一种潜在指纹中蛋白质成分的提取及显现方法

摘要

本发明公开了一种潜在指纹中蛋白质成分的提取及显现方法，属于痕量检测领域。将不同客体上残留的潜在指纹样本转移至SDS‑PAGE胶上；利用湿转方式将目标蛋白转移至PVDF膜；选择能够特异性识别目标蛋白的一抗与辣根过氧化物酶标记的二抗，利用抗体与目标蛋白的特异性反应，将辣根过氧化物酶连接到目标检测物上；进而利用化学发光显现出潜在指纹。本发明可以准确地提取潜在指纹中的蛋白质成分，同时可保留指纹的完整形貌，即具有成分识别和指纹显现双功能。本发明具有简单、高效、易操作的特点，对于潜在指纹中蛋白质类成分的分析和痕量潜在指纹的显现具有很好的应用前景。

说明书

一、技术领域

本发明涉及痕量检测领域，特别涉及一种潜在指纹中蛋白质成分的提取及显现方法。

二、背景技术

指纹鉴定是进行个人识别的最可靠的方法之一，目前警方利用刑事技术侦破的案件中，指纹识别占七成左右。指纹一度被司法界公认为“物证之首”。潜在指纹中包含着复杂的成分，如内源性的蛋白质、氨基酸、药物代谢物，以及外源性的爆炸物、违禁药物等。这些成分可以通过相应的抗体进行识别检测。充分、准确地了解潜在指纹的组成成分，不仅有助于人们选择合适的显现方法以达到成功识别指纹的目的，还能为研究者提供更多有价值的附加信息，如指纹的遗留时间、主人的性别、年龄甚至生活习惯等。

申请公布号为“CN 103543145 A”的中国发明专利公开了“基于化学发光酶联免疫分析的潜在指纹成像的方法”，该方法在指纹上直接加入手指代谢物的抗体溶液进行孵育，孵育完成后用缓冲液进行冲洗；将所述的指纹样本干燥，然后加入辣根过氧化物酶标记的二抗进行孵育；孵育后，用缓冲溶液冲洗指纹样本，干燥后将指纹样本置于化学发光反应底物溶液中，采集指纹图像。该方法虽然简单快速，但是该方法容易受杂质影响(如指纹中的油脂、灰尘)，存在非特异性吸附的问题。

蛋白质印迹法是蛋白质分析最成熟的技术之一。该方法主要利用抗原抗体的高特异性结合原理，通过信号放大作用，将基底的蛋白部分以图像的形式显现出来，方法直观、方便。本发明采用蛋白质印迹法提取潜在指纹中的蛋白质成分，可避免油脂、灰尘等杂质对检测结果的影响，提高检测结果的准确性。本发明为研究潜在指纹中的蛋白质成分提供了科学依据，并可有效地提高公安机关提取鉴别潜在指纹的工作效率。

三、发明内容

为了弥补现有技术的不足，解决现有技术中蛋白质成分提取难度大，后期检验鉴定困难的问题，本发明提供了一种潜在指纹中蛋白质成分的提取及显现方法。本发明方法简单、检测特异性好、发光强度高，可对指纹清晰显现。

本发明的技术方案为：

一种潜在指纹中蛋白质成分的提取及显现方法，包括步骤：

1)将客体上残留的潜在指纹样本转移至SDS-PAGE胶上；

2)将指纹样本上的目的蛋白转移至PVDF膜上；

3)将步骤2)处理后的PVDF膜浸入脱脂牛奶中封闭0.5-2h，然后清洗PVDF膜上过多的牛奶；

4)向步骤3)处理后的PVDF膜上滴加一抗溶液进行孵育，孵育完成后清洗过多抗体；

5)向步骤4)处理后的PVDF膜上滴加辣根过氧化物酶标记的二抗溶液进行孵育，孵育完成后清洗过多抗体；

6)向步骤5)处理后的PVDF膜上滴加显影液，暗箱中显影，得到清晰的指纹图像。

作为优选方案，步骤1)中所述基底为无孔玻璃基底或者多孔纸质基底。

作为优选方案，步骤1)中，SDS-PAGE胶的组成如下：4-5mL水、2-3mL 30％的丙烯酰胺、2-3mL浓度为1.5mol/L pH为8.8的Tris溶液、0.05-0.15mL 10％的SDS溶液、5-7μlTEMED。指纹中的蛋白质分子与SDS结合形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物，在电压作用下转移到PVDF膜上。

