测，最终确定可能的生物标志物；所有数据采用SPSS20.0统计分析软件进行处理，各组数据以(Mean±SD)表示，采用One-wayANOVA法来判别组间的差异性。

步骤4)中，生物标志物代谢通路的构建、分析的具体方法为：将前面已确定的尿液代谢谱(生物标志物)输入MetPA对话框中，选择Iuput(输入)标签中的compoud name(代谢产物名称)，点击Submit，选择物种：Mus musculus(mouse)，Hypergeometric Test(超几何分布检验)，Pathway Topology Analysis(通路拓扑结构分析)；采用Relative-betweenessCentrality(两中心相关)，然后注册进行通路模型分析。运用KEGG(Kyoto Encyclopediaof Genes and Genomes；http://www.kegg.jp/)数据库进行信号通路分析，用HMDB(TheHuman Metabolome Database；http://www.hmdb.ca/)数据库对代谢产物分子注释、相关的酶或转运蛋白及其相关性质进行分析，Met PA网络软件(MetaboAnalyst3.0)对代谢产物路径进行可视化作图。

进一步的，步骤3)确定的鞣花酸对D-型半乳糖致衰老大鼠干预的尿液代谢组学12个生物标志物的新用途，以这12个生物标志物用于评价D-型半乳糖致衰老大鼠模型，所述的12个生物标志物为丙酮酸(Pyruvic acid)、乳酸(Lacticacid)、色氨酸(Tryptophan)、柠檬酸(Citric acid)、α-酮戊二酸(α-Ketoglutaricacid)、肌酸(Creatine)、马尿酸(Hippuric acid)、甘氨酸(Glycine)、胆碱(Choline)、甜菜碱(Betaine)、牛磺酸、丙氨酸；其中，12个生物标志物用于评价D-型半乳糖致衰老大鼠模型的方法如下：

采用步骤2)的LC-MS分析方法获得空白对照组、模型组大鼠尿液中12个生物标志物的含量；若模型大鼠尿液中色氨酸、牛磺酸、肌酸的含量比空白对照组高，而其余9种生物标志物的含量比空白对照组低，且差异是显著的，则D-型半乳糖致衰老大鼠模型成功。

进一步的，步骤3)确定的鞣花酸对D-型半乳糖致衰老大鼠干预的尿液代谢组学12个生物标志物用于抗衰老药物的筛选，具体筛选方法如下：

1)将实验动物分成正常组(空白组)、D-型半乳糖致衰老大鼠模型组、候选药物对D-型半乳糖致衰老大鼠干预组，收集尿液样本；

2)采用步骤2)的LC-MS分析方法获得空白对照组、D-型半乳糖致衰老大鼠模型组、候选药物干预组尿液中12个生物标志物的含量，若候选药物干预组尿液中色氨酸、牛磺酸、肌酸的含量比模型组低，而其余9种生物标志物的含量比模型组高，且差异是显著的，则该候选药物具有抗衰老活性。

本发明提供的一种基于代谢组学分析的用于抗氧化衰老药物筛选的大鼠模型的构建方法，通过代谢组学技术能获得机体内大量的内源性代谢物的生物信息，这些内源性代谢产物在大鼠体内的含量变化从一定程度上反映了颈部皮下注射D-型半乳糖诱导的致氧化衰老大鼠体内代谢水平的变化，为监测疾病生理状态下体内代谢物的变化和氧化衰老的预防和改善提供了一定依据；通过寻找出了与鞣花酸改善D-型半乳糖致衰老大鼠相关的潜在代谢靶标路径，为解释鞣花酸对D-型半乳糖致衰老大鼠干预的尿液代谢组学数据提供了最佳生物学信息，能从机体整体代谢水平研究鞣花酸对衰老的改善作用。且迄今为止，未见代谢组学方法用于抗氧化衰老药物筛选和评价的大鼠模型的构建。与以往的构建方法相比，该方法更全面灵敏、系统综合的体现造模前后机体的动态轮廓，综合地体现模型复制的合理性和科学性，可以为定性评价和定量考察抗氧化衰老药物研究提供一种可靠的大鼠模型构建方法，具有高效、快速、全面、特异性强的优点，为抗氧化衰老药物新药研发提供代谢组学方法思路。

