一种提高饲料中总纤维素酶活力检测准确性的方法

摘要

本发明公开了一种提高饲料中总纤维素酶活力检测准确性的方法，是在常规的纤维素酶检测方法基础上，对饲料进行除金属和除糖的预处理。具体是将粉碎的饲料与金属沉降剂投入缓冲液中进行提取，过滤后滤液中加入除糖剂反应，反应结束后过滤，得酶液；然后滤纸粉碎至棉花状，加入酶液37℃进行酶解反应，反应结束后加入DNS试剂，煮沸灭活酶，过滤，取滤液在540nm测其吸光度，与标准曲线对照得单糖浓度，按照特定公式计算得出酶活力。本发明的方法相较于现有检测方法，准确率大大提高，而且所需样品量少，重复性好，操作简单方便，有效改善了饲料中纤维素酶定量检测不准确的问题。

说明书

技术领域

本发明涉及纤维素酶检测技术领域，具体涉及一种饲料中总纤维素酶活力的方法。

背景技术

随着我国畜牧业的发展和生物技术的不断进步，饲用复合酶已广泛用于饲料工业中。由于酶制剂能够消除饲料中的某些抗营养因子的负面作用，提高饲料消化率，改善动物生产性能，降低生产成本，因此日益受到饲料界的重视。饲用复合酶种类繁多，大部分包含纤维素酶，目前饲料用纤维素酶检测方法有《NY/T 912-2004饲料添加剂纤维素酶活力测定》及《GB/T 23881-2009饲用纤维素酶活性的测定滤纸法》，前者是测体系中内切葡聚糖酶活性，后者是测总纤维素酶活性，但由于饲料成分较复杂，含有各种金属离子对酶制剂有激活或抑制作用、糖类及其他成分造成纤维素酶活性检测过程中背景值非常高，再加上纤维素酶本身添加量较少，导致饲料中纤维素酶活性检测值不准确。因此，需要一种提高灵敏度和准确性高的检测方法。

发明内容

为了解决现有技术中的上述问题，本发明提供了一种提高饲料中总纤维素酶活力检测准确性的方法。

研究发现，饲料中含有的一些金属离子及糖类会对纤维素酶的检测产生一定影响。农业部1224号公告中可添加到饲料中的常量元素和微量元素，部分元素对纤维素酶有激活作用，部分有抑制作用，不管是激活还是抑制，都会造成饲料中纤维素酶检测值与理论添加值间的差异，这种正向或反向的差异都会增加实测值与理论值的差异。饲料本身含有各种聚糖、寡糖及单糖，这些糖特别是具有还原性的单糖，比如葡萄糖在酶解过程中会与DNS试剂发生反应，造成检测背景值偏高，大幅降低检出限，使得饲料中纤维素酶较难检出。

因此，本发明通过沉降饲料中的金属元素，以及减少饲料原料中的糖类，主要是一些单糖，达到提高准确性的目的。

本发明提供的提高饲料中纤维素酶活力检测准确性的方法，是在常规的纤维素酶检测方法基础上，对饲料进行除金属和除糖的预处理，并优化酶解反应过程，包括优化底物形状、优化酶解反应体系中各参数比例。

其中，常规的纤维素酶检测方法是指在本发明申请日以前基于还原糖与DNS试剂反应显色原理的检测技术，例如可以参照NY/T 912-2004及GB/T 23881-2009等。

优选地，饲料预处理步骤为：将粉碎的饲料与金属沉降剂投入缓冲液中进行提取，过滤后滤液中加入除糖剂反应，反应结束后过滤，得酶液。

优选地，所述金属沉降剂为含二甲基二硫代氨基甲酸钠的复合螯合剂，能够沉降铬、镍、铜、锌、锰、镉、钒、铁、锡等多种金属离子，减少金属离子对酶活的影响。

优选地，所述除糖剂为一种毕赤酵母，能够分解利用掉可与DNS发生反应的单糖，大大降低背景噪音，提高检测准确性。

本发明还提供了一种提高饲料中总纤维素酶活力检测准确性的方法，包括以下步骤：

(1)处理酶液：将粉碎的饲料与金属沉降剂投入缓冲液中进行提取，过滤后滤液中加入除糖剂反应，反应结束后过滤，得酶液；

(2)酶活测定：滤纸粉碎，加入酶液37℃进行酶解反应，反应结束后加入DNS试剂，煮沸灭活酶，过滤，取滤液在540nm测其吸光度，与标准曲线对照得单糖浓度，按照以下公式(1)计算得出酶活力：

X＝A×l/0.5×n÷m＝(ax+b)×0.5×l/0.5×n÷m....(1)

式中：

X—样品中总纤维素酶活力，u/g(或u/mL)；

A—根据吸光度在标准曲线上查得或计算出的还原糖量，mg；

1/0.5—换算成酶液1ml；

n—酶样的稀释倍数；

m—称样量，g；

所述标准曲线由已知梯度浓度的葡萄糖与DNS试剂反应后在540nm测定吸光度值，每个葡萄糖浓度值对应一个吸光度值，形成标准曲线。

优选地，所述滤纸粉碎后还包括对其烘干的步骤，烘干条件为105℃烘干至恒重，含水量低于5％。对滤纸进行粉碎和烘干处理，大大提高了方法重现性。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明通过去除检测样品中的金属离子和糖，大大提高了检测准确性，通过对滤纸进行特殊的粉碎烘干处理，提高了重现性。使用本发明的检测方法，可以准确检测出饲料中含有的真实纤维素酶含量，检测误差远低于常规标准方法。