作为优选方案，步骤2)中采用湿转仪将目的蛋白转移至PVDF膜上。

进一步地，湿转时，设定电压110-130V，转移时间为20-40min。可以使蛋白质充分转移到PVDF膜上。

作为优选方案，步骤3)中脱脂牛奶的浓度为4-6％(w/v)。该浓度可以有效地结合PVDF膜上的非特异性吸附位点。

作为优选方案，步骤3)、4)、5)中清洗均采用TBST缓冲液清洗；所述TBST缓冲液为含0.05％Tween-20的TBS缓冲液，TBS缓冲溶液为0.1M Tris-HCl，pH为7.5，含0.15M NaCl。

作为优选方案，步骤4)中所述一抗溶液为兔抗人EGF、兔抗人溶菌酶、兔抗人皮离蛋白溶液中的任意一种，所述一抗溶液的浓度为0.01-0.03mg/mL。

作为优选方案，步骤5)中所述二抗溶液为辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG，所述二抗溶液的浓度为0.005-0.015mg/mL。

作为优选方案，步骤6)中所述显影液为pH为8.5的0.1M Tris-HCl含0.4-0.6mM鲁米诺、0.2-0.3mM对碘苯酚和2-5mM过氧化氢。

本发明方法实现了对潜在指纹的高灵敏检测，主要包括：将客体上残留的潜在指纹样本转移至SDS-PAGE胶上；利用湿转方式将目标蛋白转移至PVDF膜；选择特异性检测目标蛋白的一抗与辣根过氧化物酶标记的二抗，利用抗体与目标物的特异性反应，将辣根过氧化物酶连接到目标检测物上；增强化学发光底物在辣根过氧化物酶催化下产生化学发光，从而显现出指纹并可由此确定待测物的存在。

本发明的有益效果为：

1、本发明在添加检测试剂前预先提取潜在指纹中的蛋白质成分，特异性强，避免了非特异性吸附问题；

2、本发明使用PVDF膜作为蛋白质载体，蛋白质的附着力强；

3、本发明的检测方法使蛋白质信号放大，灵敏度高，且发光试剂造价低；

4、本发明操作简单，采用传统蛋白质印迹方法，可靠，稳定。

四、附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明潜在指纹中蛋白质成分的提取及显现方法检测潜在指纹示意图；

图2为实施例1潜在指纹中蛋白质成分的提取及显现方法检测潜在指纹的发光图像。

图3为实施例2潜在指纹中蛋白质成分的提取及显现方法检测潜在指纹的发光图像。

五、具体实施方式

实施例1

潜在指纹中蛋白质成分的提取及显现方法，包括：

1)将指纹按捺在无孔玻璃基底上；玻璃基底分别用无水乙醇，水超声清洗20min；

2)将基底上的指纹样本转移到8％的SDS-PAGE胶上；

8％的SDS-PAGE胶的配制如下：

水：4.6mL；30％的丙烯酰胺：2.7mL；1.5M Tris(pH 8.8)：2.5mL；10％的SDS：0.1mL；TEMED：6μl；

3)使用湿转仪，设定电压120V，转移时间30min，将SDS-PAGE胶上指纹样本的目的蛋白转移到PVDF膜上；

4)转移完成后，将PVDF膜浸入5％(w/v)的脱脂牛奶中封闭1h；

5)用TBST清洗膜上过多的牛奶，清洗3次，每次5min；

6)向步骤6)处理后的PVDF膜上滴加0.02mg/mL一抗(兔抗人EGF)，4℃过夜孵育一抗溶液进行孵育；

7)TBST清洗膜上过多的抗体，清洗3次，每次10min；

8)向步骤8)处理后的PVDF膜上滴加辣根过氧化物酶标记的二抗(羊抗兔IgG)常温孵育1h，二抗浓度为0.01mg/mL；

9)TBST清洗膜上过多的抗体，清洗3次，每次10min；

10)配制显影液(显影液为pH为8.5的0.1M Tris-HCl，含0.5mM鲁米诺、0.23mM对碘苯酚和3mM过氧化氢)，将其均匀滴到步骤10)处理后的PVDF膜上，暗箱中显影，得到清晰指纹图像。在辣根过氧化物酶的作用下，过氧化氢与鲁米诺反应产生波长为425nm的光，从而显现出指纹。

其中，步骤5)、7)、9)中的TBST为含0.05％Tween-20的TBS缓冲液，TBS缓冲溶液为0.1M Tris-HCl，pH为7.5，含0.15M NaCl。