附图说明

图1是本发明实施例提供的关于一种基于代谢组学分析的用于抗氧化衰老药物筛选的大鼠模型的构建方法的试验方法流程图；

图2是本发明实施例提供的给药大鼠总离子流图；

图3是本发明实施例提供的正常对照组(蓝色)与D-型半乳糖致衰老大鼠模型组(红色)的PCA平面得分图；

图4是本发明实施例提供的正常对照组(蓝色)与D-型半乳糖致衰老大鼠模型组(红色)的PLS-DA平面得分图(a)及模型响应结果置换图(b)；

图5是本发明实施例提供的正常组，阳性对照组，模型组和鞣花酸给药组OPLS-DA平面得分图；

图6是本发明实施例提供的正常对照组，阳性对照组，模型组和鞣花酸给药组的OPLS-DA的VIP柱状图；

图7是本发明实施例提供的各组大鼠尿样中潜在生物标志物相对峰面积积分值比较示意图；

图8是本发明实施例提供的大鼠尿液中差异性代谢物相关性分析的热图

1.乳酸 2.丙酮酸 3.色氨酸 4.柠檬酸 5.肌酸 6.α-酮戊二酸 7.牛磺酸 8.丙氨酸 9.胆碱10.甘氨酸 11.植物鞘氨醇 12.甜菜碱；

图9是本发明实施例提供的使用MetPA数据库构建相关代谢通路图；

具体实施方式

通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。

图1示出了本发明提供的关于一种基于代谢组学分析的用于抗氧化衰老药物筛选的大鼠模型的构建方法的试验方法流程。为了便于说明，仅仅示出了与本发明相关部分。

【实施例1】将实验动物分成正常组(空白组)、模型组、阳性对照组、高剂量组、中剂量组和低剂量组，进行注射、灌胃处理并收集尿液样本

动物处理及样品收集的的具体方法为：将48只SD大鼠于SPF级环境中适应性饲养一周，随机分为6组，即空白对照组、模型组、阳性对照组、高剂量组、中剂量组和低剂量组，每组8只。模型组、阳性对照组及鞣花酸给药组按100mg·kg^-1·d^-1剂量颈部皮下注射D-型半乳糖溶液一次，在此基础之上，阳性对照组每天灌胃给予150mg·kg^-1的维生素E；高、中、低剂量的给药组分别灌胃给予150、100、50mg·kg-1·d^-1的鞣花酸；正常组与模型组则均给予同等体积的生理盐水。各组大鼠每天按同一时间给予灌胃一次，连续灌胃8周，每周收集各组大鼠24h尿液，直到实验结束。

【实施例2】制备尿液样本并获得LC-MS谱的数据

尿液样本的制备和LC-MS数据获取的具体方法为：用代谢笼收集6组大鼠尿液，于-70℃低温下储存，检测时，取尿样于冰上融化，在1.5×104r·min^-1，4℃下离心5min，取上清液0.5ml加入甲醇0.5ml，涡旋混匀，置4℃下静置3h，于3×104r·min^-1，离心10min，取上清液，经0.22μm微孔滤膜过滤后用于LC-MS分析。LC-MS条件，液相条件为PHENOMEX>-1，洗脱条件见表1；质谱条件为正离子模式毛细管电压4000V；雾化器压力为40psi；干燥气流速：10L·min^-1，干燥气温度：350℃，采用全扫描，质量扫描范围m/z>

【实施例3】采用统计学的方法，进行LC-MS数据处理与模式识别，寻找出鞣花酸对D-型半乳糖致衰老大鼠干预的尿液代谢组学生物标志物

采用MarkerView1.2.1软件对LC/ESI-MSn获得的原始质谱数据信息进行峰匹配、峰提取及数据导出等处理。将上述得到的数据导入SIMCIAP-12.0软件进行主成分分析。采用无监督模式识别的主成分分析法(PCA)、有监督模式识别的偏最小二乘法(PLS-DA)及正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)判别分析。通过得分图(Scores Plot)比较各组样本组间的差异，以R2X、R2Y、Q2等参数值来评价模型质量，其中R2X、R2Y越接近1表示模型越稳定，Q2>0.5表示预测率高。根据PLS-DA模型得到的变量权重值(VIP)，将VIP值大于1的变量作为生物标志物的候选变量，为了验证多维统计中找到的候选变量是否在单位统计上具有显著差别，实验中采用T检验，其中P<0.05有显著性差异。结合载荷图和筛选候选变量，通过这些变量所代表的化合物的质谱信息，在METLIN、HMDB、KEGG、PubChem等数据库中进行搜索、匹配和推测，最终确定可能的生物标志物。所有数据采用SPSS20.0统计分析软件进行处理，各组数据以(Mean±SD)表示，采用One-way ANOVA法来判别组间的差异性。