附图说明

图1为实施例1标准曲线图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

实施例1

1 试剂

除特殊说明外，所有的试剂均为分析纯，水均符合GB/T6682中规定的二级水。

1.1 DNS试剂

称取3，5-二硝基水杨酸3.15g，加水500mL在磁力搅拌器上加热搅拌，至45℃，然后逐步加入100mL氢氧化钠溶液，同时不断搅拌，直到溶液清澈透明(注意：在氢氧化钠加入的过程中，溶液温度不得低于45℃，不得高于48℃)，再逐步加入四水酒石酸钾钠91.0g，保持在46℃左右。直到全部溶解，加入苯酚2.5mL，再加入无水亚硫酸钠2.5g，保温45℃搅拌，直到加入物质完全溶解，停止加热，冷却至室温后，用水定容至1000mL。用滤纸过滤，取滤液储存在棕色瓶中，避光保存，室温下存放7d后可以使用，有效期为2个月。

1.2 乙酸-乙酸钠缓冲溶液0.1mol/L，pH值5.5，适用于饲用纤维素酶：

称取无水乙酸钠8.2g，用水溶解，再用冰乙酸调节pH至5.5，加水定容至1000ml，摇匀。

1.3 葡萄糖标准贮备溶液(10mg/mL)

称取于(103士2)℃下烘干至恒重的无水葡萄糖1g，精确至0.1mg，用水溶解并定容至100mL。

1.4 葡萄糖标准使用溶液

分别吸取葡萄糖标准贮备溶液0、0.125、0.25、0.5、1.00、1.50、2.00mL于10mL容量瓶中，用水定容至10mL，盖塞，摇匀备用。上述系列浓度应根据需要自行调整。

1.5 快速定性滤纸：杭州沃华滤纸有限公司，双圈定性滤纸，带Whatman^R标识，直径15cm。

2 仪器

2.1 分光光度计：能检测350～800nm的吸光度范围；

2.2 pH计：精确至0.01；

2.3 恒温水浴锅：温度控制范围在30～60℃之间，精确度为0.1℃；

2.4 分析天平：感量0.1mg；

2.5 磁力搅拌器；

2.6 秒表：每小时误差不超过5S；

2.7 电磁振荡器；

2.8 具塞刻度试管25mL；

2.9 移液器：精度为1μL。

2.10 粉碎机

3 绘制标准曲线

按表l规定的量，分别吸取葡萄糖标准使用溶液，缓冲溶液和DNS试剂于各管中混匀。

将标准管同时置于沸水浴中加热10min。取出，迅速冷却至室温，混匀。用10mm比色杯，在分光光度计波长540nm处测量吸光度。以葡萄糖量为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，获得线性回归方程。

表1葡萄糖标准曲线

4 样品的测定

4.1 样品前处理

将配合饲料样品粉碎通过0.45mm标准筛，称取5g于三角瓶中，称取0.2g金属沉降剂，用25mL缓冲液于20℃水浴摇床提取30min，静止过滤，取滤液9.9mL，加入0.1mL除糖剂，于20℃处理4h，过滤取滤液备用。

4.2 滤纸的制备

先将滤纸撕成小片，再用粉碎机粉碎成棉花状，粉碎后105℃烘箱烘2h至恒重，置于(硅胶)干燥器中待用，水分控制在5％以内。

4.3 测定步骤

取四支25mL刻度具塞试管，称取滤纸粉0.05g放入每支试管的底部，加入1.8ml缓冲液，使管内溶液浸没滤纸。于37℃水浴中预热5min，加入0.20mL酶液于三支样品管中，精确反应60min，向四支试管中加入DNS试剂2.5mL。再于空白管中补加酶液0.20ml。沸水煮沸10min，取出，冷却至室温，摇匀，四层纱布过滤，取滤液比色。

5 试样酶活力的计算

试样酶活力按式(l)计算：

X＝A×l/0.5×n÷m＝(ax+b)×0.5×l/0.5×n÷m....................(1)

式中：

X—样品的外切酶活力，u/g(或u/mL)；

A—根据吸光度在标准曲线上查得(或计算出)的还原糖量，mg；

1/0.5—换算成酶液1ml；

n—酶样的稀释倍数；

m—称样量，g。

6 允许差

同一试样两次测试结果的绝对差值，不得超过算术平均值的10％。

7 检测结果

7.1 标准曲线

标准曲线参见图1。

7.2 样品中纤维素酶检测结果

表2：不同方法检测饲料中总纤维素酶活性

备注：复合酶中含有纤维素酶，理论值根据复合酶中纤维素酶活性为1000U/g,添加量为300g/T进行计算所得。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。