本发明潜在指纹中蛋白质成分的提取及显现方法检测潜在指纹示意图如图1所示，选择特异性检测目标蛋白的一抗与辣根过氧化物酶标记的二抗，利用抗体与目标物的特异性反应，将辣根过氧化物酶连接到目标检测物上；增强化学发光底物在辣根过氧化物酶催化下产生化学发光，从而显现出指纹并可由此确定待测物的存在。

本实施例潜在指纹中蛋白质成分的提取及显现方法检测潜在指纹的发光图像如图2所示，可见本发明方法可获得的指纹图像，指纹纹线清晰。

实施例2

潜在指纹中蛋白质成分的提取及显现方法，包括：

1)将指纹按捺在多孔纸质基底(普通商品化A4纸)上；

2)将基底上的指纹样本转移到10％的SDS-PAGE胶上；

10％的SDS-PAGE胶的配制如下：

水：4.1mL；30％的丙烯酰胺：3.3mL；1.5M Tris(pH 8.8)：2.5mL；10％的SDS：0.1mL；TEMED：6μl；

3)使用湿转仪，设定电压110V，转移时间30min，将SDS-PAGE胶上指纹样本的目的蛋白转移到PVDF膜上；

4)转移完成后，将PVDF膜浸入4％(w/v)的脱脂牛奶中封闭1.5h；

5)用TBST清洗膜上过多的牛奶，清洗3次，每次5min；

6)向步骤6)处理后的PVDF膜上滴加0.03mg/ml一抗(兔抗人皮离蛋白)，4℃过夜孵育一抗溶液进行孵育；

7)TBST清洗膜上过多的抗体，清洗3次，每次10min，

8)向步骤8)处理后的PVDF膜上滴加辣根过氧化物酶标记的二抗(羊抗兔IgG)常温孵育1h，二抗浓度为0.02mg/mL；

9)TBST清洗膜上过多的抗体，清洗3次，每次10min；

10)配制显影液(显影液为pH为8.5的0.1M Tris-HCl含0.5mM鲁米诺、0.23mM对碘苯酚和2mM过氧化氢)，将其均匀滴到步骤10)处理后的PVDF膜上，暗箱中显影，得到清晰指纹图像。在辣根过氧化物酶的作用下，过氧化氢与鲁米诺反应产生波长为425nm的光，从而显现出指纹。

其中，步骤5)、7)、9)中的TBST为含0.05％Tween-20的TBS缓冲液，TBS缓冲溶液为0.1M Tris-HCl，pH为7.5，含0.15M NaCl。

实施例3

潜在指纹中蛋白质成分的提取及显现方法，包括：

1)将指纹按捺在多孔纸质基底(普通商品化A4纸)上；

2)将基底上的指纹样本转移到10％的SDS-PAGE胶上；

10％的SDS-PAGE胶的配制如下：

水：4.1mL；30％的丙烯酰胺：3.3mL；1.5M Tris(pH 8.8)：2.5mL；10％的SDS：0.1mL；TEMED：6μl；

3)使用湿转仪，设定电压110V，转移时间30min，将SDS-PAGE胶上指纹样本的目的蛋白转移到PVDF膜上；

4)转移完成后，将PVDF膜浸入4％(w/v)的脱脂牛奶中封闭1.5h；

5)用TBST清洗膜上过多的牛奶，清洗3次，每次5min；

6)向步骤6)处理后的PVDF膜上滴加0.03mg/ml一抗(兔抗人溶菌酶)，4℃过夜孵育一抗溶液进行孵育；

7)TBST清洗膜上过多的抗体，清洗3次，每次10min，

8)向步骤8)处理后的PVDF膜上滴加辣根过氧化物酶标记的二抗(羊抗兔IgG)常温孵育1h，二抗浓度为0.02mg/mL；

9)TBST清洗膜上过多的抗体，清洗3次，每次10min；

10)配制显影液(显影液为pH为8.5的0.1M Tris-HCl含0.5mM鲁米诺、0.23mM对碘苯酚和2mM过氧化氢)，将其均匀滴到步骤10)处理后的PVDF膜上，暗箱中显影，得到清晰指纹图像。在辣根过氧化物酶的作用下，过氧化氢与鲁米诺反应产生波长为425nm的光，从而显现出指纹。

其中，步骤5)、7)、9)中的TBST为含0.05％Tween-20的TBS缓冲液，TBS缓冲溶液为0.1M Tris-HCl，pH为7.5，含0.15M NaCl。