PCA分析是一种无监督的多元变量统计分析方法，可以从多维空间反应各组样本之间的代谢差异和组间样本差异，是原始数据最初呈现的一种基本原始状态。本实验取正常对照组与模型组大鼠的24h尿液样本进行PCA分析，结果如图3。在PCA得分图上正常组与模型组的样本点分散于不同的区域，两组大鼠代谢图谱具有明显差异趋势，说明本实验中的颈皮下注射D-型半乳糖的造模方法是可行的。正常组的样本点主要分布在第二、三象限且比较集中具有一定的聚类性，说明组内大鼠内源性代谢物差异性较小，代谢状态和变化趋势相对稳定；模型组样本点主要分布在第一、四象限且比较分散，与正常组大鼠样本点无明显的交叉和重叠，说明正常大鼠造模后，尿液中内源性代谢物发生了显著变化。

PLS-DA是一种有监督的多元变量统计分析方法，该方法与PCA相比，主要是在分析的过程中引入了一个新的变量(Y变量)，此变量具有分类信息，从而减少或删除组内差异对分类造成的干扰，其判别能力优于PCA分析。本实验使用SIMCIA-P12.0软件对正常组大鼠和模型组大鼠采用PLS-DA分析法从整体上进行了尿液代谢谱数据的模式识别，同时运用响应置换检验验证模型。PLS-DA分析的得分图和800次模型响应置换结果，如图4所示。图4正常组与模型组的PLS-DA模型相关参数为：R2Y＝0.764,Q2＝0.603，得分图中的R2值代表模型的解释能力，Q2值代表模型的预测能力,Q2>0.5说明模型预测能力较好，模型有效；Q2>0.9说明此模型效果突出。模型响应置换结果为：R2＝0.54，Q2＝－0.192，响应置换检验中的Q2<0则说明建模成功，没有出现过度拟合。本实验得分图中各组内的样本点也趋于集中，正常对照组与模型组之间分隔更远，且通过了响应置换检验，说明该模型的拟合度较好，进一步验证了本实验PLS-DA模型的构建是成功的。

正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)是PLS-DA的一种衍生运算分析方法，主要结合了正交矫正信号(OSC)和PLS两种方法，通过将X轴矩阵信息分解成与Y相关和不相关的两类信息，能够排除与分组不相关的一些变量，更准确的筛选出有价值的差异性变量从而使使判别能力更优。通过OPLS-DA分析过滤掉不相关的正交信号，结合差异性变量的重要性投影值(VIP)值，从而使获得的差异性代谢物更加可靠。本实验对正常组、模型组、阳性对照组、高剂量组、中剂量组和低剂量组大鼠进行了OPLS-DA分析，模型相关参数显示为：R2Y＝0.841，Q2＝0.732，均大于0.5，说明此模型构建成功，具有很好的拟合度和预测能力。从OPLS-DA得分图(如图5)中可以看出模型组、正常对照组、阳性对照组，鞣花酸给药组呈现出明显的区分。其中，阳性对照组最为接近正常对照组，这说明阳性药物使得病理大鼠的代谢恢复最接近于正常水平；鞣花酸高剂量组和低剂量组都不同程度的偏离模型组，而趋向正常对照组，高剂量组相较于中、低剂量组更为趋近阳性对照组和正常对照组，说明石鞣花酸也对病理大鼠的代谢产生了一定的影响，并使之趋向正常代谢。

通过上述模型的识别与分析，确定了本实验中6组大鼠尿液内源性代谢物存在显著的代谢差异，根据OPLS-DA分析中的VIP柱状图显示出各个变量的VIP值(如图6)，进行潜在生物标志物的筛选。OPLS-DA模型中评价变量的贡献程度一般用VIP值表示，VIP值越大，说明其贡献作用越大，由于变量的平均VIP值都接近于1，故常将VIP>1的变量视为对模型具重要意义。因此本实验将VIP值大于1的变量作为生物标志物的候选变量，最终筛选出了17个VIP值大于1的变量，结合载荷图和t检验筛选候选变量，通过这些变量所代表的化合物的质谱信息，从METLIN、HMDB、KEGG、PubChem等数据库中查找出12个潜在的生物标志物，见表2。

表2潜在的生物标志物

注：^＊表示与正常对照比较，¹⁾P<0.05>2)P<0.001；^＊＊表示与模型组比较，¹⁾P<0.05>2)P<0.001

本实验所确定了12个可能与D-型半乳糖致衰老有关的潜在生物标志物(见图7)。作为糖代谢的主要产物，模型组大鼠中丙酮酸(Pyruvic acid)、乳酸(Lactic acid)的浓度下降提示D-型半乳糖致衰老大鼠体内的糖代谢途径受到抑制，从定量分析水平结果分析来看，给药组大鼠体内这些代谢物的水平又逐渐回复到正常水平，表明鞣花酸的干预可以影响糖代谢途径，从而纠正其代谢紊乱的状况^[1]。

色氨酸(Tryptophan)是机体中的必需氨基酸，同时也是神经递质5-羟色胺的生物合成前体，本实验中模型组大鼠色氨酸含量较正常大鼠高P<0.05)，显示色氨酸代谢途径发生变化，而给药组尿液中色氨酸含量比模型组稍低(P<0.05)，表明色氨酸代谢逐渐回调，说明鞣花酸对D-型半乳糖致衰老大鼠尿液内源性代谢物具有调节作用^[2]。

代谢谱中的柠檬酸(Citric acid)和α-酮戊二酸(α-Ketoglutaric acid)则参与了三羧酸循环代谢通路。三羧酸循环是能量代谢的重要组成部分，更是糖、脂肪和氨基酸代谢的联系通路，糖、蛋白质、脂肪酸等大分子物质的生物氧化均与之相关；柠檬酸和α-酮戊二酸均是三羧酸循环过程中的主要中间参与物，研究结果显示柠檬酸和α-酮戊二酸在模型组中含量均是下降的，推测由于这两种物质的下降，组织能量代谢出现异常，能量供应不足，继而使衰老加重，而给予鞣花酸后其含量变化都趋近恢复正常，说明鞣花酸能够改善D-型半乳糖致衰老大鼠的能量代谢^[3]。

肌酸(Creatine)是一种含氮有机酸，能够辅助为肌肉和神经细胞提供能量，实验结果显示模型组大鼠肌酸含量较正常大鼠低(P<0.05)，说明衰老模型大鼠对肌酸利用增加，预示衰老大鼠能量代谢发生异常，但给予鞣花酸后其肌酸排泄量增加(P<0.05)，肌酸代谢逐渐恢复正常，说明大鼠在灌胃给药后衰老症状有所改善^[4]。

马尿酸(Hippuric acid)，也称苯甲酰氨基乙酸，主要由肠道菌群代谢所产生，因此肠道环境的变化可导致马尿酸含量发生差异。实验结果显示模型组较正常组马尿酸尿液代谢增加，在鞣花酸干预作用后马尿酸代谢逐渐回到正常水平，说明D-型半乳糖引发的衰老可能与之有关^[5]。牛磺酸(Taurine)是一种含巯基的非蛋白氨基酸，具有抑制脑组织局部脂质过氧化作用，对神经系统的抗衰老具有一定功效，而模型组大鼠尿液中牛磺酸的含量是下降的，说明牛磺酸的下降在D-型半乳糖诱发的衰老病变中起到重要作用^[6]。

甘氨酸(Glycine)为机体中的非必须氨基酸，一般可由葡萄糖转化而来，与对照组相比，模型组大鼠体内甘氨酸水平显著降低，说明模型组病变大鼠对葡萄糖的利用降低；而模型组大鼠丙氨酸(Alanine)水平显著升高则提示能量代谢异常^[7]。另外甘氨酸作为一种抑制性神经递质，通过线粒体膜上的甘氨酸裂解系统在体内代谢可代谢为乳酸，而给药组给予鞣花酸后甘氨酸含量较模型组上升回调，说明鞣花酸能通过干预甘氨酸延缓衰老^[8]。

胆碱(Choline)作为卵磷脂的组成成分，在机体中主要以磷脂酰胆碱的形式存在，在磷脂酰胆碱脂酶作用下生成胆碱，进一步转化为乙酰胆碱，乙酰胆碱在乙酰胆碱脂酶作用下进而分解生成胆碱，从而保持机体胆碱含量处于平衡状态^[9]。实验结果显示模型组大鼠胆碱含量较正常组显著降低，说明造模后大鼠胆碱平衡状态发生了变化，其机体对胆碱的利用需求增加。

甜菜碱(Betaine)是机体内主要的甲基供应体，造模后实验大鼠甜菜碱含量明显降低，推测其含量的减少与衰老大鼠体内存在低甲基化现象有关。从定量分析结果，发现鞣花酸处理后大鼠体内甜菜碱含量得到回升，说明这可能是鞣花酸能缓解D-型半乳糖致衰老的因素之一^[10]。

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【实施例4】运用代谢组学相关数据库和网络软件，构建生物标志物的代谢通路并进行分析

将前面已确定的尿液代谢谱(生物标志物)输入MetPA对话框中，选择Iuput(输入)标签中的compoud name(代谢产物名称)，点击Submit，选择物种：Mus musculus(mouse)，Hypergeometric Test(超几何分布检验)，Pathway Topology Analysis(通路拓扑结构分析)；采用Relative-betweeness Centrality(两中心相关)，然后注册进行通路模型分析。运用KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes；http://www.kegg.jp/)数据库进行信号通路分析，用HMDB(The Human Metabolome Database；http://www.hmdb.ca/)数据库对代谢产物分子注释、相关的酶或转运蛋白及其相关性质进行分析，Met PA网络软件(MetaboAnalyst3.0)对代谢产物路径进行可视化作图。

大鼠尿液中差异性代谢物相关性分析结果如图8所示，根据此图可以看出差异性代谢物之间的相关性。从横轴看，在同一小分支下的物质它们的正相关性最强，即某一个物质的量升高或者降低，则与之相关性强的物质会随之升高或降低。可以看出柠檬酸、牛磺酸、甘氨酸之间正相关性较强，而与乳酸、丙酮酸、植物鞘氨醇负相关性较强；肌酸和丙氨酸正相关性较强。以上结果提示，鞣花酸延缓衰老的作用机制有可能与多条代谢通路相关，且这些代谢物与代谢途径相互关联、相互影响。

将涉及的潜在生物标志物代入MetPA数据库中进行分析，构建代谢通路，可知D-型半乳糖致衰老模型大鼠涉及的代谢通路包括：三羧酸循环、氨酰tRNA生物合成、二元羧酸代谢、牛磺酸代谢、色氨酸等多种氨基酸代谢等一共17条(见表3和图9)。代谢通路影响值的临界值设置为0.1，高于这个值将被选择作为潜在的靶标路径。从图中可以看出三羧酸循环(TCA)、色氨酸代谢、丙酮酸代谢、二元羧酸及牛磺酸代谢等5条代谢途径在鞣花酸改善D-型半乳糖致衰老模型大鼠内源性代谢中起到重要作用。

表3通过MetPA得到的独特的通路分析结果

注：Total Cmpd：通路中化合物的总数；Hits；上传的标志物数据与代谢组库精确匹配的个数；

Raw P是通过通路分析得出的原始p值；Impact是通过拓扑分析得出的通路影响值

本发明采用以上技术方案，通过液质联用(LC-MS)技术对D-型半乳糖致衰老大鼠尿液进行代谢组学分析，通过PCA、PLS-DA、OPLS-DA等分析模式一共发现了12种与D-型半乳糖诱导致衰老相关的潜在生物标志物。通过相关数据和MetPA分析得到五条最可能的代谢相关通路，分别是三羧酸循环、色氨酸代谢、丙酮酸代谢、二元羧酸及牛磺酸代谢，说明这几种内源性物质与衰老机制联系较为紧密。这些内源性代谢产物在大鼠体内的含量变化从一定程度上反映了颈皮下注射D-型半乳糖构建的衰老大鼠体内代谢水平的变化，为监测疾病生理状态下体内代谢物的变化和衰老的预防和改善提供了一定依据。且迄今为止，未见代谢组学方法用于鞣花酸对D-型半乳糖致衰老大鼠干预的尿液代谢组学生物标志物的筛选及代谢通路的分析。本发明中D-型半乳糖致衰老大鼠在鞣花酸干预下其体内内源性代谢物聚类性趋近正常水平，对D-型半乳糖致衰老大鼠代谢紊乱有一定的恢复作用；同时运用代谢组学的方法探讨鞣花酸对D-型半乳糖致衰老大鼠内源性物质代谢的影响，从机体整体代谢水平研究鞣花酸对衰老的改善作用，为鞣花酸对D-型半乳糖致衰老模型大鼠作用机制的深入研究奠定了一定基础。

与以往的代谢组学方法相比，该方法更全面灵敏、系统综合的体现了造模前后机体的动态轮廓及相应代谢通路生物学信息之间的关联，综合地体现模型复制的合理性、科学性及药物干预后机体内源性物质代谢的规律性，可以为新药研发和药理研究提供一种可靠的试验方法，具有高效、快速、无创伤、特异性强的优点。